A Novel Hochauflösende In vivo Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochauflösende Einzelzellbilder von aus dem Knochenmark stammenden Vorläuferzellen zu erhalten, die ihren Rekrutierungsmustern für normales Hirn- und Hirntumor-assoziiertes Gefäßsystem im Laufe der Zeit folgen. Dies wird erreicht, indem die Tibia und der Femur von Spendermäusen entfernt werden, um fluoreszierende Knochenmark-Vorläuferzellen zu erhalten, und diese Zellen dann in eine bestrahlte Empfängermäuse injiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, intrakranielle GB M-Xenotransplantate in den chimären Mäusen in einer kranialen Fensterkammer zu erzeugen.

Anschließend werden die Mäuse einer Vielzahl von Behandlungsschemata unterzogen, einschließlich stereotaktisch geführter Bestrahlung. Der letzte Schritt besteht darin, die Mäuse auf einem konfokalen Zwei-Photonen-Mikroskop abzubilden. Letztendlich kann diese Methodik verwendet werden, um die Mechanismen der Vaskularisierung intrakraniell in einer Vielzahl von Modellen dynamisch zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Histopathologie von ex vivo-Gewebe besteht darin, dass wir kritische dynamische Informationen im Zusammenhang mit der Gefäßbildung im Gehirn untersuchen können. Auf diese Weise können wir Schlüsselfragen rund um die Mechanismen der interkraniellen Neovaskularisation beantworten. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in die intrakranielle Neovaskularisation zu erhalten, kann sie auch auf andere Systeme und Krankheitsprozesse im Gehirn angewendet werden, wie z. B. intrakranielle Ischämie oder Schlaganfall, neurodegenerative Erkrankungen und Mechanismen von Tumorzellmetastasen im Gehirn.

Für die Zwecke dieses Videos waren wir nicht in der Lage, eine strikte aseptische Technik zu befolgen. Daher ist die Biosicherheitshaube eine übermäßige Öffnung von 12 Zoll und die Tiere sind nicht drapiert, was dem Betrachter ein klareres Bild und einen besseren Zugang zur Orientierung der Verfahren für experimentelle Arbeiten ermöglicht. Die aseptische Technik sollte strikt befolgt werden.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Fluoreszenzexpression der GFP-Spendermaus bestätigen und sie gemäß den Richtlinien des institutionellen Tierpflegeausschusses einschläfern. Reinigen Sie anschließend beide hinteren Gliedmaßen und entfernen Sie das Schienbein und den Oberschenkelknochen, während Sie unter aseptischen Bedingungen arbeiten. Entfernen Sie alles überschüssige Gewebe von den Knochen.

Entfernen Sie dann die Endplatten von beiden Enden der vier extrahierten Knochen. Spülen Sie sie mit einer 22-Gauge-Nadel und einem Milliliter sterilem PBS. Sie werden klar, sobald das gesamte Knochenmark ausgespült wurde.

Mischen Sie anschließend die extrahierte Knochenmarksuspension. Nun, es sollte ungefähr 20 Millionen Zellen enthalten, was für die Rekonstitution von drei Wirtsmäusen ausreicht. Bereiten Sie dann 3 Tuberkulinnadeln mit 27 Gauge vor und ziehen Sie jeweils 300 Mikroliter der Knochenmarksuspension in jede von ihnen.

Während sich die Maus im Halterung befindet. Markiere die hintere Schwanzfläche, um dich zu orientieren. Injizieren Sie dann die Suspension in die laterale Schwanzvene von drei zuvor bestrahlten Venen.

Nod rutscht bei diesem Verfahren Mäuse unter aseptischen Bedingungen ein. Betäuben Sie die chimären Knochenmark-Rutschen-Mäuse und verabreichen Sie die von der IACUC zugelassene präventive Analgesie. Tragen Sie Tränengel auf, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern.

Reinigen Sie den Kopf zuerst mit Betadine-Lösung, dann mit Alkohol und entfernen Sie die überschüssigen Haare. Reinigen Sie dann die darunterliegende Kopfhaut weiter mit Alkohol. Machen Sie einen Schnitt von der Mitte der Ohren bis knapp über die Augen.

