Name: High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie fluoreszierende C. elegans-Stämme für Hochdurchsatz-Screenings kultivieren und dispensieren. Diese Methode ermöglicht die in-vivo-Detektion von Umweltkontaminanten und die Identifizierung von Modulatoren induzierbarer Signalwege.

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C. elegans Transgene wurden von den Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN) zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde vom NIH R21 gewähren NS0667678-01 bis KS unterstützt. Alle Autoren nahmen an der Erhebung, Analyse und Interpretation der Daten. CKL, KS, und KPC nahmen schriftlich und Überarbeitung des Manuskripts.

1. Vorbereitung der bakteriellen Wurm Lebensmittel Tag 1 <ol><li> 5 ml gesättigte E. coli OP50 Bakterienkultur zu 500 ml Brühe Terrific mit 50 ug / ml Streptomycin ergänzt und wachsen in einem Schüttelinkubator (225 rpm) über Nacht bei 37 ° C. </li></ol> Tag 2 <ol start="2"><li> Split der Nacht Bakterienkultur in zehn 50 ml-und Zentrifugenröhrchen Bakterien in einer Kühlzentrifuge bei 2.500 rcf für 20 Minuten. </li><li> Abdekantieren LB Brühe und resuspendieren jeder Bakterienpellet in 10 ml Flüssigkeit Nematoden Nährmedien (NGM). Schütteln Sie horizontal in einem Stockwerk Schüttler für 15 Minuten, um die Bakterien zu resuspendieren. Um NGM-Puffer, 3 g NaCl auf 1 L entionisiertem Wasser und Autoklaven. Abkühlen auf 55 ° C und in Ordnung fügen Sie die folgende sterile Lösungen: 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSO 4, und 25 ml 1 M Kaliumphosphat, pH 6,0. </li><li> Centrifuge die Bakterienkultur in einer Kühlzentrifuge bei 2.500 rcf für 20 Minuten. </li><li> Abdekantieren NGM-Puffer und wiegen das Bakterienpellet. </li><li> Fügen Sie dem gleichen Volumen NGM-Puffer zu den Pellets, Aliquot 3 ml Bakterien Konzentrat in 15 ml Tuben, und bei -20 ° C resuspendieren </li></ol> 2. Großflächige C. elegans Flüssigkultur Wir verwenden eine transgene Linie VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [dop-3:: RFP]) mit zwei fluoreszierenden Konstrukte: Pgst -4:: GFP 14 bis SKN-1 Monitor Aktivität und PDOP-3:: RFP 17 bis als Standard für die Wurm-Nummer Normalisierung dienen. Tag 1 <ol><li> Mix 150 ml NGM-Puffer, 1,5 ml LB-Medium, 150 ul von 5 mg / ml Cholesterin (in Ethanol) und 75 ul 100 mg / ml Streptomycin. Filter-sterilisiert die Mischung und fügen Sie einen 1-Liter sterile Flasche. HINWEIS: Bei Zugabe von 1% LB Brühe auf NGM Puffer hilft, Würmer Anhaften von Glas-und Kunststoffprodukte zu verhindern, aber dieser Betrag nicht ausreicht, um das Wachstum von Bakterien zu unterstützen. </li><li> Synchronisieren Würmer mit dem Standard-Hypochlorit Verfahren 18. Bis zu 0,5 ml gravid Würmer können in einem einzigen 15 ml Tube mit 5 ml Natriumhypochlorit-Lösung (3,75 ml sterilem Wasser, 1 ml Bleiche, und 250 ul 10 N NaOH) verarbeitet werden. Waschen Sie die Freigabe Eier mit sterilem Wasser und resuspendieren Sie in 10 ml NGM Puffer. </li><li> Verdünnen Sie eine Probe der Eier 100-fach in NGM Puffer (z. B. 100 ul in 10 ml) und zählen die Anzahl der Eier in drei separate 5 ul Aliquots. Mehrere der durchschnittlichen Anzahl von 200.000 (100 Verdünnungsfaktor x 2.000) zur Schätzung der Gesamtzahl der Eier. </li><li> Add 200.000 bis 2 Millionen Eier in den Kolben mit NGM-Puffer und schütteln