Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, GABA B-Rezeptor-vermittelte Effekte in identifizierten hippokampalen Parvalbumin-positiven Interneuronen zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst hochwertige akute Hippocampusschnitte hergestellt werden. Der zweite Schritt besteht darin, mit einem Videomikroskop Neuronen auf der Grundlage der venösen YFP-Expression und der bekannten Eigenschaften von paralen Albumin-positiven Neuronen auszuwählen.

Als nächstes werden Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen gemacht und entweder extrazelluläre Stimulation oder gepaarte Aufzeichnungen verwendet, um die durch den GABA-B-Rezeptor vermittelten Effekte zu untersuchen. Der letzte Schritt besteht darin, die Neuronen zu visualisieren und zu bestätigen, dass die aufgezeichneten Neuronen tatsächlich par-albumin-positiv sind und entweder parasomatische oder dendritische inhibitorische Neuronen sind. Letztendlich ermöglicht diese Methode die Charakterisierung von GABA B-Rezeptor-vermittelten inhibitorischen Effekten und ermöglicht eine eindeutige Klassifizierung der aufgezeichneten Interneuronen.

Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Neuronen beantworten. Zum Beispiel, wie inter Neuronen miteinander kommunizieren, wie ihre Erregbarkeit, ihr synaptischer Output von neuromodulatorischen Systemen gesteuert wird. Obwohl diese Methode Einblicke in die GABAerge, die Kontrolle des Hippocampus in Neuronen, bietet, kann sie auch auf andere Gehirnregionen, neuromodulatorische Systeme oder Zelltypen angewendet werden.

Nehmen Sie das Gehirn einer 17 bis 24 Tage alten transgenen Ratte, die fluoreszierende venöse YFP exprimiert, die in halbgefrorener Carbogen-Saccharose, A CSF gehalten wird, mit einem Skalpell, entfernen Sie das vordere Drittel des Kortex, das Kleinhirn, und trennen Sie die Hemisphären. Entfernen Sie die dorsale Oberfläche des Kortex, um eine ebene Oberfläche zu schaffen, auf der das Gehirn für die Schnitte verklebt werden kann. Kleben Sie die Halbkugeln mit dem Viome-Bad, das mit Rozen Carbogen nativer Saccharose gefüllt ist, auf die Viome-Bühne.

Ein Liquor schnitt 300 Mikrometer große Querscheiben der Hippocampus-Formation. Jede Scheibe wird in eine untergetauchte Warmhaltekammer mit Carbogen-Saccharose, einem Liquor bei 35 Grad Celsius, gebracht. 30 Minuten Nachdem Sie die letzte Scheibe in die erwärmte Saccharose gelegt haben, werden die Scheiben von einem Liquor zur Lagerung auf Raumtemperatur gebracht.

Ziehen Sie Patch-Pipetten aus Glaskapillaren, so dass ein Pipettenwiderstand von zwei bis vier Megaohm erreicht wird. Wenn sie gefüllt ist, überführen Sie eine Hippocampus-Scheibe in die Aufnahmekammer und halten Sie sie mit einem Platinring fest, der mit einzelnen Seidenfasern bespannt ist. Setzen Sie die Kammer in den Aufnahmeaufbau ein und beginnen Sie die Perfusion mit carbogen warmed recording A CSF bei einer Durchflussrate von fünf bis 10 Millilitern pro Minute.

Verwenden Sie eine Videokamera, um die Schnittqualität unter I-R-D-I-C-Optik bei 40-facher Objektivvergrößerung zu beurteilen. Gehen Sie davon aus, dass das Slice von guter Qualität ist. Wenn eine große Anzahl von runden, moderat kontrastreichen ca. 1 Parametallzellen im Schichtparameter in Tiefen von 20 bis 30 Mikrometern unter einer glatten und leicht kraterbedeckten Oberfläche zu sehen ist.

Identifizieren Sie mit Hilfe von Epi-Fluoreszenzbeleuchtung mutmaßliche schnell spikende Interneuronen als solche, die venöse YFP mit großen multipolaren somatischen Neuronen in oder in der Nähe des Stratum Parama exprimieren. Füllen Sie anschließend die Patch-Pipetten mit einer Lösung, die eine niedrige und physiologisch relevante Chloridkonzentration zur Identifizierung postsynaptischer Ströme enthält, und legen Sie sie in den Pipettenhalter auf dem Kopftisch. Üben Sie dann einen niedrigen Überdruck durch die Schlauchleitung aus.

