Name: Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Lernen Sie die Whole-Cell-Patch-Clamp-Methode zur Charakterisierung von GABA-B-Rezeptor-Effekten in parvalbuminpositiven Hippocampus-Interneuronen. Diese Technik ermöglicht präzise elektrophysiologische Aufnahmen und morphologische Identifizierung.

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Die Autoren möchten sich Ina Wolter für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung danken. VGAT-Venus transgenen Ratten wurden von Drs erzeugt. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi und Y. in Kawaguchi Nationale Institut für Physiologische Wissenschaften, Okazaki, Japan, mit pCS2-Venus von Dr. A. Miyawaki vorgesehen.

Ethikerklärung: Alle Verfahren und Tier Wartung wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt, die deutsche Tierschutzgesetz hat der Europäische Rat die Richtlinie 86/609 / EWG über den Schutz von Tieren und Richtlinien von den lokalen Behörden (Berlin, T-0215/11 ) 1. Herstellung der Akute-Hippocampus <ol><li> Nehmen Sie ein transgenes Ratten (17 bis 24 Tage alt), die Leuchtstoff Venus / YFP Protein unter der VGAT Promotor, der die Mehrheit der kortikalen inhibitorischen Inter 13 Etiketten zum Ausdruck. Enthaupten die Ratte. Rasch zerlegen Gehirn (&lt;40 sec) in semifrozen, carbogenated (95% O 2/5% CO 2) auf Basis Saccharose künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF Saccharose, 1A). </li><li> Bewerten Sie die sezierten Rattenhirn für Venus / YFP Fluoreszenz mit einer 505 nm LED-Lampe und Emissionsfilter 515, auf einer Schutzbrille angebracht. </li><li> Entfernen Sie die Front Drittel des Kortex und Cerebellum; dann trennen die Halbkugeln, die alle mit einem Skalpell. Entfernen Sie die Rückenfläche des Kortex um eine flache Oberfläche, um das Gehirn zu kleben nach unten zu schaffen, wie zuvor beschrieben 14. </li><li> Geschnitten Querschnitt (300 um) des Hippocampus auf einer Vibratom sollten die Halbkugeln mit semifrozen umgeben sein, carbogenated Saccharose-ACSF (1B) 14. Entfernen Sie zusätzliche Regionen rostral Kortex, Mittelhirn und Hirnstamm. Übertragen Sie jede Scheibe zu einem untergetauchten Haltekammer, die Saccharose-ACSF, die carbogenated und erwärmt auf 35 ° C. </li><li> Lassen Sie die Scheiben bei 35 ° C für 30 min von der Zeit der letzten Scheibe in die erwärmte ACSF erholen. Tun Sie dies, um Stoffwechselprozesse zu aktivieren und erleichtern die Wiederverschließen geschnitten neuronale Prozesse. Dann übertragen auf Raumtemperatur für die Lagerung (Abbildung 1c). </li></ol> 2. Herstellung und Abfüllung von Aufnahme-Pipetten <ol><li> Pull Patchpipetten von Glaskapillaren, so dass eine Pipette Widerstand von 2-4 MOhm wird erreicht, wenn mit filtriert gefüllt (Spritzenfilter, Porengröße: 0,2 um) die intrazelluläre Lösung, die 0,1% Biocytin (für intrazelluläre Markierung). Halten Sie die intrazelluläre Lösung auf Eis gekühlt, um den Abbau seiner Bestandteile zu verhindern. </li><li> Füllen Patch-Pipetten zur Identifizierung von postsynaptischen Ströme mit einer Lösung, die eine physiologisch relevante niedrigen Cl - Konzentration (E R (Cl) = -61 mV, siehe Lösung Liste). </li><li> Für gepaarte Aufnahmen auf der präsynaptischen Rezeptor-vermittelten Reaktionen zu identifizieren, füllen Patch-Pipetten mit intrazellulären Lösung mit niedrigen Ca2 +-Pufferkapazität, um Interferenzen mit Transmitterfreisetzung präsynaptisch zu verhindern, sowie 4-fach höhere Cl - Konzentration (E R (Cl) = -20 mV) zur Verbesserung der Signal-zu-Rauschen der beobachteten IPSCs 5 was eine genaue Beurteilung der pharmakologischen bzw.onsiveness. Beachten Sie, dass Änderung Cl - Konzentration IPSC-Kinetik 15 ändern. </li></ol> 3. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme von FS-ins <ol><li> Carbogenate ACSF und Futtermittel durch das Perfusionssystem zu der Aufzeichnungskammer, mittels einer Schlauchpumpe (der auch entfernt von der Aufzeichnungs ACSF Kammer über eine Saugleitung, Figur 2A). Schalten Sie alle Geräte auf dem Setup in der Vorbereitung für die Aufnahme. </li><li> Übertragen einer Scheibe auf die Aufnahme Kammer und halten Sie ihn mit einem Platin-Ring mit einzelnen Fasern aus Seide bespannt. Positionieren Sie die Scheibe, so dass die Schicht (str.) Pyramidale der CA1 läuft vertikal durch das Sichtfeld, die den Zugang mit 2 Pipetten sowohl auf die str. radiatum und str. Oriens gleichzeitig (2C und 4A). </li><li> Legen Sie die Kammer in das Setup und starten Perfusion carbogenated und erwärmt (32-34 ° C) Aufnahme einesCSF bei einer Flußrate von 5-10 ml / min. </li><li> Beurteilen Scheibenqualität unter IR-DIC-Optik mit 40x Objektivvergrößerung und visualisieren mit einer CCD-Kamera auf einem Display angezeigt. Annehmen gutes Stück Qualität, wenn eine große Anzahl von runden, mäßig gegen CA1-Pyramidenzellen (CA1 PC) in str gesehen werden. pyramidale in einer Tiefe von 20-30 um unter einer glatten und leicht Kraterlandschaft (Abbildung 2C). Schlechte Qualität Scheiben enthalten eine große Zahl von sehr kontrast, geschrumpft oder geschwollene Zellen, mit einer unebenen Oberfläche Scheibe. </li><li> Identifizieren mutmaßlichen FS Inter unter Epifluoreszenz Beleuchtung wie die Venus auszudrücken / YFP (2B), mit großen multipolaren Somata in oder in der Nähe des str. pyramidale. Markieren Sie die Zellen einigermaßen tief in die Scheibe (50-100 um, 2C), um eine bessere Erhaltung ihrer morphologischen Integrität. </li><li> Montieren Sie den Aufnahme-Elektrode in der Pipette Halter auf der heads; dann Apply ein geringer positiver Druck (20-30 mbar) durch die Schlauchleitung. Senken der Pipette auf die Oberfläche der Scheibe, leicht zu dem Zentrum des Neurons ausgewählt versetzt. </li><li> Erhalten whole-cell-Konfiguration wie zuvor beschrieben, und 14,16 siehe auch Bilder in 2D und 2E: <ol><li> Zielen auf eine Zelle: Erhöhen Sie den Druck auf 70-80 mbar und schnell senken Sie die Pipette durch die Scheibe, gerade über die Soma der ausgewählten Zelle (Abbildung 2D, oben). </li><li> Nähern Sie sich dem Zell: Drücken Sie die Pipette gegen die Zellmembran erzeugen eine &quot;Delle&quot; auf sie (2D, oben). Führen Sie diesen Schritt schnell, um Biocytin Kennzeichnung von Nachbarzellen zu verhindern. </li><li> Erstellen Sie eine Giga-Ohm-Siegel: Lassen Sie den Druck und gleichzeitig gelten eine 20 mV Spannungsbefehl mit der Pipette. Ein Giga-Ohm-Dichtung (1-50 GOhm; 2D, unten und 2E Mitte) typicVerbündeten entwickelt sich schnell. Einmal versiegelt, gelten die zu erwartende Ruhemembranpotential (typischerweise zwischen -70 und -60 mV) als Spannungsbefehl. </li><li> Durchbrechen Sie den Patch: Einmal versiegelt, reißen die Membran-Patch mit einem kurzen Impuls von Unterdruck; wodurch die Gesamtzellkonfiguration (2E, unten) erreicht wird. </li></ol></li><li> Ausgleich Ganzzellkapazität und Serienwiderstand (R S). R s ist normalerweise 5-20 MOhm und stabil für bis zu 120 min. Aufzugeben, wenn Zellen Membranpotential (V M) auf Durchbruch ist mehr als -50 mV depolarisiert; R S anfänglich größer als 30 MOhm; oder R S um mehr als 20% im Verlauf der Aufzeichnung. </li><li> Identifizieren FS-Ins durch ihre Reaktion (im Current-Clamp-Modus) zu einer Familie von Hyperstromimpulse depolarisierende (-250 bis +250 pA, 2F, oben). FS-Ins haben relativ Verzehr V M (typischerweise -50 to -60 mV), kurze Membranzeitkonstante (&lt;20 ms) und auf einem 500 pA depolarisierende Strominjektion mit einem Zug von Aktionspotentialen (APs) bei Frequenzen&gt; 100 Hz 11 (2F, unten), die deutlich sind von denen in CA1 PCs (2F, Mitte). </li></ol> 4. Extrazelluläre Elektrostimulation GABA B R-vermittelte Antworten Evoke <ol><li> Um synaptisch hervorgerufenen Reaktionen zu beobachten, positionieren Sie eine extrazelluläre Stimulationselektrode (eine Patch-Pipette mit 2 M NaCl gefüllt; Widerstand: 0,1-0,3 MQ) in der Scheibe an der Grenze von str. radiatum und str. lacunosum-moleculare. Positionieren Sie die Elektrode 200-300 um lateral der Soma der direkten elektrischen Stimulation der Zelle zu verhindern und zu minimieren Stimulation Artefakten (3A). </li><li> Nachdem der Stimulationselektrode angeordnet ist, zu erhalten, Ganzzell-Aufzeichnungdie gewählte Zelle und Beurteilung der physiologischen Phänotyp in Current-Clamp-Modus, wie in Abschnitt 3.9 (3B). </li><li> Mit dem Neuron in Voltage-Clamp (V M -65 mV) aufgezeichnet, liefern elektrische Stimulation der präsynaptischen Axone bei 50 V (~ 500 uA wirksame Reiz) alle 20 sec, das eine isolierte Konstantspannungs Stimulator. Benutzen Reize (100 us