Sie die Kultur bei 100 Umdrehungen pro Minute bei 20 ° C. </li></ol> Tag 2 <ol start="5"><li> Mindestens 16 h nach der Zugabe Eier in den Kolben, eine sterile serologische Pipette ca. 0,5 ml des suspendierten Wurm Kultur zu entfernen. Pipet drei 5 ul Tropfen auf die sterile Deckel einer Petrischale. Setzen Sie den Deckel in einer -20 ° C Gefrierschrank für 1-2 Minuten, um Würmer zu lähmen. Zählen Sie die durchschnittliche Anzahl von lebenden geschlüpften Würmer pro 5 ul und dann mehrere von 30.000 (150 ml / 5 pl) auf die Gesamtzahl der geschlüpften Würmer zu schätzen. </li><li> Tauwetter ein Rohr aus gefrorenem OP50 Bakterienkultur (Protocol 1,6) und 3 ml 50% OP50 in die Wurm Kultur pro 500.000 geschlüpften Würmer. Schütteln Sie die Flasche mit 100 UpM bei 20 ° C. Worms wird in L4-Larven und jungen Erwachsenen in etwa 51 Stunden zu entwickeln. Die OD600 von Bakterien sollte etwa 2.200 an der Anfang sein. Überwachen Sie die Menge der Bakterien durch Absorption und fügen Sie mehr, wenn die OD 600 fällt unter 0,900. </li></ol> 3. Worm Sammlung und Abgabe Tag 4 <ol><li> Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette ca. 0,5 ml des suspendierten Wurm Kultur zu einem Standard NGM-Agar-Platte übertragen. Sehen Sie sich die Würmer mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass die meisten L4-Larven oder junge Erwachsene sind. L4-Larven haben einen ventralen hellen Fleck in der Mitte des Körpers. Junge Erwachsene werden etwas größer und haben keine klare Ort. </li><li> Gießen Sie den Wurm Kultur in sterile 50 ml Röhrchen und setzen Sie die Rohre in einem Reagenzglas Rack auf dem Labortisch. Lassen Sie die Würmer etwa 10 Minuten absetzen. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen oder Pipettieren. HINWEIS: Dieser Schritt kann es wichtig sein, unhatched Eier oder Würmer, die sich nicht entwickeln sich zu entfernen, weil sie langsamer als L4-Larven und junge Erwachsene werden zu begleichen. </li><li> Sammeln Sie alle Würmer in einem einzigen 50 ml Tube und wäscht mit NGM-Puffer mit 1% LB-Bouillon (NGM + LB) 3-4 mal, um Bakterien zu entfernen. Hinweis: Dies geschieht am besten in einem Ausschwingrotor zentrifugiert durch das Sammeln von Würmern bei 500 rcf für 30 sec und Austausch der Überstand mit frischen NGM + LB-Puffer. </li><li> Nach dem Waschen, füllen Sie den Schlauch mit NGM + LB-Puffer auf 50 ml und gießen Sie in ein benutzerdefiniertes Wurm Verzicht Kolben. Fügen Sie einen kleinen Rührstab und rühren, damit die Würmer ausgesetzt. Graf the Anzahl von Würmern in drei 5-ul Tropfen wie oben angegeben. Verdünnen mit NGM + LB, bis Sie 12-15 Würmer pro 5 ul Tropfen (~ 2,5-3,0 Würmer / ul) zu bekommen. HINWEIS: Ein Minimum von etwa 20 ml (60.000 Würmer) wird benötigt, um den Totraum der Abgabe Kolben und Spender Kassette zu füllen. Jeder 384-Well-Platte benötigt etwa 35.000 Würmer oder 11,5 ml suspendiert Würmer. </li><li> Legen Sie eine 10 pl Dispensierkassette und sterilisieren durch Grundierung mit 70% Ethanol. Spülen Sie das Ethanol durch Grundierung mit sterilem Wasser. </li><li> Führen Sie das Ende des Dispensierkassette in den Kolben, so dass es direkt über dem Rührstab ohne Unterbrechung der Bewegung ist. Stellen Sie sicher, dass die Würmer das ganze Kolben suspendiert bleiben. Programm der Spender bei niedriger Drehzahl mit 2 pre-Impulse zu verzichten. Prime