Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Dieses Protokoll beschreibt die Generierung von Luciferase-Reporterzelllinien und die anschließende Überwachung der zellautonomen zirkadianen Rhythmen der Biolumineszenzexpression. Konstruieren Sie zunächst lentivirale Luciferase-Expressionsreporter und produzieren Sie lentivirale Partikel, um die interessierenden Zellen zu infizieren und ausgewählte Kulturen zu amplifizieren. Überwachen Sie dann die Biolumineszenzexpression in synchronisierten Reporterzellen mit einem geeigneten Aufzeichnungsgerät.

Letztendlich wird die Biolumineszenzaufzeichnung verwendet, um zellautonome zirkadiane Rhythmen zu demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der transienten Transfektion und dem Keimbahnschutz besteht darin, dass VIR vermittelt wird. Das Gen sorgt für eine stabile Integration in das Zellgenom sowie für eine höhere Effizienz und Vielseitigkeit.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Uhrenforschung zu beantworten. Gibt es zum Beispiel gewebespezifische zirkadiane Uhren? Wenn ja, was sind die Eigenschaften von gewebespezifischen zirkadianen Uhren?

Diese Methode kann jedoch Einblicke in Uhrmechanismen geben. Es kann auch auf andere Systeme wie die Dynamik des Zellzyklus, die Tumorgenese usw. angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir beschlossen, gewebe- oder zelltypspezifische Sicherungsuhren zu untersuchen.

Das Verfahren wird von Dr. Chita Norm Napkin, einer Postdoc-Stipendiatin, und Sandra, einer Doktorandin aus meinem Labor Atory, demonstriert. Typischerweise enthält ein zirkadianes Reporterkonstrukt bei Säugetieren eine Expressionskassette, in der ein zirkadianer Promotor mit dem Luciferase-Gen fusioniert ist. In diesem lentiviralen Reporter steht die destabilisierte Luciferase unter der Kontrolle der Maus pro zwei Promotoren.

Detaillierte Anweisungen zur Konstruktion von Reportervektoren durch Rekombinationsreaktion finden Sie im begleitenden Manuskript für eine effiziente Transfektion. Beginnen Sie mit einer Kultur von humanen embryonalen Nierenzellen mit geringer Durchgangszahl, die zu 90 bis 100 % konfluent sind. Nun zum Beschichten von sechs gut kultivierten Platten.

Für die Transfektion fügen Sie jeweils einen Milliliter 0,001%Poly L Lycin hinzu, inkubieren Sie es gut bei Raumtemperatur für 20 Minuten und spülen Sie es einmal mit PBS aus. Ernten Sie anschließend die Zellen mit Trypsin und säen Sie die Zellen auf jede Vertiefung der vorbeschichteten Platten. Schwenken Sie die Platten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erhalten.

Stellen Sie sicher, dass die ausgesäten Zellen einen Zusammenfluss von 80 bis 90 % in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen erreicht haben. Bereiten Sie die Plasmidtransfektionsmischung aus einem lentiviralen Reporterplasmid, DNA und den drei Verpackungsvektoren als Kontrolle sowohl für die Transfektion als auch für die nachfolgende Infektion vor. Fügen Sie eine zusätzliche Vertiefung für einen lentiviralen GFP-Expressionsvektor hinzu, der das verstärkte grün fluoreszierende Protein unter der Kontrolle des CMV-Promotors beherbergt.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter 0,25 molare Calciumchlorid zu den Plasmiden und mischen Sie sie gründlich. Dann 100 Mikroliter von zwei XBBS-Lösungen hinzufügen und sanft, aber gründlich mischen. Inkubieren Sie den DNA-Mix 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Ersetzen Sie während des Wartens das Medium aus den 2 9 3 T-Zellen durch zwei Milliliter frisches Medium. Stellen Sie die Platte für mindestens 10 Minuten wieder in den Inkubator, um den mittleren pH-Wert auszugleichen. Geben Sie dann tropfenweise die Transfektionsmischung zu den Zellen, schwenken Sie die Platte vorsichtig, beobachten Sie die Partikelbildung unter einem Mikroskop und legen Sie die Zellen dann über Nacht in einen Inkubator.

Etwa 16 Stunden nach der Transfektion füllen Sie das Medium mit zwei Millilitern frischem DMEM auf und kulturieren Sie es über Nacht. Um die Transfektionseffizienz zu beurteilen, wird als Nächstes die EGFP-Expression in den Transfektionskontrollzellen bewertet. Eine Transfektionseffizienz von 90 bis 100 % bei hoher EGFP-Expression ist ein zuverlässiger Prädiktor für eine gute Virusvorbereitung.

Das Medium mit sezernierten infektiösen Viruspartikeln wird entnommen, zentrifugiert, um die verbleibenden 2 9 3 T-Zellen zu entfernen und das Supernat enthaltende Virus zu sammeln. Am dritten Tag säen etwa 12.003 T drei Zellen auf einer 12-Well-Plattenkultur über Nacht auf 20 bis 30 % Co-Flüssigkeit und beobachten Sie die Zellen am vierten Tag. Geben Sie noch am vierten Tag Poly Brain zu dem gesammelten Medium, das Viruspartikel enthält, und mischen Sie es gut durch Pipettieren.

