Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, GABA-B-Rezeptor-vermittelte Effekte in identifizierten hippocampalen Parvalbumin-positiven Interneuronen zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst hochwertige akute hippocampale Schnitte hergestellt werden. Im zweiten Schritt erfolgt die Auswahl der Neuronen mithilfe eines Videomikroskops basierend auf der venösen YFP-Expression und den bekannten Eigenschaften parvalbuminpositiver Neuronen.

Im Anschluss werden Ganzzellen-Patch-Clamp-Aufnahmen durchgeführt, wobei entweder eine extrazelluläre Stimulation oder Paaraufnahmen verwendet werden, um die durch GABA_B_-Rezeptoren vermittelten Effekte zu untersuchen. Der letzte Schritt besteht darin, die Neuronen sichtbar zu machen und zu bestätigen, dass die aufgezeichneten Neuronen tatsächlich parvalbuminpositiv sind und entweder perisomatisch oder dendritisch hemmende Neuronen darstellen. Letztlich ermöglicht diese Methode die Charakterisierung der durch GABA_B_-Rezeptoren vermittelten hemmenden Effekte und erlaubt eine eindeutige Klassifizierung der aufgezeichneten Interneuronen.

Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Interneurone beantworten. Zum Beispiel, wie Interneurone miteinander kommunizieren, wie ihre Erregbarkeit und ihre synaptische Ausschüttung durch neuromodulatorische Systeme reguliert wird. Obwohl diese Methode Einblicke in die GABAerge Steuerung von Hippocampus-Interneuronen ermöglicht, kann sie auch auf andere Hirnregionen, neuromodulatorische Systeme oder Zelltypen angewendet werden.

Entnehmen Sie das Gehirn einer 17 bis 24 Tage alten transgenen Ratte, die fluoreszierendes venöses YFP exprimiert und in halbgefrorenem Karbogen-Saccharose-A-CSF aufbewahrt wurde, mithilfe eines Skalpells, entfernen Sie das vordere Drittel der Großhirnrinde, das Kleinhirn und trennen Sie die Hemisphären. Entfernen Sie die dorsale Oberfläche der Großhirnrinde, um eine ebene Fläche zu erhalten, an der das Gehirn zum Schneiden angeklebt werden kann. Kleben Sie die Hemisphären mit der Viome-Badevorrichtung, die mit gefrorenem Karbogen-Nativ-Saccharose gefüllt ist, auf die Viome-Plattform.

Ein CSF schneidet 300 Mikrometer dicke transversale Schnitte der Hippocampusformation an. Überführen Sie jeden Schnitt in eine untergetauchte Haltekammer, die mit carbogengesättigter Sucrose-ACSF bei 35 Grad Celsius gefüllt ist. 30 Minuten nachdem der letzte Schnitt in die erwärmte Sucrose-ACSF gebracht wurde, überführen Sie die Schnitte zur Lagerung auf Raumtemperatur.

Ziehen Sie Patch-Pipetten aus Glas-Kapillaren, sodass ein Pipettenwiderstand von zwei bis vier Megaohm erreicht wird. Übertragen Sie nach dem Befüllen eine hippokampale Schnittpräparation in die Ableitungskammer und fixieren Sie sie mit einem Platindraht, der mit einzelnen Seidenfasern bespannt ist. Stellen Sie die Kammer in die Ableitungsvorrichtung und beginnen Sie die Perfusionszufuhr von aufgewärmtem carbogengesättigtem Aufzeichnungs-Puffer (aCSF) mit einer Flussrate von fünf bis 10 Millilitern pro Minute.

Verwenden Sie eine Videokamera, um die Schnittqualität unter I-R-D-I-C-Optik bei 40-facher Objektivvergrößerung zu beurteilen. Gehen Sie davon aus, dass der Schnitt von guter Qualität ist, wenn eine große Anzahl runder, mäßig kontrastierter ca. ein Parametall-Zellen in der Stratum parametralis in einer Tiefe von 20 bis 30 Mikrometern unterhalb einer glatten und leicht kraterartig strukturierten Oberfläche sichtbar ist.

Unter Verwendung der epi-fluoreszierenden Beleuchtung identifizieren Sie putative schnellfeuernde Interneurone als solche, die venöses YFP mit großen multipolaren Somen in der Stratum parama oder in deren Nähe exprimieren. Danach füllen Sie die Patch-Pipetten mit einer Lösung, die eine niedrige und physiologisch relevante Chloridkonzentration enthält, zur Identifizierung postsynaptischer Ströme, und platzieren Sie sie im Pipettenhalter auf der Kopfstufe. Anschließend leiten Sie einen geringen positiven Druck über die Schlauchleitung ein.