und führen mindestens 10 ml suspendiert Würmer. Füllen Platten so schnell um die Würmer aus, sich in den Schlauch zu verhindern benötigt. </li><li> Seal die Platten mit atmungsaktivem Band. </li><li> Legen Sie die Platten auf einem Schütteltisch in einem Brutschrank bei der geeigneten Temperatur für Ihren Test. Stapeln Sie nicht die Platten. </li></ol> 4. Fluoreszenz-Analyse <ol><li> Legen Sie die Zieltafel in einem Mikroplatten-Reader, um die Fluoreszenz-Intensität der einzelnen Vertiefungen mit den entsprechenden Emissions-und Anregungswellenlänge (Filter für unseren Test: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em) zu messen. </li><li> Berechnen Sie das Verhältnis von GFP / RFP und normalisieren mit den Messwerten der Kontroll-Wells (ohne aktivierende Verbindung), um die genaue fache Differenz der Fluoreszenzintensität von einzelnen Behandlungen abgeleitet bestimmen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Unsere SKN-1-Test verwendet eine chromosomal integrierte Dual-Reporter-Stamm (VP596). Wie in Abbildung 1 gezeigt, ist die Zahl der Würmer auch, um die Lautstärke verzichtet korreliert. Wie in 2A und 2B, insgesamt GFP und RFP-Fluoreszenz pro Vertiefung dargestellt ist in hohem Maße reproduzierbar von Brunnen zu Brunnen über eine 384-Well-Platte. : GFP-Fluoreszenz ist linear auf PDOP-3 korreliert::: RFP über 384 Wells, wie in Abbildung 2C, un-induzierte Pgst-4 gezeigt. Wenn sie als ein Verhältnis von GFP / RFP ausgedrückt, wird Fluoreszenz hoch reproduzierbare von Brunnen zu Brunnen über eine 384-Well-Platte (vgl. Variationskoeffizient aus Abbildung 2D zu 2A) demonstriert die Fähigkeit der PDOP-3:: RFP Reporter Variabilität zu reduzieren. Wie in Abbildung 3, die Induktion der GFP gegenüber RFP mit A dargestellt SKN-1-aktivierenden Xenobiotika (38 uM Juglon) ist robust und sehr gut reproduzierbare über eine 384-Well-Platte. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Anzahl der Würmer zu Volumen verzichtet. Worms wurden auf etwa 2/μl verdünnt und in eine 24-Well-Platte für die manuelle Zählung mit einem Stereomikroskop. N = 8 Vertiefungen pro Volumen. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Summe Fluoreszenz von Würmern in einer 384-Well-Platte verzichtet reproduzierbar ist. Worms wurden auf etwa 2.5/μl und 30 ul verdünnt wurde in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte verzichtet. GFP (A) und RFP (B) Fluoreszenz von allen Wells hatte einen Variationskoeffizienten unter 9%. (C) GFP-Fluoreszenz ist stark an RFP Fluoreszenz korreliert. (D) Berechnung des Verhältnisses der GFP zu RFP reduziert der Variationskoeffizient unter 6% (A, B und D) durchgezogenen Linien zeigen die Mittel und gestrichelten Linien zeigen drei Standardabweichungen über oder unter dem Mittelwert. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> . Abbildung 3 Aktivierung Pgst-4:: GFP ist robust und konsistent. Etwa 75 L4 Würmer wurden in alle Wells einer 384-Well-Platte und 38 uM Juglon verzichtet war in jeder anderen Spalte hinzugefügt. GFP und RFP Fluoreszenz wurde nach 21 h Inkubation gemessen. Die mittlere relative Fluoreszenz-Verhältnisse aller Steuer (1,0) und Juglon Brunnen (8,9) sind mit durchgezogenen Linien markiert. Drei Standardabweichungen über der Kontrolle bedeuten, und unter dem Juglon meine, sind mit gestrichelten Linien markiert.

