Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, dünne Gewebeschnitte aus der Netzhaut des aquatischen Tigersalamanders herzustellen und sie für gleichzeitige Ganzzellspannungs-Clamp-Aufzeichnungen von Photorezeptoren und horizontalen und bipolaren Zellen zweiter Ordnung zu verwenden. Dazu wird zunächst ein Salamandarge präpariert und die Netzhaut auf einem Stück Nitrozellulosemembran isoliert. Der zweite Schritt besteht darin, dünne Scheiben der Netzhaut zu schneiden und in der Aufnahmekammer zu positionieren.

Als nächstes wird die Kammer auf ein aufrechtes Festtischmikroskop gestellt und Patch-Pipetten werden über den Netzhautscheiben positioniert. Der letzte Schritt besteht darin, Ganzzellaufnahmen von einer präsynaptischen, Photorezeptor- und postsynaptischen horizontalen oder bipolaren Zelle zu erhalten. Letztendlich können gepaarte Ganzzellaufzeichnungen verwendet werden, um die synaptische Freisetzung zu manipulieren und die Wechselwirkungen zwischen Zellen in der Netzhaut zu untersuchen.

Die Netzhautschnittpräparation wurde ursprünglich in den Laboratorien von Frank Werblin und Sam Wu entwickelt. Im Gegensatz zu Einzelzellpräparaten behielten Schnittpräparate einen intakten Kontakt bei, und im Gegensatz zu Ganzkopf-Netzhautpräparaten legten die Netzhautschnitte verschiedene Netzhautschichten frei, was einen einfachen Zugang zu allen verschiedenen Zelltypen ermöglicht. In die Netzhaut schneiden. Präparate können für elektrophysiologische Aufzeichnungen, einschließlich gleichzeitiger Aufzeichnungen für mehrere Zellen und für bildgebende Experimente, verwendet werden.

Dieses Präparat hat sich als äußerst wertvoll für die Untersuchung synaptischer Interaktionen zwischen retinalen Neuronen erwiesen. In diesem Video beschreiben wir die Vorbereitung von Schnitten mit der Netzhaut des Tigersalamanders und betonen einige der kleinen Details, die den Unterschied zwischen Erfolg und Misserfolg ausmachen können. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Kammer zusammenbauen.

Platzieren Sie zwei Kügelchen mit Vakuumfett im Abstand von acht bis 10 Millimetern in der Aufnahmekammer, um einen Kanal für die Superfasse zu bilden und die Retinolscheiben bei einem zweiten Fettschlag einzubetten, einige Millimeter hinter jeder dieser beiden Fettkügelchen, um als Abgabe zu fungieren und das Überlaufen zu begrenzen. Legen Sie dann ein kleines dreieckiges Stück Kim-Tuch an das Ende der Kammer, um den Flüssigkeitskontakt mit der Referenzelektrode zu gewährleisten. Drücken Sie danach ein Stück Nitrozellulosemembran flach gegen das Glasmikroskop.

Schieben Sie es auf zwei kleine Kügelchen Vakuumfett. Zur Vorbereitung des Tissue-Slicers. Brechen Sie eine zweischneidige Rasierklinge in vier Stücke.

Befestigen Sie dann einen davon am Schneidearm. Stellen Sie sicher, dass die Schneide der Rasierklinge flach auf der Aufnahmekammer anliegt, indem Sie eine dünne Scheibe Nitrozellulose-Filterpapier abschneiden. Nachdem Sie einen Salamander durch Enthauptung eingeschläfert haben, keimen Sie das Auge mit einer kleinen Venice-Schere unter dem Mikroskop und schneiden Sie die Haut, die das Auge mit der umgebenden Augenhöhle verbindet.

Ziehe dann das Auge nach vorne und schiebe die Schere darunter, um die Augenmuskeln und den Sehnerv zu durchtrennen. Legen Sie anschließend das entkernte Auge auf ein Bett aus Baumwolle auf einem Linoleumblock. Machen Sie nun mit einer scharfen chirurgischen Klinge einen kleinen Schnitt in der Mitte der Hornhaut.

Entfernen Sie die Hornhaut, indem Sie die feine Venedig-Schere in den Schnitt schieben und den Schnitt radial in Richtung Aura Serrata verlängern. Schneide dann umlaufend um die Aura serrata herum, indem du den Linoleumblock oder die Watte zwischen den Schnitten drehst. Nachdem du ganz um das Auge herum geschnitten hast, entferne die Hornhaut und die Linse, indem du sie seitlich aus der Augenmuschel herausziehst.