Entfernen Sie die Kopfhaut auf beiden Seiten des ersten Schnitts, um etwa fünf Millimeter des darunter liegenden Schädels freizulegen. Identifizieren Sie dann die anatomischen Orientierungspunkte der Schädeloberfläche. Als nächstes identifizieren und heben Sie das Periost an, indem Sie 2% Lidocain mit Adrenalinlösung injizieren.

Präparieren Sie anschließend das Periost mit einem scharfen Instrument von der Schädeloberfläche weg. Verwenden Sie dann einen 2,7 Millimeter TR-Verfeinerungsbohrer, um einen 2,7 Millimeter großen kreisförmigen Knochenlappen auf der rechten Hemisphäre des Schädels zu schwächen, der sowohl von Lambda als auch von bgma gleich weit entfernt ist. Dringen Sie mit dem Bohrer nicht in den Knochen ein, um die darunterliegende Dura und das Gewebe zu schützen.

Entfernen Sie nun den geschwächten Knochenlappen mit der Dissektion, der Pinzette und dem Zahnhaken mit absichtlicher, aber kontrollierter Kraft. Laden Sie als Nächstes eine 30-Gauge-Hamilton-Spritze mit 10 Mikrolitern Zellsuspension und platzieren Sie die Nadel auf dem stereotaktischen Rahmen. Platzieren Sie dann die Maus auf dem stereotaktischen Rahmen.

Richten Sie die Nadel auf den Mittelpunkt des danach erzeugten Fensters aus und senken Sie die Nadel ab, bis sie die kortikale Oberfläche berührt. Setzen Sie dann die digitalen Koordinaten zurück. Senken Sie nun die Nadel 3,2 Millimeter in das kortikale Gewebe ab.

Dann 0,2 Millimeter zurückziehen und bei drei Millimetern injizieren. Die Tiefeninjektion sollte mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute durchgeführt werden. Wenn die Injektion abgeschlossen ist, lassen Sie die Nadel eine Minute lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie langsam zurückziehen.

Entfernen Sie dann die Maus aus dem Rahmen. Halten Sie anschließend die Gehirnoberfläche mit Feuchtigkeit versorgt. Mit Tropfen sterilem PBS.

Legen Sie einen drei Millimeter dicken Deckzettel auf die Gehirnoberfläche, um das 2,7-Millimeter-Fenster abzudichten. Trocknen Sie dann den umliegenden Schädelknochen. Tragen Sie anschließend Vet Bond auf, um das Kopfhautgewebe auf den Schädelknochen zu kleben und den Deckschirm an Ort und Stelle zu halten.

Tragen Sie nicht zu viel auf, da es unter das Glas austritt und das Abbildungspotenzial verringert. Mischen Sie anschließend das frische dentale Acrylpulver und die Lösung in der Haube und tragen Sie die Mischung mit einer 22-Gauge-Nadel auf die Tierarztbindung auf. Um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten, tragen Sie das Acryl so auf, dass es leicht mit der Kante des Glasdeckglases überlappt, aber nicht, um das Glasdeckglas abzudecken.

Platzieren Sie in diesem Schritt eine betäubte Maus in einem speziell angefertigten Kopffixierer im stereotaktischen Bestrahlungsgerät XAD 2 25. Erhalten Sie einen 360-Grad-Kegelstrahl-CT-Scan, bei dem die Röntgenröhre mit einer Spitzenspannung von 40 Kilo und 0,05 Milliampere durch einen zwei Millimeter Aluminiumfilter läuft. Verwenden Sie das Bild, um den Tisch so zu positionieren, dass das ISO-Zentrum der Strahlung auf die rechte Hemisphäre gerichtet ist und in dorsaler ventraler Richtung mittig liegt.

Für die Ausrichtung der Strahlung steht eine Vielzahl von Kollimatoren zur Verfügung, was die Anpassungsfähigkeit des Modells zeigt. In diesem Fall verwenden wir acht Millimeter mal 11 Millimeter für die hemisphärische Bestrahlung. Setzen Sie den hemisphärischen Kollimator in den stereotaktischen Bestrahlungsgerät X RAD 2 25 ein.

