A Novel Hochauflösende

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochauflösende Einzelzellbilder von aus dem Knochenmark stammenden Vorläuferzellen zu erhalten, nachdem deren Rekrutierungsmuster an normale Hirn- und hirntumorassoziierte Gefäße im zeitlichen Verlauf verfolgt wurden. Dies wird erreicht, indem Tibia und Femur von Spendermäusen entfernt werden, um fluoreszierende Knochenmark-Vorläuferzellen zu gewinnen, die anschließend in bestrahlte Empfängermäuse injiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, intrakranielle GBM-Xenotransplantate in den chimären Mäusen innerhalb einer Schädelkammer zu erzeugen.

Anschließend werden die Mäuse verschiedenen Behandlungsregimen unterzogen, einschließlich stereotaktisch geführter Bestrahlung. Der letzte Schritt besteht darin, die Mäuse an einem Zweiphotonen-Konfokalmikroskop abzubilden. Letztendlich kann diese Methodik verwendet werden, um die Mechanismen der intrakraniellen Vaskularisierung in einer Vielzahl von Modellen dynamisch zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Histopathologie von ex vivo-Gewebe liegt darin, dass wir entscheidende dynamische Informationen bezüglich der Gefäßbildung im Gehirn untersuchen können. Auf diese Weise können wir zentrale Fragen zu den Mechanismen der intrakraniellen Neovaskularisierung beantworten. Obwohl diese Methode Einblicke in die intrakranielle Neovaskularisierung ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme und Krankheitsprozesse im Gehirn angewandt werden, beispielsweise auf intrakranielle Ischämie oder Schlaganfall, neurodegenerative Erkrankungen sowie die Mechanismen der Metastasierung von Tumorzellen ins Gehirn.

Für die Zwecke dieses Videos konnten wir keine strikte aseptische Technik anwenden. Daher ist die Biosicherheitshaube mit einer Öffnung von mehr als 12 Zoll verwendet worden, und die Tiere wurden nicht abgedeckt, um dem Betrachter eine klarere Sicht und besseren Zugang zur Orientierung der Verfahren für die experimentelle Arbeit zu ermöglichen. Die aseptische Technik sollte strikt eingehalten werden.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Fluoreszenzexpression der GFP-Donormaus bestätigen, und setzen Sie sie gemäß den Richtlinien des institutionellen Tierversuchsausschusses unter. Reinigen Sie anschließend beide Hintergliedmaßen und entfernen Sie unter aseptischen Bedingungen Tibia und Femur. Entfernen Sie das überschüssige Gewebe vollständig von den Knochen.

Entfernen Sie anschließend die Endplatten von beiden Enden der vier extrahierten Knochen. Spülen Sie diese mit einer 22-Gauge-Nadel und einem Milliliter steriler PBS durch. Sie werden klar, sobald das gesamte Knochenmark ausgespült ist.

Mischen Sie anschließend die extrahierte Knochenmarkssuspension gut durch. Sie sollte etwa 20 Millionen Zellen enthalten, was für die Rekonstitution von drei Wirtsmäusen ausreicht. Bereiten Sie danach 3 Tuberkulinspritzen mit 27 Gauge vor und ziehen Sie jeweils 300 Mikroliter der Knochenmarkssuspension in jede Spritze auf.

Während sich die Maus in der Haltevorrichtung befindet, markieren Sie die dorsale Schwanzoberfläche, um sich zu orientieren. Injizieren Sie dann die Suspension in die seitliche Schwanzvene von drei zuvor bestrahlten Tieren.

Nageln Sie die Mäuse bei diesem Verfahren unter aseptischen Bedingungen fest. Betäuben Sie die chimären Knochenmark-Nagel-Mäuse und verabreichen Sie eine von der IACUC genehmigte präventive Analgesie. Tragen Sie Tränen-Gel auf, um eine Hornhauttrockenheit zu verhindern.

Reinigen Sie den Kopf zuerst mit Betadine-Lösung, anschließend mit Alkohol und entfernen Sie das überschüssige Haar. Danach reinigen Sie die darunterliegende Kopfhaut erneut mit Alkohol. Führen Sie einen Schnitt von der Mitte zwischen den Ohren bis knapp über die Augenbrauen durch.

