Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Luciferase-Reporterzelllinien und die anschließende Überwachung zellautonomer circadianer Rhythmen der Biolumineszenzexpression. Zunächst werden lentivirale Luciferase-Expressionsreporter konstruiert und lentivirale Partikel hergestellt, um dann die Zellen des Interesses zu infizieren und ausgewählte Kulturen zu amplifizieren. Anschließend wird die Biolumineszenzexpression in synchronisierten Reporterzellen mittels eines geeigneten Aufnahmegeräts überwacht.

Schließlich wird die Biolumineszenzaufzeichnung verwendet, um zellautonome circadiane Rhythmen nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der transienten Transfektion und der Keimbahntransformation besteht darin, dass die Integration virusvermittelt erfolgt. Das Gen ermöglicht eine stabile Integration in das Zellgenom sowie eine höhere Effizienz und Vielseitigkeit.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Forschung zu circadianen Uhren zu beantworten. Zum Beispiel: Gibt es gewebespezifische circadiane Uhren? Wenn ja, welche Eigenschaften haben gewebespezifische circadiane Uhren?

Obwohl diese Methode Einblicke in Uhrmechanismen ermöglichen kann. Kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise die Dynamik des Zellzyklus, die Tumorgenese, et cetera. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir beschlossen, gewebe- oder zelltypspezifische Sicherungsuhrwerke zu untersuchen.

Den Vorgang werden Dr. Chita Norm Napkin, eine Postdoktorandin, und Sandra, eine Doktorandin aus meinem Labor Atory, demonstrieren. Ein typischer mammalianischer Circadian-Reporter-Konstrukt enthält eine Expressionskassette, in der ein circadianer Promotor mit dem Luciferase-Gen fusioniert ist. Bei diesem lentiviralen Reporter steht die destabilisierte Luciferase unter der Kontrolle des Maus-per2-Promotors.

Für detaillierte Anweisungen zur Konstruktion von Reportervektoren mittels Rekombinationsreaktion siehe die begleitende Veröffentlichung für eine effiziente Transfektion. Beginnen Sie mit einer Kultur menschlicher embryonaler Nierenzellen mit geringer Passagezahl, die zu 90 bis 100 % konfluent sind. Nun sechs Vertiefungen in einer Zellkulturplatte beschichten.

Fügen Sie für die Transfektion je ein Milliliter einer 0,001 %igen Poly-L-Lysin-Lösung hinzu, inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur und spülen Sie einmal mit PBS. Anschließend gewinnen Sie die Zellen mittels Trypsin und säen Sie auf die jeweiligen Vertiefungen der vorbeschichteten Platten aus. Schwenken Sie die Platten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erzielen.

Überprüfen Sie, ob die ausgesäten Zellen in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht haben. Bereiten Sie die Plasmid-Transfektionsmischung aus einem lentiviralen Reportergekonstrukt, DNA und den drei Verpackungsvektoren als Kontrolle sowohl für die Transfektion als auch für die anschließende Infektion vor. Fügen Sie eine zusätzliche Vertiefung für einen lentiviralen GFP-Expressionsvektor hinzu, der das verbesserte grün fluoreszierende Protein unter Kontrolle des CMV-Promotors enthält.

Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter einer 0,25-molaren Calciumchloridlösung zu den Plasmiden hinzu und mischen Sie gründlich. Dann geben Sie 100 Mikroliter zweifacher XBBS-Lösung hinzu und mischen vorsichtig, aber gründlich. Inkubieren Sie die DNA-Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Währenddessen ersetzen Sie das Medium der 2 9 3 T-Zellen durch zwei Milliliter frisches Medium. Stellen Sie die Platte für mindestens 10 Minuten in den Inkubator, um den pH-Wert des Mediums auszugleichen. Fügen Sie anschließend die Transfektionsmischung tropfenweise zu den Zellen hinzu, schwenken Sie die Platte vorsichtig, beobachten Sie die Partikelbildung unter dem Mikroskop und stellen Sie die Zellen dann über Nacht in den Inkubator.

Ungefähr 16 Stunden nach der Transfektion das Medium durch zwei Milliliter frisches DMEM ersetzen und über Nacht kultivieren. Danach die Transfektionseffizienz bewerten, indem die EGFP-Expression in den Transfektionskontrollzellen analysiert wird. Eine Transfektionseffizienz von 90 bis 100 % mit starker EGFP-Expression ist ein zuverlässiger Indikator für eine gute Viruspräparation.

Das Medium, das sekretierte infektiöse Viruspartikel enthält, abzentrifugieren, um die verbleibenden 293T-Zellen zu entfernen, und den virushaltigen Überstand sammeln. Am dritten Tag etwa 12.000 293T-Zellen in einer 12-Loch-Platte ansäen, über Nacht kultivieren, bis eine Konfluenz von 20 bis 30 % erreicht ist, und die Zellen am vierten Tag beobachten. Noch am vierten Tag Polybrene zum gesammelten Medium mit den Viruspartikeln hinzufügen und durch Pipettieren gut mischen.