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<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).</li>
</ol>

Wir stellen eine Methode zur Kultivierung und Abgabe einer großen Anzahl von transgenen Nematoden. Die Ausrüstung für die Kultivierung von Würmern verwendet wird Standard für Labors, die molekulare Klonierung und der Liquid-Handling-und Fluoreszenz-Ausstattung ist Standard für Labors Verarbeitung einer großen Anzahl von Mikroplatten. Andere Methoden der Abgabe eine große Anzahl von Live-C elegans teure Partikel Sortieranlagen 19. Die Pgst-4:: GFP-Assay kann zum Screening niedermolekularer Mo...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> LB-Medium </td><td> Research Products International Corp </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Terrific Bouillon </td><td> Research Products International Corp </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ HT Multi-Mode Mikroplatten-Reader </td><td> BioTek </td><td></td><td> Filter: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Select Dispenser </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Worm Verzicht Kolben </td><td> Süd Scientific Inc., Micanopy, FL </td><td></td><td> Benutzerdefinierte montiert (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 Mikrotiterplatten </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Atmungsaktive Dichtband </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-Hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglon ist in DMSO gelösten </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans transgenen Stammes </td><td> Autor Labor </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP und PDOP-3:: RFP </td></tr></tbody></table>

high-throughput-screening und biosensorik mit fluorescent c. elegans die stämme

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-Throughput-Screening (HTS) ist ein leistungsstarkes Konzept zur Identifizierung von chemischen Modulatoren der biologischen Prozessen. Allerdings sind viele Verbindungen in Bildschirmen mit Zellkultur-Modellen identifiziert oft, dass sie giftig oder pharmakologisch inaktiv in vivo 1-2. Screening in ganz Tiermodelle können zur Vermeidung dieser Gefahren und optimieren den Weg zur Entwicklung von Medikamenten. C. elegans ist ein vielzelligen Organismus-Modell auch für HTS geeignet. Es ist klein (&lt;1 mm) und kann wirtschaftlich gezüchtet werden und abgefüllt in Flüssigkeiten. C. elegans ist auch einer der experimentell handhabbar Tiermodelle erlauben eine schnelle und detaillierte Identifizierung von Wirkstoffkandidaten mode-of-Aktion 3. Wir beschreiben ein Protokoll für die Kultivierung und Abgabe fluoreszierender Stämme von C. elegans für das Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken oder den Nachweis von Umweltschadstoffen, dass die Expression eines bestimmten Gens zu verändern. Eine große Anzahl von entwicklungspolitisch synchronisiert Würmer sind in flüssiger Kultur angebaut, geerntet, gewaschen und aufgehängt an einer definierten Dichte. Würmer sind dann schwarz, mit flachem Boden 384-well-Platten mit einer peristaltischen Flüssigkeitsspender aufgenommen. Kleine Moleküle aus einer chemischen Bibliothek oder Proben (z. B. Wasser, Nahrung oder Boden) kann in die Vertiefungen mit Würmern hinzugefügt werden. In vivo Echtzeit-Fluoreszenz-Intensität mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader gemessen. Diese Methode kann zu jeder induzierbaren Gens in C. angepasst werden elegans, für die eine geeignete Reporter zur Verfügung steht. Viele induzierbare Stress-und Entwicklungsbiologie transkriptionelle Wege sind gut in C definiert elegans und GFP transgenen Reporter-Stämme bereits für viele von ihnen 4 existieren. Wenn mit der entsprechenden transgenen Reporter kombiniert, können unsere Methode verwendet, um für die Bahn-Modulatoren Bildschirm oder robust Biosensor-Assays für Umweltschadstoffe zu entwickeln. Wir zeigen unseren C. elegans Kultur und Abgabe-Protokoll mit einem HTS-Assay wir entwickelt, um die C-Monitor elegans cap &#39;n&#39; Kragen Transkriptionsfaktor SKN-1. SKN-1 und seine Säuger Homolog Nrf2 aktivieren zytoprotektive Gene während der oxidative Stress und xenobiotische 5-10. Nrf2 schützt Säugetiere aus zahlreichen altersbedingten Erkrankungen wie Krebs, Neurodegeneration und chronischen Entzündungen und ist zu einem wichtigen chemotherapeutischen Ziel 11-13. Unser Test auf einem GFP transgenen Reporter für die SKN-1 Zielgen gst -4 14 basiert, die kodiert für ein Glutathion-S-Transferase 6. Die gst -4 Reporter ist auch ein Biosensor für Fremdstoff-und oxidative Chemikalien, die SKN-1 zu aktivieren und können verwendet werden, um niedrige Konzentrationen von Kontaminanten wie Acrylamid und Methyl-Quecksilber 15-16 zu erkennen.