Erhalten Sie die orthogonalen Einzel-CT-Bilder sowohl von oben als auch von unten durch den Kollimator, um die korrekte Positionierung des Kopfes zu gewährleisten, indem Sie die anatomischen Knochenstrukturen lokalisieren und die Tischposition auf dem Monitor manuell feinabstimmen. Tauschen Sie den XAD 2 25 IRRADIATOR Aluminiumfilter gegen einen 0,93 Millimeter Kupferfilter aus. Führen Sie dann das Röntgenröhrenprogramm bei 225 Spitzenspannung und 13 Milliampere aus und verabreichen Sie die Hälfte der Strahlendosis von oben in AP-Richtung.

Bringen Sie das Portal wieder in die untere Position und verabreichen Sie die zweite Hälfte der Strahlendosis von unten in PA-Richtung. Bei diesem Verfahren wird die zuvor erzeugte intrakranielle Fenstermaus betäubt und das Fenster mit Alkoholspray gereinigt. Richten Sie die Kanäle am konfokalen Mikroskop so ein, wie sie durch die in die chimäre Maus integrierten Fluorochrome bestimmt werden.

Alternativ können Sie vorherige Einstellungen wiederverwenden, um die Variabilität zwischen den Bildgebungssitzungen zu reduzieren. In diesem Fall werden alle für die Bildgebung erforderlichen Tags in die laterale Schwanzvene injiziert, Dextran für das Gefäßsystem. Drehen Sie die Maus auf den speziell angefertigten Kopf-Restrainer, stützen Sie ihn mit formbarem Plastilin ab, stellen Sie sicher, dass der Kopf senkrecht zum Laser steht, und laden Sie den Restrainer flach auf den beweglichen Mikroskoptisch.

Schalten Sie den Laser des ersten Kanals ein und positionieren Sie ihn in der Mitte des intrakraniellen Fensters, indem Sie direkt auf den Schnittpunkt des Laserstrahls am Fenster der Kammer schauen. Nehmen Sie ein Bild jedes Kanals für das gesamte Fenster mit einem Fünf-fach-Objektiv auf und verwenden Sie es als Map für andere Bilder mit höherer Auflösung mit 10-fach- und 20-fach-Objektiven mit großer Reichweite. Dieses Schema verdeutlicht die technischen Fehler, die mit dem chirurgischen Prozess verbunden sind, und zeigt die Auswirkungen, die jeder einzelne auf die erzeugten Bilder haben wird.

Eingeschlossene Luft unter dem Fenster ist als Blasen auf den Bildern sichtbar. Acrylablagerungen auf dem Glas sind im fernen roten Kanal autofluoreszierend und blockieren einen Teil des Sichtfelds. In ähnlicher Weise zeigt sich Schmutz auf dem Fenster während der Bildgebung als autofluoreszierende Biegung in den Bildern.

Selbst das perfekte intrakranielle Fenster kann unter dem Mikroskop auf Probleme stoßen. Atmende Artefakte führen zu linienförmigen Bildern, während eine schlechte Positionierung der Maus auf dem Rahmen zu einem segmentierten Bild führt. Da der Laser bei der Nachbearbeitung nur einen Teil des Gewebes durchquert, ist es möglich, einen zusätzlichen Kanal für CFP-markierte Zellen hinzuzufügen, wobei GFP-Bilder von CFP-Bildern subtrahiert werden können, um das wahre CFP-Signal zu enthüllen.

Darüber hinaus können wir unter Verwendung der Autofluoreszenz der zweiten harmonischen Generation, die für die vier Kollagenfasern charakteristisch ist, die Basalmembran des Gefäßsystems abbilden. Die Verfügbarkeit von fünf Fluoreszenzkanälen ermöglicht dem Benutzer ein hohes Maß an Flexibilität und Anpassungsfähigkeit des neuartigen Spiegelungsmodells, das in diesem Artikel beschrieben wird. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, die gefährlichen Produkte im Auge zu behalten, die während der chirurgischen Eingriffe verwendet werden.

Es ist auch wichtig, akribisch vorzugehen und besonders auf Details zu achten, um sicherzustellen, dass das Hirngewebe während der gesamten Langzeitbildgebung unbeschädigt bleibt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine chimäre Maus mit fluoreszierenden Vorläuferzellen erstellt und in der Lage ist, hochauflösende Echtzeitbilder des intrakraniellen Gefäßsystems nach der Implantation von Tumorzellen mit oder ohne therapeutische Intervention aufzunehmen.