Übertragen Sie die restliche Augenmuschel auf eine harte Oberfläche des Linoleumblocks, die mit Amphibienkochsalzlösung angefeuchtet ist. Schneiden Sie es mit einer scharfen Rasierklinge in feinen Sägebewegungen in Drittel, damit es die Sklera vollständig durchschneidet. Legen Sie dann ein oder zwei Stücke IUP mit der Netzhautoberfläche nach unten auf die Nitrozellulosemembran

Tauchen Sie die restlichen Stücke mit zusätzlicher Kochsalzlösung ein. Legen Sie sie danach in den Kühlschrank, falls später weitere Scheiben geschnitten werden. Drücken Sie nun das Stück IUP mit einer feinen Pinzette vorsichtig gegen die Nitrozellulosemembran.

Tauchen Sie die Nitrozellulosemembran und das IUP-Stück mit einigen Tropfen kalter Amphibiensalzlösung ein. Lassen Sie dann die Kochsalzlösung ab, indem Sie ein Stück Kim-Tuch an den Rändern der Nitrozellulosemembran berühren und iup. Tauchen Sie danach das IUP mit mehreren Tropfen kalter Amphibien-Kochsalzlösung in eine Nitrozellulosemembran ein.

Auch hier wird anschließend das Pigmentepithel der Sklera-Aderhaut der Netzhaut abgezogen, um die Netzhaut zu isolieren. Wenn die Netzhaut nicht fest gehaftet hat, lassen Sie die Kochsalzlösung mit einem Kim-Tuch abtropfen. Um die Netzhaut fester auf die Nitrozellulosemembran zu ziehen, tauschen Sie die Kochsalzlösung aus und wiederholen Sie den Vorgang gegebenenfalls.

Füllen Sie anschließend die Kammer mit kalter Amphibiensalzlösung. Übertragen Sie es auf die Bühne des Tissue Slicers. Schneiden Sie dann die Netzhaut und die Nitrozellulosemembran in 125 Mikrometer dünne Streifen, indem Sie die Rasierklinge sanft, aber fest durchdrücken.

Nachdem Sie die gesamte Netzhaut in Scheiben geschnitten haben, übertragen Sie die Netzhautscheiben nacheinander in den Hauptkanal der Aufnahmekammer. Um eine Scheibe zu übertragen, halten Sie einen Membranstreifen an Ort und Stelle, während Sie die Kammer darunter schieben. Achten Sie darauf, dass die Scheibe untergetaucht ist, wenn sie sich über dem mittleren Teil der Kammer befindet.

Betten Sie die Ränder der Nitrozellulosemembran in die Streifen aus Vakuumfett ein und drehen Sie sie um 90 Grad. Um die Netzhautschichten zu betrachten, drücken Sie die Nitrozellulosemembran flach gegen die Glasoberfläche, auch wenn nicht auf jedem Stück Netzhaut vorhanden ist. Platzieren Sie Streifen der Nitrozellulosemembran in regelmäßigen Abständen von etwa Millimetern, um die Oberflächenspannung aufzubrechen und dadurch die Flüssigkeitsströmung zu verbessern.

Übertragen Sie die Scheiben nacheinander, bis die Scheiben über die gesamte Länge des Perfusionskanals platziert wurden. Nachdem alle Scheiben übertragen wurden, stellen Sie die Aufnahmekammer auf den Tisch eines aufrecht stehenden Mikroskops mit festem Tisch. Verbinden Sie das Referenzelektrodenkabel mit einem Erdungskabel am Verstärkerkopftisch.

Fokussieren Sie die Scheiben mit einem 40- bis 60-fachen Wasserimmersionsobjektiv mit großem Arbeitsabstand. Nächster Super. Schmelzen Sie die Scheiben mit einer Geschwindigkeit von einem Millimeter pro Minute mit amphibischer Kochsalzlösung, die mit Sauerstoff gesprudelt ist.

Verbinden Sie die Saugleitung mit der Ausgangsleitung der Kammer. Stellen Sie dann den Ausfluss ein, um den Zufluss auszugleichen, indem Sie das abgeschrägte Ende der Saugnadel drehen oder indem Sie das Kim-Tuch am Ende der Kammer näher oder weiter von der Öffnung an der Spitze der Ausflussnadel weg bewegen. Untersuchen Sie die Scheiben unter schwachem oder infrarotem Licht.

Identifizieren Sie als Nächstes ein Zellpaar, einen Photorezeptor und eine nahe gelegene horizontale oder bipolare Zelle für den Großhandel. Aufnahme der Philip-Pipette, die vor den Experimenten mit der intrazellulären Lösung vorbereitet wurde, und montieren Sie sie auf den Elektrodenhalter. Heben Sie anschließend das Mikroskopobjektiv leicht an.