Dauer, 3C, oben) zu GABA B R vermittelten IPSCs beobachten und zu verschachteln mit Zügen von mehreren Stimuli (bei ​​200 Hz) zu mehr Transmitterfreisetzung zu produzieren. </li><li> Bad gelten ionotropen Glutamat-Rezeptor-Antagonisten (AMPA-Rezeptor: DNQX [10 uM]; NMDA-Rezeptor: D-AP5 [50 uM]), um die isolierte monosynaptische IPSC (3C, in der Mitte oben) zu offenbaren. Ferner isolieren die GABA-vermittelte Ik R unter Anwendung eines GABA A R Blocker (gabazine [10 uM], 3C Mitte lower). </li><li> Bestätigen Sie die resultierende langsam Auswärtsstrom (3C niedriger, erweitert) als GABA B durch die anschließende Anwendung von CGP-55845 [5 uM] (3C unteren, grau unterlegt) R-vermittelten </li></ol> 5. Gekoppelte Aufnahmen von Synaptisch Gekoppelt FS-IN und CA1-PCs <ol><li> Beurteilen GABA B R-vermittelten präsynaptischen Steuerung inhibitorische synaptische Übertragung bei gleichzeitiger Aufnahme zwischen synaptisch-gekoppelt und PC Paaren durchgeführt, wie unten beschrieben. </li><li> Zuerst stellen Sie eine Ganzzell Aufnahme einer präsynaptischen Intern (wie in Abschnitt 3) und bestätigen Sie den FS-Phänotyp (4A). </li><li> Dann patchen eine benachbarte CA1 PC (20-100 um Abstand, 4A) und gelten kurze überschwelligen depolarisierende Strompulse (1 ms Dauer, 1-5 nA Amplitude) mit der präsynaptischen IN (in Current-Clamp-Modus gehalten werden), um APs zu entlocken. Wenn einem synaptischen Connection vorhanden ist, APs in der IN-Ergebnis in IPSCs in der CA1-PC, der Spannung-Klammer gehalten (Ausgleich R S bis etwa 80%). </li><li> Wenn nötig, füllen Sie eine neue Aufnahme-Elektrode und Datensatz aus weiter CA1-PCs, bis eine Verbindung gefunden. </li><li> Sobald eine Verbindung hergestellt ist, entlocken Paare von APs in der präsynaptischen FS-IN, sowohl die synaptische einheitliche Reaktion und das dynamische Verhalten zu beurteilen. Verwenden Sie einen typischen gepaart Puls-Protokoll von 2 depolarisierende Stimuli mit einer 50 ms-Intervall (4B). </li><li> Steuer sammeln Spuren im Ausgangsbedingungen. Dann gelten die selektiven GABA B-Agonisten Baclofen R (10 uM), um die Perfusion von ACSF aktiviert somit GABA B Rs, gefolgt von der Antagonist CGP-55845 (5 uM), um vollständig blockieren die Rezeptor vermittelten Wirkungen. Sammeln ~ 50 Spuren im stationären Zustand jedes Medikament Zustand (4B und C). </li><li> Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, dichten die somatischen Membran durch die Bildung eines outside-out-Patch: Ziehen Sie langsam die Pipette aus dem Zellkörper in V-Klemme und wie die R S steigt, verringern Sie die V bis -40 mV M. Tun dies, um die Bildung der Outside-out-Patches zu erleichtern; entfernen Sie dann die Pipette aus dem Bad. </li></ol> 6. Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften <ol><li> HINWEIS: Eine Vielzahl von verschiedenen Software-Pakete sind für den Erwerb von elektrophysiologischen Daten verfügbar. Hier WinWCP, ein Windows-Programm in der freien Software-Paket Strathclyde Elektrophysiologie verwendet, die Aufzeichnung von bis zu 16 Analogeingangskanäle und Ausgangs von 10 digitalen Signalen ermöglicht. </li><li> Tiefpassfilter alle Daten bei 5-10 kHz und Probe bei 20 kHz. </li><li> Analyse physiologischer Daten mit einer Offline-Analyse-Suite. HINWEIS: Stimfit, ein Open-Source-Software-Paket, das eine Python-Shell wird in diesem Fall verwendet wird, beinhaltet; aber andere Alternativen können leicht stattdessen verwendet werden. <ol><li> Analysieren Passivmembran pigenschaften der aufgezeichneten Neuronen, in Stromzange erworben, von Ruhemembranpotential. </li><li> Messung der mittleren Ruhemembranpotential von der Grundlinie der aufgezeichneten Antworten von dem Beginn der Aufzeichnung. </li><li> Berechnen Eingangswiderstand unter Verwendung des Ohmschen Gesetzes, aus der Spannung als Reaktion auf die kleinste Hyperpolarisierungsstromimpulse (≤ -50 pA). Zur Verbesserung der Signal-Rausch-Verhältnis, durchschnittlich mehrere Spuren. Hinweis: Unsere Beispiele sind in der Regel Durchschnittswerte von 10-50 einzelnen Sweeps. </li></ol></li><li> Schätzen Sie die scheinbare Membran Zeit durch den Einbau einer monoexponentiellen Kurve, um den Zerfall der Antworten auf die kleinste Hyperpolarisation Stromimpulse konstant. </li><li> Analysieren