Ein Verfahren zur Flüssig-Kultivierung und die Abgabe von<em&gt; C. elegans</em&gt; Stämme, fluoreszierenden Reporter-Proteinen wird beschrieben, dass keine teuren Sortieranlagen. Dieser Ansatz kann auf zahlreiche induzierbaren angewendet werden<em&gt; C. elegans</em&gt; Gene für die Wirkstoffforschung oder Biosensorik von Schadstoffen.

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

Das Hochdurchsatz-Screening (HTS) ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung chemischer Modulatoren biologischer Prozesse. Viele in ... identifizierte Verbindungen sind jedoch

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Kultivierung und Applikation fluoreszierender Stämme von CL gans für Hochdurchsatz-Screenings chemischer Bibliotheken oder zum Nachweis von Umweltkontaminanten, um die Wirkung chemischer oder umweltbedingter Substanzen auf die Aktivität spezifischer Proteine zu bewerten. Bei CL elgan werden bakterielle Kulturen zunächst als Nahrung für die Würmer und GFP-transgene Würmer vorbereitet. Synchronisierte Würmer werden kultiviert.0,5 bis 2 Millionen Würmer werden anschließend gesammelt, gewaschen und auf 3 84-Well-Mikrotiterplatten verteilt; danach werden kleine Moleküle aus einer chemischen Bibliothek oder Testproben wie Wasser, Nahrung oder Boden zu den Würmern gegeben. Schließlich wird die Fluoreszenz der Würmer mit einem Mikroplattenreader gemessen.Die Datenanalyse von Fluoreszenzintensitäten ermöglicht den Nachweis von kleinen Molekülen, die induzierbare transkriptionelle Signalwege modulieren, oder erlaubt die Detektion von Umweltkontaminanten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie in-vitro- oder Zellkultur-basierten Assays besteht darin, dass keine Zeit mit Verbindungen verschwendet wird, die in vivo toxisch oder inaktiv sind. Diese Hochdurchsatzmethode kann helfen, kleine Moleküle zu identifizieren, die vielfältige induzierbare Signalwege modulieren.Obwohl wir diese Methode für die Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle entwickelt haben, kann sie auch zur Biosensorik von Kontaminanten in Lebensmittel- und Umweltproben angewendet werden. Den Ablauf wird Andrew Dine, Techniker in meinem Labor, und Q long, Postdoktorand in meinem Labor, demonstrieren. Bereiten Sie das bakterielle Nematodenfutter rechtzeitig vor.Beginnen Sie mit der Inokulation von 500 Millilitern hervorragender Brühe, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin mit fünf Millilitern gesättigtem e coli. OP 50. Stellen Sie die Kultur auf einen Schüttler und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag die Kultur auf 10 Röhrchen mit je 50 Milliliter aufteilen. Anschließend die Röhrchen in eine gekühlte Zentrifuge geben und 20 Minuten bei 2.500 RCF zentrifugieren. Nach der Zentrifugation jedes bakterielle Pellet in 10 Milliliter flüssigem Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM resuspendieren.Schütteln Sie die Suspensionen horizontal. Verwenden Sie einen Plattenschüttler für 15 Minuten, um die Bakterien erneut in Suspension zu bringen. Zentrifugieren Sie danach die Bakterienkultur bei 2.500 RCF bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.Decantieren Sie das NGM und wiegen Sie das bakterielle Pellet. Geben Sie anschließend ein gleiches Volumen an NGM-Puffer hinzu und resuspendieren Sie die Pellets durch Vortexen. Schließlich portionieren Sie drei Milliliter der resuspendierten Bakterienkultur in 15-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie diese bei minus 20 Grad Celsius, bis sie benötigt werden.In dieser Demonstration wird als Beispiel der Effekt des stressinduzierenden Xeno Duke-Kredits auf den Transkriptionsfaktor Sskn one gemessen. Sskn one ist dafür