Aspirieren Sie nun das Medium aus den drei T-Zellen und geben Sie je nach Vertiefung ein Milliliter Virusmischung hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nachdem die Zellen einmal mit PBS gewaschen wurden, erneuern Sie das Medium und inkubieren die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius zur Regeneration und zum Wachstum. Wenn die Zellen konfluent sind, teilen Sie sie am folgenden Tag auf und kultivieren Sie sie über Nacht weiter.

Um die Selektion infizierter Zellen zu beginnen, frisches Medium mit 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen. Blastic aside, muss die Konzentration der Blasticsäure im Kill-Car empirisch für jede Zelllinie bestimmt werden. Das Medium mit Blastic alle zwei bis drei Tage erneuern, um eine kontinuierliche Selektion antibiotikaresistenter Zellen zu gewährleisten.

Expression von Clock-Reportern. Nachdem die Blastin-resistenten Reporterzellen in 35-Millimeter-Kulturschalen bis zur Konfluenz ausgetoxt wurden, bereiten wir normalerweise drei oder mehr Schalen für jede Reporterzelllinie unter jeder Bedingung für das Sarcy-Phänotyp vor. Nach einer Wäsche mit PBS geben wir DMEM mit 10 Mikromolar Forskolin oder 200 Nanomolar Dexamethason hinzu und inkubieren bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um die Zellen zu synchronisieren.

Bringen Sie die Zellen nun in frisch hergestelltes Aufzeichnungsmedium. Bedecken Sie die Kulturschalen mit sterilen 40-Millimeter-Deckgläsern und verschließen Sie diese mit Vakuumfett, um Verdunstung zu verhindern. Platzieren Sie die Schalen auf dem Lumous-Cycle-Luminometer und starten Sie die Echtzeit-Biolumineszenz.

Aufnahme Für die Aufnahme einer 96er Altplatte. Mit dem GSR zwei Aufnahmegeräte, siehe begleitende Manuskript. Wir nehmen den Rhythmus problemlos fünf bis sieben Tage lang im Lum-Cycle-Analyseprogramm auf.

Zunächst werden die Rohdaten mit einer Basislinie angepasst. Anschließend werden die von der Basislinie subtrahierten Daten mit einer Sinuskurve gefittet, um die erforderlichen Parameter für Proben mit anhaltenden Rhythmen zu bestimmen. Eine Güte der Anpassung von über 90 % wird aufgrund der hohen transienten Lumineszenz leicht erreicht.

Sinnvoll nach oben und Medium wechseln. Wir schließen normalerweise den ersten Zyklus der Daten aus unserer Analyse für die Datendarstellung aus. Zeichnen Sie gegebenenfalls die Rohdaten über die Zeit auf.

Tragen Sie die baseline-korrigierten Daten auf, um Amplitude und Phase sowohl bei der transienten Transfektion von 293T-Zellen als auch bei der Infektion von Zelllinien zu vergleichen. Fluoreszenzbilder der transfizierten und transduzierten GFP-exprimierenden Zellen zeigen, dass das lentivirale Gentransfersystem äußerst effizient ist. Die zentrale Rückkopplungsschleife einer circadianen Uhr besteht aus transkriptionellen Faktoren, die auf circadiane Enhancerelemente wirken, um rhythmische Genexpression hervorzurufen.

Hier erzeugen vier verschiedene Reporterkonstrukte in drei T-drei-Zellen unterschiedliche Phasen der Reporterexpression. Mithilfe kombinatorischer Regulation durch mehrere circadiane Elemente können neue Zwischenphasen generiert werden, wobei Gen-Knockdown mittels RNAi und pharmakologisch aktive Verbindungen eingesetzt werden. In diesem Experiment wurde der Lum-Cycle-Luminometer zur Biolumineszenzaufzeichnung von Zellen in 35-Millimeter-Schalen in U2-OS-Zellen verwendet.

Irna wurde verwendet, um die Knockdown-Effekte der cry1- und cry2-Gene zu untersuchen. Hier wurde ein Synergy-Luminometer zur Biolumineszenzaufzeichnung von Zellen in einer 96-Well-Platte mit drei T3-Reportezellen verwendet.

RNA wurde verwendet, um die Auswirkungen einer Triun-Abschaltung auf zelluläre Rhythmen zu bewerten. In diesem Beispiel wurden das UX-System und ein TECAN-Luminometer für die Biolumineszenzaufzeichnung von Zellen in 3 84 verwendet. Während Platten wie angegeben ausgewählt wurden, können kleine Moleküle pharmakologisch die Proteinfunktion in zellulären Rhythmen von U2-OS-Reporterzellen gezielt beeinflussen und stören.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forschung im Bereich der Chronobiologie, um Uhrmechanismen und die Physiologie in verschiedenen Zell- und Gewebetypen zu untersuchen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Luciferase-Reportergen-Zelllinien erzeugt und die Lumineszenzsignale überwacht.

Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem VIR äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie persönlicher Schutz und virale Dekontamination sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.