Aktionspotential Wellenform Schwelle, Amplitude (Schwelle zur Spitze) und Dauer (Breite gemessen in halber Höhe) von Schwellenwert depolarisierende Stromimpulse ausgelöst bestimmen. </li><li> Analysieren GABA B R vermittelten IPSCs von Voltage-Clamp-Aufnahmen. Filter zeichnet off-line zu500 Hz (Gauß-Filter) und bewertet die Spitzenamplitude und die Latenz des GABA B R vermittelte Reaktion (im Mittelwerte von mindestens 10 Spuren). </li><li> Erkennen die Wirkung von GABA B Rs auf der inhibitorischen Ausgang INs als eine Änderung der Spitzenamplitude des GABA A R-vermittelten IPSCs zwischen Peak und der vorhergehenden Ausgangswert gemessen. Berechnen Sie die mittlere Amplitude von ≥50 Spuren für die Steuerperiode und der stationären aller pharmakologischen Epochen. </li></ol> 7. Visualisierung und Immunocytochemistry der FS-Ins <ol><li> Nach den Aufnahmen, fixieren die Scheiben durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB, pH = 7,35) O / N bei 4 ° C. </li><li> Ggf. Scheiben kann PB für bis zu ca. 1 Woche vor der Verarbeitung übertragen und gespeichert werden. </li><li> Wasch Scheiben reichlich frische PB und anschließend in 0,025 M PB mit 0,9% NaCl (PBS, pH = 7,35). </li><li> Um nicht-spezifische Antikörper Bindung zu reduzieren, blockieren die Scheiben for 1 h bei RT in einer Lösung mit 10% normalem Ziegenserum (NGS), 0,3% Triton-X100 (ein Detergens, Membranen durchdringbar) und 0,05% NaN 3 in PBS hergestellt. </li><li> Für PV Ausdruck kennzeichnen, verwendet eine Anti-PV monoklonalen Maus-Antikörpers in einer Lösung, die 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN 3 in PBS verdünnt. Inkubieren Primärantikörper für 2-3 Tage bei 4 ° C 12. Spülen Sie gründlich in PBS Scheiben. </li><li> Anwenden fluoreszierenden Anti-Maus-Sekundärantikörper (zB AlexaFluor-546.) Zusammen mit dem Biotin-Bindungsprotein Streptavidin, konjugiert an ein Fluorochrom (zB AlexaFluor-647); und Inkubation in einer Lösung, enthaltend 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN 3, verdünnt in PBS und Inkubation O / N bei 4 ° C ist. </li><li> Zügig spülen Scheiben 2-3 x mit PBS, gefolgt von 2-3 Spülungen in PB. Montieren Sie die Scheiben auf Glasobjektträger. Verwenden Sie ein 300 um Agar Abstandshalter an der Scheibe vor dem Kollaps zu verhindern. Deckglas Scheiben mit einer LeuchtstoffCent Montagemedium und Dichtung mit Nagellack. </li></ol> 8. Imaging und Rekonstruktion der Visualisierte FS-Ins <ol><li> Visualisieren Sie die Scheiben mit einem konfokalen Mikroskop, mit dem Reporter aufgeregt fluorochome mit der entsprechenden Laserlinie (635 nm Diodenlaser für AlexaFluor-647; Helium-Neon-543 nm-546 für AlexaFluor Kennzeichnung für PV-und Argon 488 oder 515 nm für Venus / YFP). </li><li> Aufnehmen von Bildern an einer geeigneten Z-Auflösung (typischerweise 0,5-1 um Schritte mit einem 20x-Objektiv), um ein Z-Stapel von der ganzen Zelle zu erzeugen. Mehrere Stapel werden üblicherweise Bildes benötigt die gesamte Zelle, die digital off-line unter Verwendung Fiji / ImageJ Software (5A) genäht werden kann. </li><li> Rekonstruieren die Zelle aus dem Bildstapel genäht mit einem halbautomatischen Ablaufverfolgungsmethode (Simple Neuriten Tracer-Plugin in Fiji / ImageJ-Software-Paket 17, Bild C). </li><li> Schließlich bewerten die PV-Immunreaktivität des interneuron mit einer hohen numerischen Apertur Objektivlinse (60X siliciumSion, NA = 1,3). Machen Sie Bilder des Soma, proximalen Dendriten und Axon proximalen oder alternativ von Axonterminalen wenn somatische Auswaschen der PV ist zu stark. Zellen werden als immunreaktiv für PV, wenn Immunmarkierung ist zu sehen, mit den Biocytin-markierten Strukturen (5B) auszurichten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir beschreiben eine Methode, die elektrophysiologische und neuroanatomische Techniken kombiniert, um funktionell zu charakterisieren morphologically- und neurochemisch identifizierten Neuronen in vitro; insbesondere die verschiedenen Arten von kortikalen inhibitorischen Ins. Schlüsselaspekte des Verfahrens sind: (1) Vorauswahl der potenziellen IEE; (2) die intrazelluläre Aufnahme und Neuron Visualisierung; und schließlich (3) morphologische und immunzytochemische Analyse von aufgezeichneten Ins. Obwohl diese Studie hat...