Positionieren Sie die Photorezeptorpipette unter dem Objektiv. Senken Sie es dann so ab, dass die Spitze knapp über der Scheibe positioniert ist, und stellen Sie gleichzeitig den Fokus ein. Um nicht zu weit zu gehen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der zweiten Pipette. Überprüfen Sie anschließend den Pipettenwiderstand mit einem Depolarisationsimpuls von fünf bis 10 Millivolt. Passen Sie einen beliebigen Offset im Basisstrompegel des Verstärkers an.

Üben Sie danach einen leichten Überdruck aus und positionieren Sie in der Zwischenzeit die postsynaptische Pipette so, dass sie den horizontalen oder bipolaren Zellkörper berührt. Positionieren Sie dann die präsynaptische Pipette so, dass sie den Zellkörper eines Stäbchen- oder Zapfen-Photorezeptors berührt. Bei der Überwachung der Widerstandsfreigabe, des Überdrucks auf der postsynaptischen Pipette, reicht manchmal auch das Ablassen des Überdrucks aus, um eine Giga-Ohm-Dichtung zu bilden.

Nachdem der Spitzenwiderstand auf mehr als 100 Megaohm angestiegen ist, legen Sie ein Haltepotenzial von minus 60 Millivolt an. Wenn dann eine Giga-Om-Dichtung erhalten wird, heben Sie die transiente Pipettenkapazität auf. Wiederholen Sie unter Verwendung der Kapazitätskompensationsschaltung des Patch-Clamp-Verstärkers den Deckenvorgang mit der Photorezeptorpipette, legen Sie ein Haltepotenzial von minus 70 Millivolt an und heben Sie die Pipettenkapazität auf.

Vorübergehend, dann das Pflaster aufbrechen, indem jede Zelle angesaugt wird. Die Ruptur des Pflasters ist durch das Auftreten einer transienten Ganzzellkapazität erkennbar. Bestätigen Sie nun physiologisch die Identität der postsynaptischen Zelle, indem Sie einen Lichtblitz anlegen und eine Reihe von Spannungsschritten von minus 120 bis plus 40 Millivolt in 20-Millivolt-Schritten liefern.

Um zu beurteilen, ob die Zellen synaptisch verbunden sind, liefern Sie eine 60-Millivolt-Spannung von 25 bis 100 Millisekunden. Stufen Sie die Depolarisation zum Photorezeptor und suchen Sie nach postsynaptischen Strömen. Im Neuron zweiter Ordnung sind hier die repräsentativen Spuren der Lichtreaktionen der Neuronen in vertikalen Schnitten der Salamandernetzhaut.

Die horizontale Kegelzelle und die ausgeschaltete Bipolarzelle zeigen alle einen nach außen gerichteten Strom als Reaktion auf den Lichteinfall an. Der ausgeprägte nach innen gerichtete Strom, der dem Lichtblitz in den horizontalen und bipolaren Zellaufzeichnungen folgt, wird durch die vermehrte Freisetzung von Glutamat aus den Photorezeptoren verursacht, da diese bei Lichtversatz depolarisieren. Die on-bipolare Zelle reagiert bei Lichtbeginn mit einem nach innen gerichteten Strom, der sich aus einer zeicheninvertierenden metabotrope Glutamatrezeptor-Signalkaskade und der Aktivierung von tripm one Kanälen ergibt.

Horizontale Zellen und Bipolarzellen können durch ihre Stromspannungsverhältnisse voneinander unterschieden werden. Horizontale Zellen haben typischerweise lineare oder nach innen gleichgerichtete Stromspannungsverhältnisse mit einem Eingangswiderstand von weniger als 500 Megaohm, bipolare Zellen haben ein nach außen gleichrichtendes Stromspannungsverhältnis und einen höheren Eingangswiderstand zwischen 0,5 und zwei Gigaohm. Diese Abbildung zeigt die repräsentativen Ergebnisse aus den Aufzeichnungen eines zapfenden horizontalen Zellpaares und eines zapfenfreien bipolaren Zellpaares.

In jedem Fall evozierte die Depolarisation des Kegels auf minus 10 Millivolt von einem Haltepotential von minus 70 Millivolt einen spannungsgesteuerten Kalziumstrom im Kegel und einen schnellen postsynaptischen nach innen. Strom in der horizontalen oder bipolaren Zelle Netzhautscheibe. Die Präparate wurden in Hunderten von Studien zur Anatomie und Physiologie der Netzhaut verwendet.

Sie sind besonders vorteilhaft für die gleichzeitige Untersuchung der Reaktionen mehrerer Zellen, da sie die Aufzeichnung und Bildgebung von mehreren Zellen gleichzeitig ermöglichen. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Netzhaut präpariert, dünne Netzhautscheiben schneidet, sie in der Aufnahmekammer positioniert und Großaufnahmen von Paaren synaptisch verbundener Selbste erhält.