Entfernen Sie die Kopfhaut an beiden Seiten des ersten Schnittes, um etwa fünf Millimeter des darunterliegenden Schädels freizulegen. Danach identifizieren Sie die anatomischen Orientierungspunkte der Schädeloberfläche. Anschließend identifizieren und heben Sie das Periost an, indem Sie eine 2 %ige Lidocain-Lösung mit Adrenalin injizieren.

Lösen Sie anschließend das Periost mit einem scharfen Instrument von der Schädeloberfläche ab. Verwenden Sie dann einen 2,7-Millimeter-TR-Refine-Bohrer, um eine kreisförmige 2,7-Millimeter-Knochenplatte in der rechten Hemisphäre des Schädels, die von Lambda und bgma gleich weit entfernt ist, zu schwächen. Durchbohren Sie den Knochen dabei nicht mit dem Bohrer, um die darunterliegende Dura und das Gewebe zu schützen.

Entfernen Sie nun den geschwächten Knochenlappen mit der Präpation, Pinzette und Zahnhaak unter gezielter, aber kontrollierter Kraft. Danach füllen Sie eine Hamilton-Spritze mit 30er Nadel mit 10 Mikrolitern Zellsuspension und setzen die Nadel am stereotaktischen Rahmen auf. Stellen Sie dann die Maus auf den stereotaktischen Rahmen.

Richten Sie die Nadel auf den Mittelpunkt des Fensters aus, das danach erzeugt wurde, und senken Sie die Nadel ab, bis sie die kortikale Oberfläche berührt. Setzen Sie dann die digitalen Koordinaten zurück. Senken Sie die Nadel nun um 3,2 Millimeter in das kortikale Gewebe ab.

Ziehen Sie dann 0,2 Millimeter zurück und injizieren Sie auf einer Tiefe von drei Millimetern. Die Injektion in der Tiefe sollte mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute durchgeführt werden. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, lassen Sie die Nadel eine Minute lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie langsam zurückziehen.

Entfernen Sie dann die Maus aus dem Rahmen. Halten Sie anschließend die Gehirnoberfläche mit Tropfen sterilem PBS feucht.

Legen Sie einen Deckgläser mit drei Millimetern Durchmesser auf die Gehirnoberfläche, um das 2,7-Millimeter-Fenster abzudichten. Danach das umgebende Schädelknochengewebe trocknen. Anschließend Vet-Bond auftragen, um das Hautgewebe am Schädelknochen zu befestigen und das Deckglas an Ort und Stelle zu halten.

Tragen Sie nicht zu viel auf, da es unter das Glas sickern und das Abbildungspotential verringern würde. Mischen Sie anschließend frisches zahnmedizinisches Acrylpulver und Lösung im Abzug und tragen Sie die Mischung mit einer 22-Gauge-Nadel über den Vet-Bond auf. Um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten, tragen Sie das Acryl so auf, dass es leicht über die Kante des Glasdeckels hinausragt, diesen jedoch nicht bedeckt.

In diesem Schritt wird eine anästhesierte Maus in eine spezielle Kopfhalterung innerhalb des eigens konstruierten stereotaktischen Bestrahlungsgeräts XAD 2 25 platziert. Führen Sie eine 360-Grad-Konstrahl-CT-Aufnahme durch, wobei die Röntgenröhre bei 40 Kilovolt Spitzenleistung und 0,05 Milliampere über einen zwei Millimeter dicken Aluminiumfilter betrieben wird. Nutzen Sie das Bild, um den Tisch so zu positionieren, dass der Strahlungsisocenter auf die rechte Hemisphäre ausgerichtet und in kaudal-kranialer Richtung zentral liegt.

Es ist eine große Auswahl an Kollimatoren zur gezielten Bestrahlung erhältlich, was die Anpassungsfähigkeit des Modells zeigt. In diesem Fall verwenden wir einen Kollimator mit einer Größe von acht Millimetern mal elf Millimetern für die halbkugelförmige Bestrahlung. Setzen Sie den halbkugelförmigen Kollimator in den X RAD 2 25 stereotaktischen Bestrahler ein.