Aspirieren Sie nun das Medium aus den drei T-Drei-Zellen und fügen Sie pro Vertiefung einen Milliliter Virusgemisch hinzu. Nach dem einmaligen Waschen der Zellen mit PBS über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert, das Medium wieder auffüllen und die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren, um sich zu erholen und zu wachsen. Wenn sie zusammenfließen, spalten Sie die Zellen und kultivieren sie über Nacht am nächsten Tag.

Um mit der Selektion infizierter Zellen zu beginnen, fügen Sie frisches Medium mit 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Abgesehen von der Blastik muss die Blastensäure im Kill Car für jede Zelllinie empirisch bestimmt werden. Füllen Sie das blastinhaltige Medium alle zwei bis drei Tage auf, um eine kontinuierliche Selektion antibiotikaresistenter Zellen zu ermöglichen.

Ausdrücken von Uhrreportern. Nach der Vermehrung der Blastin-resistenten Reporterzellen in 35-Millimeter-Kulturschalen bis zur Konfluentität bereiten wir in der Regel drei oder mehr Schalen für jede Reporterzelllinie unter jeder Bedingung für den Sarcy-Phänotyp zu. Nach einer Wäsche mit PBS fügen Sie DMEM mit 10 mikromolaren Forlinen oder 200 nanomolaren Dexamethason hinzu, das eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wurde, um die Zellen zu synchronisieren.

Legen Sie nun die Zellen in ein frisch hergestelltes Aufnahmemedium. Decken Sie die Kulturschalen mit 40 Millimeter sterilen Deckgläsern ab und verschließen Sie sie mit Vakuumfett, um eine Verdunstung zu verhindern. Laden Sie die Schalen auf das Luminometer des Lumiöszyklus und starten Sie die Echtzeit-Biolumineszenz.

Aufnahme Zur Aufnahme von 96 alten Platten. Mit dem GSR zwei Aufnahmegeräte siehe Begleithandschrift. Den Rhythmus zeichnen wir problemlos für fünf bis sieben Tage im Luma-Zyklus-Analyseprogramm auf.

Erste Baseline-Anpassung der Rohdaten. Verwenden Sie dann die subtrahierten Basisdaten, um sie an eine Sinuswelle anzupassen und die erforderlichen Parameter für Stichproben zu bestimmen, die anhaltende Rhythmen aufweisen. Eine Güte von Daten von mehr als 90% wird aufgrund des hohen transienten Luminat-Gehalts leicht erreicht.

Spüren Sie nach oben und mittlere Veränderung. Für die Datendarstellung schließen wir in der Regel den ersten Zyklus von Daten aus unserer Analyse aus. Plotten Sie Rohdaten bei Bedarf gegen die Zeit.

Plotten Sie die subtrahierten Ausgangsdaten, um Amplitude und Phase sowohl bei der transienten Transfektion von 2 9 3 T-Zellen als auch bei der Infektion von Zelllinien zu vergleichen. Fluoreszierende Bilder der transfizierten und transduzierten GFP-exprimierenden Zellen deuten darauf hin, dass das lentivirale vermittelte Gentransfersystem hocheffizient ist. Die zentrale Rückkopplungsschleife einer zirkadianen Uhr besteht aus transkriptionellen Faktoren, die auf die zirkadianen Enhancer-Elemente einwirken, um eine rhythmische Genexpression zu erzeugen.

Hier erzeugen vier verschiedene Reporterkonstrukte in drei T-3-Zellen unterschiedliche Phasen der Reporterexpression. Neuartige Zwischenphasen können mit kombinatorischer Regulation durch mehrere zirkadiane Elemente mittels Gen-Knockdown über RNAi und pharmakologisch aktive Verbindungen erzeugt werden. In diesem Experiment wurde das Lum-Zyklus-Luminometer für die Biolumineszenzaufzeichnung von Zellen in 35-Millimeter-Schüsseln in U2-OS-Zellen verwendet.

Irna wurde verwendet, um die Knockdown-Effekte der Gene Cry one und Cry two zu beleuchten. Hier wurde ein Synergie-Luminometer zur Biolumineszenzaufzeichnung von Zellen eingesetzt. In einer 96-Well-Platte in drei T-Drei-Reporterzellen.

RNAs wurden verwendet, um die Auswirkungen des dreieinigen Knockdowns auf den zellulären Rhythmus zu bewerten. In diesem Beispiel wurden das UX-System und ein Tecan-Luminometer für die Biolumineszenzaufzeichnung von Zellen in 3 84 verwendet. Während die Platten, wie angegeben, selektiert sind, können kleine Moleküle pharmakologisch auf die Proteinfunktion in den zellulären Rhythmen der U2-OS-Reporterzellen abzielen und diese stören.

Nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für die Forschung auf dem Gebiet der zirkadianen Biologie, um Uhrmechanismen und Physiologie in verschiedenen Zell- und Gewebetypen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollte es ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Luzifer generiert, Zelllinien meldet und die Volumina überwacht.

Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem VIR extrem gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. persönliche Schutzmaßnahmen und Virusdekontamination, immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.