bekannt, zytoprotektive Gene während oxidativen und xenobiotischen Stresses zu aktivieren. Es wird eine Großkultur der Trenchgenic c gans-Linie VP 5 96 vorbereitet, die zwei fluoreszierende Konstrukte enthält.VP 5 96 Würmer exprimieren sowohl den GST-four-Promotor, der GFP antreibt und zur Überwachung der Aktivität des Transkriptionsfaktors verwendet wird, als auch den DOP-three-Promotor, der RFP antreibt und als Standard für die Normalisierung der Wurmanzahl dient.DOP drei ist der Promotor für einen Dopaminrezeptor und wird konstitutiv in Neuronen im gesamten Körper exprimiert. Im Beispiel aktiviert das Xenobion stark sskn eins und erhöht die Menge an GFP, das vom GST vier-Promotor exprimiert wird. Um Kulturen vorzubereiten, mischen Sie zunächst 150 Milliliter N NGM-Puffer, 1,5 Milliliter LB 150, Mikroliter einer einmolaren Cholesterinlösung und 75 Mikroliter einer 100 Milligramm pro Milliliter-Streptomycinlösung. Das Hinzufügen des LB verhindert, dass die Würmer an Glas- und Plastikgefäßen haften, doch diese Menge reicht nicht aus, um das bakterielle Wachstum zu unterstützen.Filtern Sie die Mischung zur Sterilisation und geben Sie sie in einen sterilen Ein-Liter-Kolben. Stellen Sie den Kolben beiseite, um die Eier aus den GR-Adultwürmern freizusetzen. Entfernen Sie die Bakterien von den Würmern durch Zentrifugation und Ersetzen des NGM-Mediums, bis das Überstand klar ist. Waschen Sie die Würmer ein zweites Mal, indem Sie sie in sterilem Wasser resuspendieren, erneut zentrifugieren und nach dem Zentrifugieren fortfahren.Entfernen Sie das Überstand und füllen Sie das Röhrchen mit 3,75 Millilitern steriler Wasser. Geben Sie ein Milliliter Haushaltsbleiche und 250 Mikroliter 10 normales Natriumhydroxid hinzu und mischen Sie sofort durch fünf bis sechsmaliges Umstülpen. Stellen Sie das Röhrchen nach vierminütiger Bleicheexposition der Würmer in einen Rotator.Stellen Sie das Röhrchen unter ein Stereomikroskop. Die meisten erwachsenen Würmer sollten liegen. Schütteln Sie das Röhrchen kräftig 15 bis 20 Mal, um verbliebene erwachsene Würmer nach der Lyse zu lösen. Nach insgesamt fünf Minuten fügen Sie steriles Wasser hinzu, bis das Röhrchen voll ist.Mischen Sie durch fünf- bis sechsmaliges Umstülpen, um die Eier zu sammeln. Zentrifugieren Sie das Gefäß eine Minute lang bei 500 RCF. Waschen Sie die Eier dreimal mit Resus, indem Sie sie in 10 Milliliter sterilem Wasser resuspendieren, zentrifugieren und das Überstand entfernen.Als Nächstes verdünnen Sie eine 100 µL Probe der Eier 100-fach, indem Sie 10 mL NGM-Puffer hinzufügen. Pipettieren Sie anschließend drei Aliquots zu je fünf µL unter dem Mikroskop auf den Deckel einer Petrischale. Zählen Sie die Anzahl der Eier in drei separaten Aliquots zu je fünf µL.Um die Gesamtanzahl der Eier abzuschätzen. Geben Sie 200.000 bis 2 Millionen Eier in den Kolben mit NGM-Puffer und schütteln Sie die Kultur bei 100 U/min bei 20 Grad Celsius. Mindestens 16 Stunden nach Zugabe der Eier zum Kolben verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um etwa 0,5 Milliliter der suspendierten Wurmkultur zu entnehmen.Pipettieren Sie drei Tropfen à fünf Mikroliter auf den sterilen Deckel einer Petrischale. Legen Sie den Deckel für ein bis zwei Minuten in einen Minus-20-Grad-Gefrierschrank, um die Würmer zu paralysieren, sobald die Würmer paralysiert sind. Zählen Sie mithilfe eines Stereomikroskops die durchschnittliche Anzahl lebend geschlüpfter Würmer pro fünf Mikroliter, um die Gesamtanzahl abzuschätzen.Tauen Sie die zuvor zubereitete gefrorene OP 50-Bakterienkultur auf, indem Sie sie einige Minuten lang auf den Labortisch stellen. Geben Sie anschließend drei Milliliter 50%ige OP 50 pro 500.000 geschlüpfte Würmer hinzu. Schütteln Sie den Kolben bei 100 U/min und 20 Grad Celsius.Die Würmer entwickeln sich in etwa 51 Stunden zu L4-Larven und jungen adulten Stadien. Überwachen Sie die Menge der Bakterien während der Inkubation durch visuelle Inspektion. Fügen Sie weitere Bakterien hinzu, wenn das Medium klar wird.