Senken Sie die Pipette auf die Oberfläche des Schnitts ab, leicht versetzt zum Zentrum des ausgewählten Neurons. Erhöhen Sie den Druck auf 70 bis 80 Millibar und senken Sie die Pipette schnell durch den Schnitt bis knapp über das Soma der ausgewählten Zelle ab. Drücken Sie die Pipette gegen die Zellmembran, um eine Delle darauf zu erzeugen.

Führen Sie diesen Schritt zügig durch. Um eine Biotin-Markierung benachbarter Zellen zu verhindern, erzeugen Sie einen Gigaohm-Siegel, indem Sie den Druck abbauen und gleichzeitig eine negative Spannung von 20 Millivolt an die Pipette anlegen. Sobald die Versiegelung beginnt, verringern Sie die Spannungsvorgabe auf das erwartete Ruhe-Membranpotenzial, das typischerweise zwischen negativen 70 und negativen 60 Millivolt liegt.

Jetzt einen kurzen Puls negativen Drucks anlegen, um die Membran zu rupturieren und so die Ganzzell-Konfiguration zu erreichen. Im Strom-Klemm-Modus schnelle spikende Interneurone anhand ihrer Reaktion auf eine Serie von hyperpolarisierenden bis depolarisierenden Stromimpulsen identifizieren. Um synaptisch hervorgerufene Antworten zu beobachten, eine extrazelluläre Stimulations-Elektrode in dem Schnitt am Rand zwischen Stratum radiatum und Stratum lacunosum moleculare platzieren.

Verwenden Sie im Spannungs-klemm-Modus einen isolierten konstanten Spannungsstimulator, um entweder einzelne oder 200 Hertz lange Serien von jeweils fünf elektrischen Reizen mit 50 Volt an die präsynaptischen Axone alle 20 Sekunden anzulegen. Anschließend geben Sie ionotrope Glutamatrezeptorantagonisten in das Bad, um die isolierten monosynaptischen IPSCs sichtbar zu machen.

Isolieren Sie den durch den GABA_B-Rezeptor vermittelten IPSC weiter durch Anwendung eines GABA_A-Rezeptor-Antagonisten. Um gekoppelte Ableitungen durchzuführen, stellen Sie zunächst wie zuvor eine Ganzzellableitung eines präsynaptischen Interneurons her und bestätigen Sie das Phänotyp-Merkmal des schnellen Feuerns.

Danach patchen Sie eine CA-eine-parametrale Zelle in einem Abstand von 20 bis 100 Mikrometern zum Interneuron, das das präsynaptische Interneuron hält. Im Strom-Klemm-Modus. Geben Sie kurze, die Schwellendepolarisation erreichende Strompulse SRA an, um Aktionspotentiale im Interneuron auszulösen.

Wenn eine synaptische Verbindung vorhanden ist, führen Aktionspotentiale im Interneuron zu IPCs in der spannungsgeklemmten ca einen paramedianen Zelle. Sobald eine Verbindung hergestellt ist, erzeugen Sie Paare von Aktionspotentialen im präsynaptischen schnellfeuernden Interneuron mittels eines typischen Paired-Pulse-Protokolls mit zwei depolarisierenden Reizen im Abstand von 50 Millisekunden. Nach Aufzeichnung der Kontrollspuren wird der selektive GABA-B-Rezeptoragonist Baclofen dem perfundierenden ACSF zugegeben, wodurch GABA-B-Rezeptoren aktiviert werden.

Als Nächstes den Antagonisten CGP 55 845 anwenden, um die receptorvermittelten Effekte vollständig zu blockieren. Sobald die Aufzeichnung abgeschlossen ist, die Pipette langsam im Spannungs-Clamp-Modus aus dem Zellkörper zurückziehen. Wenn der gemessene Serienwiderstand ansteigt, die Membranspannung auf minus 40 Millivolt verringern, um die somatische Membran durch Bildung eines Outside-Out-Patches abzudichten.