Erhalten Sie die einzelnen CT-orthogonalen Bilder sowohl von oben als auch von unten durch den Kollimator, um die korrekte Positionierung des Kopfes anhand der anatomischen Knochenstrukturen sicherzustellen und die Stufenposition manuell am Monitor feinabzustimmen. Wechseln Sie den XAD 2 25 IRRADIATOR Aluminiumfilter zu einem 0,93 Millimeter dicken Kupfer-Behandlungsfilter. Führen Sie dann das Röntgenröhren-Programm bei 225 peak illa voltage und 13 milliamps aus und verabreichen Sie die Hälfte der Strahlendosis von oben in anteroposteriorer (AP) Richtung.

Bringen Sie den Gantry in die untere Position zurück und applizieren Sie die zweite Hälfte der Strahlendosis von unten in posterior-anteriorer (PA) Richtung. Anesthetisieren Sie in diesem Verfahren die zuvor erzeugte Maus mit intrakranialem Fenster und reinigen Sie das Fenster mit Alkoholspray. Richten Sie die Kanäle am konfokalen Mikroskop gemäß den in die chimäre Maus integrierten Fluorochromen ein.

Alternativ können vorherige Einstellungen wiederverwendet werden, um die Variabilität zwischen den Bildgebungssitzungen zu reduzieren. Spritzen Sie in diesem Fall alle für die Bildgebung erforderlichen Markierungen in die seitliche Schwanzvene ein, beispielsweise Dextran für die Gefäße. Stellen Sie die Maus kopfüber auf die speziell angefertigte Kopfhalterung, stützen Sie sie mit formbarem Plastilin ab und stellen Sie sicher, dass der Kopf senkrecht zum Laserstrahl ausgerichtet und flach aufliegt; setzen Sie die Halterung dann auf die bewegliche Mikroskopbühne auf.

Schalten Sie den Laser des ersten Kanals ein und positionieren Sie ihn mittig zum intrakraniellen Fenster, indem Sie direkt auf den Schnittpunkt des Laserstrahls auf dem Fenster der Kammer schauen. Nehmen Sie ein Bild jedes Kanals für das gesamte Fenster mit einem 5×-Objektiv auf und verwenden Sie es als Übersichtskarte für andere hochauflösende Aufnahmen mit 10×- und 20×-Langstreckenobjektiven. Dieses Schema verdeutlicht die mit dem chirurgischen Vorgang verbundenen technischen Fehler und zeigt deren jeweilige Auswirkungen auf die erzeugten Bilder.

Luftblasen unter dem Fenster sind als Blasen auf den Bildern sichtbar. Acrylansammlungen auf dem Glas zeigen Autofluoreszenz im weitroten Kanal und verdecken einen Teil des Sichtfeldes. Ebenso erscheint Schmutz auf dem Fenster während der Aufnahme als autofluoreszierende Strukturen in den Bildern.

Selbst das perfekte intrakranielle Fenster kann Probleme zeigen, sobald es unter dem Mikroskop ist. Atemartefakte führen zu linienförmigen Bildern, während eine ungünstige Positionierung der Maus am Rahmen ein segmentiertes Bild verursacht. Da der Laser nur einen Teil des Gewebes durchläuft und eine nachträgliche Bildverarbeitung erfolgt, ist es möglich, einen zusätzlichen Kanal für CFP-markierte Zellen hinzuzufügen, wobei GFP-Bilder von CFP-Bildern subtrahiert werden können, um das eigentliche CFP-Signal sichtbar zu machen.

Außerdem können wir mithilfe der zweiten harmonischen Erzeugung und der Autofluoreszenz von Kollagen Typ IV die Basalmembran der Gefäße abbilden. Die Verfügbarkeit von fünf fluoreszierenden Kanälen bietet dem Anwender eine große Flexibilität und Anpassungsfähigkeit des in dieser Arbeit beschriebenen neuartigen Spiegelmodells. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die gefährlichen Substanzen zu berücksichtigen, die während der chirurgischen Eingriffe verwendet werden.

Es ist außerdem unerlässlich, sorgfältig vorzugehen und besondere Aufmerksamkeit auf Details zu legen, um sicherzustellen, dass das Gehirngewebe während der Langzeitbildgebung unbeschädigt bleibt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine chimäre Maus mit fluoreszierenden Vorläuferzellen erzeugt, und im Anschluss daran in der Lage sein, hochauflösende Echtzeitbilder der intrakraniellen Gefäße nach der Implantation von Tumorzellen – mit oder ohne therapeutische Intervention – aufzuzeichnen.