Überführen Sie mit einer sterilen serologischen Pipette etwa 0,5 Milliliter der suspendierten Wurmkultur auf eine standardmäßige NGM-Agarplatte. Untersuchen Sie die Würmer mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Mehrheit in der Larvenstufe L4 und als junge Erwachsene unter Hellfeldmikroskopie befindet; Larven der Stufe L4 weisen eine klare ventrale Stelle in der Körpermitte auf. Junge Erwachsene sind leicht größer und besitzen keine klare Stelle.Ziehen Sie als Nächstes die Wurmkultur in sterile 50-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie die Röhrchen in einem Reagenzglasständer in der Abzugshaube ab und lassen Sie sie ruhen, um unbefruchtete Eier oder Würmer, die sich nicht entwickeln, abzusetzen. Diese setzen sich langsamer ab als entwickelte Würmer.Nach 10 Minuten das Überstand entfernen, der ungehäutete und nicht entwickelte Würmer enthält, durch Aspiration von etwa 10 Milliliter NGM-Puffer zu jedem Pellet und die Würmer durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen suspendieren. Alle Würmer in einem einzigen 50-Milliliter-Röhrchen sammeln. Im Schwenkkorbzentrifugen bei 500 RCF für 30 Sekunden zentrifugieren.Suspension der Würmer anschließend in 50 Milliliter NGM mit 1 % LB zur Wäsche. Dieser Schritt ist drei bis viermal zu wiederholen, um die Bakterien nach der Wäsche zu entfernen. Das Gefäß mit NGM plus LB-Puffer auf 50 Milliliter auffüllen.Geben Sie dies in einen speziellen Wurm-Abgabekolben mit einem Rührstab und stellen Sie ihn auf ein Rührgerät. Es werden mindestens etwa 20 Milliliter oder 60.000 Würmer benötigt, um den Totraum des Abgabekolbens und der Dosierkassette zu füllen. Zählen Sie die Anzahl der Würmer in drei Tropfen zu je fünf Mikroliter, wie zuvor gezeigt.Nach dem Zählen an NGM plus LB auf eine Konzentration von 12 bis 15 Würmern pro Tropfen von fünf Mikroliter benötigt jede 384-Well-Platte etwa 35.000 Würmer oder 11,5 Milliliter suspendierte Würmer. Laden Sie eine 10-Mikroliter-Dosierkassette in den Dosierer ein und sterilisieren Sie sie, indem Sie sie mit 70 %igem Ethanol spülen. Spülen Sie das Ethanol aus, indem Sie mit sterilem Wasser nachspülen.Führen Sie das Ende der Dosierkassette in den Kolben ein, sodass sie sich knapp über dem Rührstab befindet, ohne dessen Bewegung zu stören. Achten Sie darauf, dass die Würmer während des gesamten Vorgangs in Suspension bleiben. Programmieren Sie den Dosierer so, dass er die Würmer mit niedriger Geschwindigkeit dosiert, wobei zwei Vorimpulse zum Ansaugen erforderlich sind, und geben Sie mindestens 10 Milliliter der suspendierten Würmer aus.Füllen Sie die Mikrotiterplatten, die bereits Testverbindungen enthalten sollten, schnell, um zu verhindern, dass sich die Würmer in den Schläuchen absetzen. Hier liegt die zuvor auf die Mikrotiterplatte aufgebrachte Testverbindung Glow vor. Versiegeln Sie die Platten mit atmungsaktivem Klebeband, um zu verhindern, dass sich Staub in den Vertiefungen ansammelt.Stellen Sie die Platten auf eine schüttelnde Plattform in einen Inkubator bei der für den Assay geeigneten Temperatur. Stapeln Sie die Platten nicht, da dies die Luftzirkulation beeinträchtigen kann. Führen Sie die Zielplatte in einen Mikroplattenreader ein, um die Fluoreszenzintensität jedes Wells mit den geeigneten Emissions- und Anregungswellenlängen zu messen.Die für GFP verwendeten Filter sind eine Anregung bei 485 und eine Emission