Senken Sie die Pipette auf die Oberfläche der Schnitte, leicht versetzt zur Mitte des ausgewählten Neurons. Erhöhen Sie den Druck auf 70 bis 80 Millibar und senken Sie die Pipette durch die Scheibe schnell bis knapp über das Soma der ausgewählten Zelle. Drücken Sie die Pipette gegen die Zellmembran, um ein Grübchen darauf zu erzeugen.

Führen Sie diesen Schritt schnell aus. Um eine Biotin-Markierung benachbarter Zellen zu verhindern, erzeugen Sie eine Giga-Ohm-Dichtung, indem Sie den Druck ablassen und gleichzeitig einen negativen 20-Millivolt-Spannungsbefehl an die Pipette anlegen. Sobald die Abdichtung beginnt, reduzieren Sie den Spannungsbefehl auf das erwartete Ruhemembranpotential, typischerweise zwischen minus 70 und minus 60 Millivolt.

Wenden Sie nun einen kurzen Unterdruckimpuls an, um das Membranpflaster aufzubrechen und so die gesamte Zellkonfiguration zu erreichen. Identifizieren Sie mit dem Stromklemmenmodus schnell sprießende Interneuronen anhand ihrer Reaktion auf eine Familie von hyperpolarisierenden bis depolarisierenden Stromimpulsen. Um synaptisch evozierte Reaktionen zu beobachten, positionieren Sie eine extrazelluläre Stimulationselektrode in der Scheibe an der Grenze zwischen der molekularen Aufzeichnung des Stratum Radium und des Stratum laun oum.

Verwenden Sie im Spannungsklemmenmodus einen isolierten Konstantspannungsstimulator, um alle 20 Sekunden entweder einzelne oder 200-Hertz-Züge von fünf elektrischen 50-Volt-Reizen an die präsynaptischen Axone abzugeben. Tragen Sie anschließend ionotrope Glutamatrezeptor-Antagonisten auf das Bad auf, um die isolierten Monos freizulegen. Synaptische IPSC.

Des Weiteren wird der GABA-B-Rezeptor-vermittelte IPSC unter Anwendung eines GABA-A-Rezeptor-Antagonisten isoliert. Um gekoppelte Aufnahmen zu starten. Etablieren Sie zunächst eine Ganzzellaufzeichnung eines präsynaptischen Interneurons wie zuvor und bestätigen Sie den schnellen Spike-Phänotyp.

Als nächstes patchen Sie eine CA-One-Parametallzelle in einem Abstand von 20 bis 100 Mikrometern von dem Interneuron, das das präsynaptische Interneuron hält. Im Stromzangen-Modus. Wenden Sie kurze depolarisierende Stromimpulse der SRA-Schwelle an, um Aktionspotentiale im Interneuron auszulösen.

Wenn eine synaptische Verbindung vorhanden ist, führen Aktionspotentiale im Interneuron zu IPCs in der Spannung, die an eine Parametallzelle geklemmt wird. Sobald eine Verbindung hergestellt ist, lösen Sie Paare von Aktionspotentialen im präsynaptischen Fast-Spiking-Interneuron mit einem typischen gepaarten Pulsprotokoll aus zwei depolarisierenden Stimuli mit einem Intervall von 50 Millisekunden aus. Nach dem Sammeln der Kontrollspuren wird der selektive GABA-B-Rezeptor-Agonist Baclofen auf den perfundierten A-Liquor aufgetragen und so die GABA-B-Rezeptoren aktiviert.

Als nächstes wenden Sie den Antagonisten CGP 55 8 45 an, um die rezeptorvermittelten Effekte vollständig zu blockieren. Sobald die Aufzeichnung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Pipette langsam aus dem Zellkörper in der Spannungsklemme zurück. Wenn der in Serie gemessene Widerstand zunimmt, reduzieren Sie die Membranspannung auf minus 40 Millivolt, um die somatische Membran abzudichten, indem Sie ein Outside-Out-Patch bilden.