Nach den Aufnahmen fixieren Sie die Schnitte durch Einweichen in 4 % Paraformaldehyd mit 0,1-molarer Phosphatpufferlösung über Nacht bei vier Grad Celsius, waschen sie anschließend mit Phosphatpuffer, dann mit phosphatgepufferter Salzlösung und blockieren Sie mit 10 % normalem Ziegenserum, 0,03 % Triton X-100 und 0,05 % Natriumazid eine Stunde bei Raumtemperatur. Um die Parvalbumin-Expression zu markieren, verwenden Sie einen anti-Parvalbumin monoklonalen Maus-Antikörper, der in einer Lösung verdünnt ist, die 5 % normales Ziegenserum, 0,3 % Triton X-100 und 0,05 % Natriumazid in PBS enthält; inkubieren Sie die primären Antikörper zwei bis drei Tage bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation spülen Sie die Schnitte gründlich in PBS aus, geben fluoreszierende sekundäre Anti-Maus-Antikörper sowie ein mit einem Fluorochrom konjugiertes biotinbindendes Protein (Streptavidin) hinzu und inkubieren in einer Lösung, die 3 % normales Ziegenserum, 0,1 % Triton X-100 und 0,05 % Natriumazid in PBS enthält, über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag spülen Sie die Schnitte reichlich zwei bis drei Mal mit PBS und anschließend zwei bis drei Mal mit Phosphatpuffer.

Montieren Sie die Schnitte auf Objektträgern und verwenden Sie einen 300 Mikrometer dicken Agar-Abstandshalter, um ein Zusammenfallen des Schnitts zu verhindern. Bedecken Sie die Schnitte anschließend mit einem fluoreszierenden Eindeckmedium und versiegeln Sie sie mit Nagellack. Untersuchen Sie die Par-Albumin-Immunreaktivität des Interneurons mit hoher Vergrößerung und numerischer Apertur.

Objektivlinsenzellen gelten als immunreaktiv für Paralbumin. Wenn die Immunmarkierung mit den mit Biotin markierten Strukturen übereinstimmt, nehmen Sie eine Z-Achsen-Serie von Bildern mit einem Laser-Scanning-Konfokalmikroskop auf, wobei fluoreszierendes Aden zur morphologischen Identifizierung und dreidimensionalen Rekonstruktion abgebildet wird. Anschließend rekonstruieren Sie das Bild dreidimensional in ein Neuron, wobei die dendritischen und axonalen Verzweigungen einbezogen werden.

Die zusammengesetzte synaptische Antwort einer schnellfeuernden Interneuron-Zelle auf einen einzelnen extrazellulären Reiz wird hier gezeigt. Die Applikation der ionotropen Glutamatrezeptorantagonisten DNQX und A PV isoliert den monosynaptischen inhibitorischen postsynaptischen Strom, oder IPSC, die Applikation des GABAA-Rezeptorantagonisten. Gazin beseitigte die schnelle Komponente des IPSC.

Eine Serie von fünf Reizen zeigte einen langsamen, über GABA-B-Rezeptoren vermittelten IPSC, der durch die anschließende Applikation von CGP blockiert wurde. Diese Spuren zeigen Aktionspotentiale im präsynaptischen, schnellfeuernden Interneuron und unitäre IPSCs mit kurzer Latenz in CA1-parametralen Zellen unter Kontrollbedingungen nach Badapplikation von Baclofen und anschließender Gabe von CGP. Beachten Sie, dass Baclofen die IPSC-Amplitude um etwa 50 % verringert, während der GABA-B-Rezeptorantagonist zu einer nahezu vollständigen Wiederherstellung der IPSC-Amplitude führt.

Ein Zeitverlaufsdiagramm der IPSC-Amplitude zeigt die Wirkung von Baclofen und CGPA. Das abgebildete schnellfeuernde Interneuron, das bei 20-facher Vergrößerung dargestellt ist, wies einen Soma auf, der an der Grenze zwischen Stratum radiatum und Stratum pyramidale des CA1-Bereichs lag, mit vertikal verlaufenden Dendriten, die sich über alle Schichten erstreckten. Während der Großteil des Axons, typisch für Korbzellen, im und um den Zellkörper-Layer zu finden ist, zeigt ein Bild mit 60-facher Vergrößerung typische Axonkörbe, die sich um putative CA1-Parvalbumin-positive Zellen bilden, die durch das orange markierte Sternchen gekennzeichnet sind. Hier ist eine dreidimensionale Rekonstruktion desselben Interneurons dargestellt, wobei Soma und Dendriten in Schwarz und das Axon in Rot dargestellt sind.

Die Schichten des CA1 sind in Blau abgegrenzt. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie an einem Tag durchgeführt werden, wobei die postoperative morphologische Analyse an mehreren Schnitten gleichzeitig nach der Entwicklung erfolgt. Dieser kombinierte Ansatz ebnete Forschern, die sich mit hippocampalen und kortikalen Mikroschaltkreisen beschäftigen, den Weg, um die morphologische und physiologische Vielfalt sowie die Struktur-Funktions-Beziehungen verschiedener Interneuronentypen zu erforschen.