bei 528. Die Filter für RFP sind eine Anregung bei 540 und eine Emission bei 590. Nach dem Auslesen der Platte berechnen Sie das Verhältnis von GFP zu RFP und normalisieren es mit den Messwerten der Kontrollgefäße, die die aktivierende Verbindung nicht enthalten, um den genauen Faltunterschied der Fluoreszenzintensität zu ermitteln, der sich aus den einzelnen Behandlungen ergibt.Der hier gezeigte SSKN-One-Assay verwendet einen chromosomal integrierten dualen Reportereinbau, eine Stamm, bei dem die Würmer manuell mit einem Stereomikroskop gezählt wurden. Die Anzahl der Würmer korrelierte mit dem dispensierten Volumen mit einem Bestimmtheitsmaß (R-Quadrat) von 0,94 und einem p-Wert von weniger als 0,0001. Dies zeigt, dass die Anzahl der in jede Vertiefung gebrachten Würmer durch Anpassung des dispensierten Volumens gesteuert werden kann.Die Gesamt-GFP-Fluoreszenz pro Vertiefung, dargestellt links, und die RFP-Fluoreszenz pro Vertiefung, dargestellt rechts, ist in diesen Abbildungen von Vertiefung zu Vertiefung über eine 3 84-Vertiefungs-Platte hinweg hochgradig reproduzierbar. XS zeigen die relative Fluoreszenz, die in jeder Vertiefung gemessen wurde. Durchgezogene Linien kennzeichnen die Mittelwerte, gestrichelte Linien zeigen drei Standardabweichungen oberhalb oder unterhalb des Mittelwerts der Fluoreszenz aller Vertiefungen; der Variationskoeffizient lag unter 9 %. Wie in dieser Abbildung dargestellt, besteht zwischen der GFP-Fluoreszenz des GST-vier-Promotors und der RFP-Fluoreszenz des DOP-drei-Promotors über 3 84 Vertiefungen eine lineare Korrelation mit einem Bestimmtheitsmaß (R-Quadrat) von 0,62 und einem p-Wert von weniger als 0,0001.Daher kann der nicht induzierbare RFP-Reporter zur Normalisierung des induzierbaren GFP-Reporters verwendet werden. Wenn ein Verhältnis der GFP- zu RFP-Fluoreszenz ermittelt wird, ist dieses von Vertiefung zu Vertiefung auf einer 384-Vertiefungs-Platte äußerst reproduzierbar.Die Berechnung des Verhältnisses von GFP zu RFP verringerte den Variationskoeffizienten auf unter 6 %, was die Fähigkeit des DOP-Drei-Promotor-RFP-Reporters zeigt, die Variabilität wie hier dargestellt zu reduzieren. Die Induktion von GFP relativ zu RFP durch einen SK N eins aktivierenden Xenobiotikum ist robust und über eine 384-Well-Platte hinweg hochgradig reproduzierbar; die mittleren relativen Fluoreszenzverhältnisse aller Kontroll- und dlo-Gruben sind mit durchgezogenen Linien markiert. Drei Standardabweichungen oberhalb des Kontrollmittelwerts und unterhalb des dlo-Mittelwerts sind mit gestrichelten Linien gekennzeichnet.Wenn man einmal Erfahrung gesammelt hat, dauert das Einrichten einer Wurmkultur etwa eine Stunde am ersten Tag sowie die Sammlung und Verteilung. Das Sammeln und Verteilen der Würmer dauert etwa zwei Stunden, wenn es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, mit mindestens 60.000 Würmern zu beginnen und sie während der Verteilung in Suspension zu halten. Nach dieser Anleitung können Bildschirme mit anderen, beispielsweise Reportersystemen für andere induzierbare Signalwege, durchgeführt werden, um Modulatoren für andere Signalwege nach deren Entwicklung zu ermitteln.Diese Technik kann für Forscher in den Bereichen Hochdurchsatz-Screening und Biosensorik den Weg ebnen, um schnell kleine Moleküle zu identifizieren, die Signalwege modulieren, oder um Umweltkontaminanten nachzuweisen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fluoreszierende elegan-Stämme kultiviert, dosiert und misst, um entweder induzierbare transkriptionelle Signalwege im Hochdurchsatz-Screening zu untersuchen oder mehrere Proben auf Umweltkontaminanten zu testen.

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