Im Anschluss an die Aufnahmen fixieren Sie die Scheiben durch Eintauchen in 4%para-Formaldehyd mit 0,1 molaren Phosphatpuffer über Nacht bei vier Grad Celsius Waschphosphatpuffer, dann in phosphatgepufferte Kochsalzlösung und blockieren Sie mit 10%normalem Ziegenserum 0,03%TRITTON X 100 und 0,05%Natriumazid für eine Stunde bei Raumtemperatur, um für die par-Albumin-Expression zu markieren. Verwenden Sie einen monoklonalen Anti-Parvalbumin-Maus-Antikörper, verdünnt in einer Lösung, die 5 % normales Ziegenserum, 0,3 % TRITTON X 100 und 0,05 % Natriumazid in PBS enthält, inkubieren Sie die primären Antikörper zwei bis drei Tage lang bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die Scheiben nach der Inkubation gründlich in PBS ab, tragen Sie fluoreszierende Anti-US-Sekundärantikörper zusammen mit einem Biotin-bindenden Protein, Strippin auf, das an ein Fluorochrom konjugiert ist, und inkubieren Sie in einer Lösung, die 3 % normales Ziegenserum, 0,1 % Tritton x 100 und 0,05 % Natrium enthält, in PBS verdünnt, über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag spülen Sie die Scheiben zwei- bis dreimal großzügig mit PBS aus, gefolgt von zwei bis drei Spülgängen in Phosphatpuffer.

Montieren Sie die Scheiben auf Objektträger und verwenden Sie einen 300-Mikrometer-Agar-Abstandshalter, um ein Zusammenfallen der Scheibe zu verhindern. Dann die Scheiben mit einem fluoreszierenden Eindeckmedium abdecken und mit Nagellack versiegeln. Beurteilen Sie die par-Albumin-Immunreaktivität des Interneurons mit einer hohen Vergrößerung und numerischen Apertur.

Objektivlinsenzellen gelten als immunreaktiv für par-Albumin. Wenn festgestellt wird, dass die Immunmarkierung mit den Biotin-markierten Strukturen übereinstimmt, nehmen Sie eine Bildserie auf der Z-Achse mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop auf, wobei fluoreszierendes Aden zur morphologischen Identifizierung und dreidimensionalen Rekonstruktion abgebildet wird. Rekonstruieren Sie dann das Bild in einem dreidimensionalen Neuron unter Einbeziehung der dendritischen und axonalen Arborisierung.

Die zusammengesetzte synaptische Reaktion eines schnell spikenden Interneurons als Reaktion auf einen einzelnen extrazellulären Stimulus ist hier dargestellt. Applikation der ionotropen Glutamatrezeptor-Antagonisten, DNQX- und A-PV-Isolate, der monos-synaptischen inhibitorischen postsynaptischen Strom- oder IPSC-Applikation des gabaa-Rezeptor-Antagonisten. Gazin hat die schnelle Komponente des IPSC abgeschafft.

Ein Zug von fünf Stimuli zeigte eine langsame GABA-B-Rezeptor-vermittelte IPSC, die durch die anschließende Anwendung von CGP blockiert wurde. Diese Spuren zeigen Aktionspotentiale in den präsynaptischen, schnell spikenden Interneuronen und kurzen Latenzzeiten unitärer I PSCs in CA one Parametallzellen unter Kontrollbedingungen nach dem Bad, der Applikation von Baclofen und der anschließenden Applikation von CGP. Beachten Sie, dass Baclofen die IPSC-Amplitude um etwa 50% reduziert, während der GABA-B-Rezeptor-Antagonist zu einer fast vollständigen Wiederherstellung der IPSC-Amplitude führte.

Ein Zeitverlaufsdiagramm der IPSC-Amplitude zeigt die Wirkung von Baclofen und CGPA Fast Spiking Interneuron, das bei 20-facher Vergrößerung gezeigt wurde, hatte eine Somata an der Grenze des Stratum Radium und der Parama-Puppe des ca. einen Bereichs mit Dendriten, die vertikal verliefen und alle Schichten überspannten. Während sich der Großteil des Axons wie für Korbzellen in und um die Zellkörperschicht herum befindet, zeigt ein Bild mit 60-facher Vergrößerung typische Körbe von Axonen, die sich um das vermeintliche ca one Parametall salata bilden, die mit dem orangefarbenen Sternchen gekennzeichnet sind. Eine dreidimensionale Rekonstruktion desselben Interneurons ist hier zu sehen, wobei das Soma und die Dendriten in schwarz und das Axon rot dargestellt sind.

Die Schichten des ca one sind nach dem Mastern blau abgegrenzt. Diese Technik kann an einem Tag durchgeführt werden, wobei nach der Entwicklung eine morphologische Analyse an mehreren Scheiben gleichzeitig durchgeführt wird. Dieser kombinierte Ansatz ebnete den Weg für Forscher von hippokampalen und kortikalen Mikroschaltkreisen, um die morphologische, physiologische Vielfalt sowie die Struktur-Funktions-Wechselbeziehung zwischen Neuronentypen zu erforschen.