Hippocampus neuronale Schaltkreise sind seit langem Gegenstand intensiver Kontrolle, sowohl in Bezug auf die Anatomie und Physiologie, die aufgrund ihrer wesentlichen Rolle bei Lernen und Gedächtnis sowie räumliche Navigation bei Mensch und Nager. Ebenso die prominenten, aber einfache laminare Organisation des Hippocampus macht diese Region zu einem beliebten Thema der Studien zu strukturellen und funktionellen Eigenschaften der kortikalen Netzwerke. Hippocampus-Schaltungen sind von exzitatorischen Hauptzellen (&gt; 80%) und einer kleineren (10-20%), aber sehr unterschiedliche Gruppe von hemmenden Inter 1-3 besteht. Interfrei γ-Aminobuttersäure (GABA) aus ihrer Axonterminalen, die bei schnellen ionotropen GABA A-Rezeptoren wirkt (GABA A Rs) und langsamen metabo GABA-B-Rezeptoren (GABA B Rs) 4. Diese inhibitorischen Mechanismen entgegenzuwirken Anregung und regulieren deren Erregbarkeit der Hauptzellen und damit dieir Timing und Muster der Entladung. GABA von Inter freigegeben wirkt jedoch nicht nur von den Hauptzellen, sondern auch auf die Inter sich 5,6. Pre-und postsynaptischen Rezeptoren vermitteln Feedback-Regulation und hemmenden Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Arten von Interneuron. Diese hemmenden Mechanismen im Intern Netzwerke sind vermutlich zentral für die Erzeugung und Gestaltung der Bevölkerung Aktivitätsmustern, insbesondere Schwingungen zu sein bei verschiedenen Frequenzen 7. Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine gut etablierte Methode für die Prüfung der Eigenschaften und der synaptischen Interaktion von Neuronen. Aufgrund der hohen Vielfalt Interntypen, die Untersuchung von hemmenden Inter erfordert jedoch strenge Identifizierung der Zellen aufgenommen. Wie Hippocampus Interntypen werden durch verschiedene morphologische Merkmale und neurochemische Marker Ausdruck, kombiniert anatomischen und immunzytochemische e gekennzeichnetxamination kann ein Mittel, um präzise Intern Identität 6,8,9 zu bestimmen. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir einen experimentellen Ansatz, in der Ganzzell Patch-Clamp-Aufnahmen von einzelnen Neuronen oder synaptisch gekoppelten Paare werden mit intrazelluläre Markierung kombiniert, gefolgt von Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse, so dass für die Charakterisierung von langsam GABA B Rezeptor-vermittelte hemmende Wirkung in Inter identifiziert. Als ein Beispiel, konzentrieren wir uns auf eine wichtige Art der Intern, einer Untergruppe der so genannten &quot;Korbzellen&quot; (BC), die die Soma und proximalen Dendriten der postsynaptischen Zielinnerviert und wird von einem &quot;schnellen Spick&quot; (FS) gekennzeichnet entladen Muster, ein Axon dicht auf den Zellkörperschicht, und die Expression des Calcium-bindende Protein Parvalbumin (PV) 10,11. Diese Inter anzuzeigen große postsynaptischen inhibitorischen Ströme, sowie prominente vorgesynaptischen Modulation der synaptischen Ausgang in Reaktion auf GABA B-Aktivierung R 12. Die Kombination der hier beschriebenen Techniken können ebenso gut eingesetzt werden, um intrinsische oder synaptischen Mechanismen in einer Vielfalt von anderen identifizierten Neuron Typen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Transgene vGAT-Venus-Ratten</td><td></td><td></td><td>siehe Uematsu, &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2008</td></tr><tr><td>Venus-(515 nm)-Brille</td><td>BLS Ltd., Ungarn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präparationswerkzeuge</td><td>&lt;em&gt;das heißt&lt;/em&gt; FST</td><td></td><td>Zum Entfernen des Gehirns</td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>Oder ein anderes hochwertiges Vibratom mit minimaler vertikaler Oszillation</td></tr><tr><td>Schnitt-Haltebehälter</td><td></td><td></td><td>Im Labor selbst angefertigt</td></tr><tr><td>Aufrechtes IR-DIC-Mikroskop</td><td>Olympus, Japan</td><td>BX50WI</td><td>Mit Mikromanipulator-System; &lt;em&gt;beispielsweise&lt;/em&gt; Luigs und Neumann, Kleindiek &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Till Photonics</td><td>VX55</td><td></td></tr><tr><td>505-nm-LED-System</td><td>Cairn Research</td><td>OptiLED-System</td><td>Oder Quecksilberlampe oder anderes LED-System &lt;em&gt;beispielsweise&lt;/em&gt; CooLED.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Alternativ 2× Axopatch-200B-Verstärker&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>WinWCP-Aufnahmesoftware</td><td>John Dempster, Strathclyde University</td><td></td><td>Jede hochwertige Aufnahmesoftware kann verwendet werden, &lt;em&gt;beispielsweise&lt;/em&gt; EPHUS, pClamp, Igor etc.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Elektrodenzieher</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>Verwendet mit Box-Filament</td></tr><tr><td>Borosilikat-Pipettenglas</td><td>Hilgenberg, Deutschland</td><td>1405020</td><td>2 mm Außendurchmesser, 1 mm Innendurchmesser, ohne Filament</td></tr><tr><td>Peristaltikpumpe</td><td>Gilson</td><td>Minipuls</td><td>Andere Pumpen oder Schwerkraftzufuhr können alternativ verwendet werden</td></tr><tr><td>Digitalthermometer</td><td></td><td></td><td>Selbst angefertigt</td></tr><tr><td>Digitalmanometer</td><td>Supertech, Ungarn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/&quot; target=&quot;_blank">Isolierter Konstantspannungs-Stimulator&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Digitimer Ltd.</a></td><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds2a-isolated-constant-voltage-stimulatorstimulus-isolator/&quot; target=&quot;_blank">DS-2A&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Invitrogen</td><td>B1592</td><td>Auch bekannt als &amp;epsilon;-Biotinoyl-L-Lysin&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DL-AP5(V)-Natriumsalz</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120271</td><td></td></tr><tr><td>DNQX-Natriumsalz</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120169</td><td>Alternativ NBQX oder CNQX</td></tr><tr><td>Gabazin (SR95531)</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120042</td><td>Alternativ Bicucullinmethiodid</td></tr><tr><td>R-Baclofen</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120325</td><td></td></tr><tr><td>CGP-55.845-Hydrochlorid</td><td>Tocris</td><td>1248</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>anti-PV-mausmonoklonaler Antikörper</td><td>Swant, Schweiz</td><td>235</td><td>Arbeitskonzentration 1:5.000–1:10.000</td></tr><tr><td>sekundärer Antikörper gegen Maus&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>Wenn Venus- oder GFP-Ratten verwendet werden, ist die Nutzung eines roten Kanals (&lt;em&gt;beispielsweise&lt;/em&gt; 546 nm) ratsam.</td></tr><tr><td>Normales Ziegen-Serum</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopische Objektträger</td><td></td><td></td><td>Jede hochwertige Marke</td></tr><tr><td>Glas-Deckgläser</td><td></td><td></td><td>Üblicherweise 22 × 22 mm</td></tr><tr><td>Agar-Abstandshalter</td><td></td><td></td><td>Agarblock, mit Vibratom auf 300 &amp;mu;m geschnitten</td></tr><tr><td>Laser-Scanning-Konfokalmikroskop</td><td>Olympus, Japan</td><td>Fluoview FV1000</td><td>Oder ein anderes vergleichbares System</td></tr><tr><td>Fiji (Fiji is just ImageJ)</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td><td>Siehe Schindelin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2012</td></tr></tbody></table>

whole-cell-patch-clamp-aufnahmen aus morphologically- und neurochemisch identifizierten hippocampus inter

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergen inhibitorischen Inter spielen eine zentrale Rolle in neuronalen Schaltkreisen des Gehirns. Inter umfassen eine kleine Teilmenge der neuronalen Population (10-20%), zeigen aber eine hohe physiologische, morphologische und neurochemische Heterogenität, was ihre vielfältigen Funktionen. Daher Untersuchung von Inter bietet wichtige Einblicke in die Organisationsprinzipien und Funktion neuronaler Schaltkreise. Dies erfordert jedoch einen integrierten physiologischen und neuroanatomische Ansatz für die Auswahl und Identifizierung der einzelnen Interntypen. Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen von akuten Hirnschnitten von transgenen Tieren exprimieren fluoreszierende Proteine ​​unter den Promotoren von Internspezifische Marker, ein effizientes Verfahren zur gezielten elektrophysiologisch zu charakterisieren intrinsischen und synaptischen Eigenschaften bestimmter Interntypen. Verbindung mit intrazellulären Farbstoff Kennzeichnung kann dieser Ansatz mit post-hoc mo verlängertrphological und immunzytochemische Analyse zur systematischen Identifizierung von aufgezeichneten Neuronen. Diese Verfahren können angepaßt werden, um eine breite Palette von wissenschaftlichen Fragen zu funktionellen Eigenschaften der verschiedenen Arten von kortikalen Neuronen entsprechen.

Vorausgesetzt, dass Scheibenqualität ist spürbar gut, die Aufnahme von beiden CA1-PCs und FS-Ins können mit minimalen Schwierigkeiten erreicht werden. Die transgenen Rattenlinie, Venus / YFP unter der VGAT Promotor 13 nicht eindeutig identifizieren FS-Ins oder auch BC. Allerdings Aufnahmen von INS in und um str. pyramidale, wo die Dichte der FS-ins ist typischerweise hoch 1, ergibt sich eine hohe Wahrscheinlichkeit der Auswahl FS-Ins (2B). FS-Ins durch ihre charakteristisc...

Kortikaler Netzwerke werden von einem kleinen, aber vielfältige Reihe von hemmenden Inter gesteuert. Funktionelle Untersuchung von Inter erfordert daher gezielte Aufnahme und strenge Identifizierung. Hier beschrieben wird, ist ein kombinierter Ansatz, der Ganzzellableitungen von einzelnen oder synaptisch gekoppelten Paare von Neuronen mit intrazelluläre Markierung, Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, GABA-B-Rezeptor-vermittelte Effekte in identifizierten hippocampalen Parvalbumin-positiven Interneuronen zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst hochwertige akute hippocampale Schnitte hergestellt werden. Im zweiten Schritt erfolgt die Auswahl der Neuronen mithilfe eines Videomikroskops basierend auf der venösen YFP-Expression und den bekannten Eigenschaften parvalbuminpositiver Neuronen.Im Anschluss werden Ganzzellen-Patch-Clamp-Aufnahmen durchgeführt, wobei entweder eine extrazelluläre Stimulation oder Paaraufnahmen verwendet werden, um die durch GABA_B_-Rezeptoren vermittelten Effekte zu untersuchen. Der letzte Schritt besteht darin, die Neuronen sichtbar zu machen und zu bestätigen, dass die aufgezeichneten Neuronen tatsächlich parvalbuminpositiv sind und entweder perisomatisch oder dendritisch hemmende Neuronen darstellen. Letztlich ermöglicht diese Methode die Charakterisierung der durch GABA_B_-Rezeptoren vermittelten hemmenden Effekte und erlaubt eine eindeutige Klassifizierung der aufgezeichneten Interneuronen.Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Interneurone beantworten. Zum Beispiel, wie

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik namens Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, die eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Mauthner-Neuronen und anderen retikulospinalen Zellen in Zebrafischembryonen ist.

Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie: Eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Patch-Clamp-Aufzeichnung von der dendritischen Membranoberfläche. Dies hilft dabei, die elektrischen Eigenschaften von Dendriten und den zugrundeliegenden spannungsgesteuerten Ionenkanälen in dopaminergen Neuronen direkt zu untersuchen.

Patch-Clamp-Aufzeichnungen vom Dendriten eines dopaminergen Neurons in einem Hirnschnitt

Das Video zeigt ein Protokoll zur Untersuchung synaptischer Interaktionen und neuronaler Reaktionen in einem transfizierten Hippocampus-Hirnschnitt der Maus. Dabei werden sensorische Neuronen mit großer Reichweite beleuchtet, um Aktionspotentiale auszulösen, und die daraus resultierenden exzitatorischen postsynaptischen Potentiale im aufgezeichneten Neuron unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik aufgezeichnet.

Photostimulation und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Neuronen in Hippocampus-Schnitten der Maus

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Durchführung elektrophysiologischer Aufzeichnungen in Substantia gelatinosa (SG)-Neuronen von Rückenmarksschnitten, wobei Ganzzell-Patch-Clamp-Techniken verwendet werden, um die Feuermuster von Neuronen zu analysieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Reaktionen auf Reize in SG-Neuronen des Rückenmarks.

Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme in einem Substantia gelatinosa-Neuron eines Rückenmarksschnitts

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Kartierung synaptischer Verbindungen durch Sichern eines Gehirnschnitts, Positionieren von Pipetten, um Ganzzellkonfigurationen zu erreichen, und Stimulierung präsynaptischer Neuronen, um postsynaptische Reaktionen aufzuzeichnen, wodurch die neuronale Konnektivität aufgeklärt wird.

Gepaarte Patch-Clamp-Aufzeichnung der neuronalen Verbindungen in akuten Hirnschnitten

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Pair-Aufzeichnungen sind simultane Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von zwei synaptisch verbundenen Neuronen, die eine präzise elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierung der Synapsen zwischen einzelnen Neuronen ermöglichen. Hier beschreiben wir die detaillierte Methodik und die Anforderungen für die Etablierung dieser Technik in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen in jedem Labor, das für Elektrophysiologie ausgestattet ist.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Patch-Clamp-Aufzeichnungen und gleichzeitige intrazelluläre Biocytin-Füllung von synaptisch gekoppelten Neuronen in akuten Hirnschnitten ermöglichen eine korrelierte Analyse ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Ziel dieses Protokolls ist es, die wesentlichen technischen Schritte der elektrophysiologischen Aufzeichnung von neuronalen Mikroschaltkreisen und deren anschließende morphologische Analyse zu beschreiben.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

Dieses Protokoll beschreibt grundlegende Verfahrensschritte für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen durchführen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung des elektrischen Verhaltens von Neuronen, und wenn in Hirnschnitten durchgeführt wird, ermöglicht die Bewertung verschiedener neuronaler Funktionen von Neuronen, die in relativ gut erhalten Gehirn Schaltungen noch integriert sind.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Subzelluläre Patch-Clamp-Aufzeichnungen bieten die Möglichkeit, die funktionellen Eigenschaften von Dendriten zu untersuchen. Diese feinen Strukturen sind jedoch aufgrund ihres geringen Durchmessers nicht leicht zugänglich. Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, die Sammlung stabiler und zuverlässiger Aufzeichnungen von den Dendriten von Dopamin-Neuronen in Schnitten in vitro zu erleichtern.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie primäre hippocampusale Mikroglia von adulten Mäusen isoliert und gereinigt werden können, gefolgt von Anweisungen zur Durchführung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen an diesen akut isolierten Zellen.

Isolierung und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von hippokampalen Mikroglia aus adulten Mäusen

Lernen Sie die Whole-Cell-Patch-Clamp-Methode zur Charakterisierung von GABA-B-Rezeptor-Effekten in parvalbuminpositiven Hippocampus-Interneuronen. Diese Technik ermöglicht präzise elektrophysiologische Aufnahmen und morphologische Identifizierung.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

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