High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

Dieses Video zeigt eine Methode zur Kultivierung und Abgabe von fluoreszierenden Stämmen von Chemikalienstämmen für das Hochdurchsatz-Screening chemischer Bibliotheken oder den Nachweis von Umweltkontaminanten, um die Wirkung von chemischen oder Umwelteinflüssen auf die spezifische Proteinaktivität zu bewerten. Bei CL elgan werden zunächst Bakterienkulturen als Nahrung für die Würmer und GFP-transgen hergestellt. Synchronisierte Würmer werden kultiviert.

0,5 bis 2 Millionen Würmer werden dann gesammelt, gewaschen und in 3 84 abgegeben. Nun, Mikrotiterplatten, dann kleine Moleküle aus einer chemischen Bibliothek oder Testproben wie Wasser, Nahrung oder Erde werden den Würmern zugesetzt. Zum Schluss wird die Fluoreszenz der Würmer mit einem Mikroplatten-Reader gemessen.

Die Datenanalyse von Fluoreszenzintensitäten zeigt kleine Moleküle, die induzierbare Transkriptionswege modulieren oder den Nachweis von Umweltschadstoffen ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. In-vitro- und Zellkultur-basierten Assays, besteht darin, dass keine Zeit mit Verbindungen verschwendet wird, die in vivo toxisch oder inaktiv sind. Diese Hochdurchsatzmethode kann helfen, kleine Moleküle zu identifizieren, die verschiedene induzierbare Signalwege modulieren.

Obwohl wir diese Methode für das Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülbibliotheken entwickelt haben, kann sie auch auf die Biosensorik von Kontaminanten in Lebensmittel- und Umweltproben angewendet werden. Das Verfahren wird von Andrew Dine, einem Techniker in meinem Labor und Q Long, einem Postdoc für mein Labor, demonstriert. Bereiten Sie bakterielles Wurmfutter im Voraus zu.

Beginnen Sie mit der Impfung von 500 Millilitern hervorragender Brühe, ergänzt mit 50 Mikrogramm Streptomycin pro Milliliter mit fünf Millilitern gesättigten E-Coli. OP 50. Gib die Kultur auf einen Shaker und züchte sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag teilen Sie die Kultur in 10 50-Milliliter-Röhrchen auf. Legen Sie dann die Röhrchen in eine gekühlte Zentrifuge und drehen Sie sie 20 Minuten lang bei 2.500 RCF. Nach dem Schleudern der Resus suspendieren Sie jedes Bakterienpellet in 10 Millilitern flüssigem Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM.

Schütteln Sie die Aufhängungen waagerecht. Ein Bodenschüttler für 15 Minuten, um die Bakterien wieder zu suspendieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Bakterienkultur bei 2.500 RCF bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.

Dekantieren Sie das NGM und wiegen Sie das Bakterienpellet. Fügen Sie dann ein gleiches Volumen NGM-Puffer hinzu und resuspendieren Sie die Pellets durch Vortexen. Zum Schluss aliquotieren Sie drei Milliliter der resuspendierten Bakterienkultur in 15-Milliliter-Röhrchen und lagern sie bei minus 20 Grad Celsius, bis sie benötigt werden.

In dieser Demonstration wird beispielhaft die Wirkung des stressinduzierenden Xeno-Duke-Darlehens auf den Transkriptionsfaktor Sskn one gemessen. Es ist bekannt, dass Sskn one zytoprotektive Gene bei oxidativem und Xenobi-Stress aktiviert. Es wird eine großtechnische Kultur der Trenchgenic c gans-Linie VP 5 96 hergestellt, die zwei fluoreszierende Konstrukte trägt.

VP 5 96 Würmer exprimieren sowohl den GST vier Promotor, der GFP antreibt, der zur Überwachung der Aktivität des Transkriptionsfaktors verwendet wird. Sskn ein und der DOP drei Promoter fahren. RFP wird als Standard für die Normalisierung von Wurmnummern verwendet.

DOP drei ist der Promotor für einen Dopaminrezeptor und wird konstitutiv in Neuronen im ganzen Körper exprimiert. In dem Beispiel, das Xenobi lon stark aktiviert sskn one und erhöht die Menge an GFP, die vom GS T 4-Promotor exprimiert wird, beginnen Sie mit der Kombination von 150 Millilitern N NGM-Puffer, 1,5 Millilitern LB 150, Mikrolitern eines molaren Cholesterins und 75 Mikrolitern von 100 Milligramm pro Milliliter. Streptomycin. Die Zugabe des LB hilft, zu verhindern, dass die Würmer an den Gläsern und Kunststoffen haften bleiben, aber diese Menge reicht nicht aus, um das Bakterienwachstum zu unterstützen.

Filtrieren Sie, um die Mischung zu sterilisieren, geben Sie sie dann in einen sterilen Ein-Liter-Kolben und stellen Sie den Kolben beiseite, um die Eier von erwachsenen GR-Würmern freizusetzen. Waschen Sie die Bakterien von den Würmern, indem Sie sie zentrifugieren und das NGM-Medium austauschen, bis das Supinat klar ist. Waschen Sie die Würmer ein zweites Mal, indem Sie sie nach dem Schleudern erneut in einer sterilen Wasserzentrifuge aufhängen.

Entfernen Sie das Supinat und füllen Sie das Röhrchen mit 3,75 Millilitern sterilem Wasser. Fügen Sie einen Milliliter Haushaltsbleiche und 250 Mikroliter 10 normales Natriumhydroxid hinzu, das sofort durch Inversion fünf- bis sechsmal gemischt wird. Lege das Röhrchen in einen Rotator, nachdem die Würmer vier Minuten lang Bleiche ausgesetzt waren.

Legen Sie den Tubus unter ein Stereomikroskop. Die meisten Erwachsenen sollten Lügen sein. Schütteln Sie das Röhrchen 15 bis 20 Mal kräftig, um die verbleibenden erwachsenen Würmer nach der Lyse für insgesamt fünf Minuten zu beseitigen, und fügen Sie steriles Wasser hinzu, bis das Röhrchen voll ist.

Fünf- bis sechsmal durch Inversion mischen, um die Eier zu sammeln. Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Minute lang bei 500 RCF. Waschen Sie die Eier dreimal mit Resus, biegen Sie sie in 10 Milliliter sterilem Wasser, drehen Sie sie und entfernen Sie das Supinat.

Als nächstes verdünnen Sie eine 100-Mikroliter-Probe der Eier um das 100-fache, indem Sie 10 Milliliter NGM-Puffer hinzufügen. Pipettieren Sie dann drei Fünf-Mikroliter-Aliquots unter einem Mikroskop auf einen Deckel der Petrischale. Zählen Sie die Anzahl der Eier in drei separaten Fünf-Mikroliter-Aliquoten.

Um die Gesamtzahl der Eier zu schätzen. Geben Sie 200.000 bis 2 Millionen Eier in den Kolben mit NGM-Puffer und schütteln Sie die Kultur bei 100 U/min bei 20 Grad Celsius. Mindestens 16 Stunden, nachdem die Eier in den Kolben gegeben wurden, wird mit einer sterilen serologischen Pipette etwa 0,5 Milliliter der suspendierten Wurmkultur entfernt.

Pipettieren Sie drei, fünf Mikroliter Tropfen auf den sterilen Deckel einer Petrischale. Lege den Deckel für ein bis zwei Minuten in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad, um die Würmer zu lähmen, sobald die Würmer gelähmt sind. Zählen Sie die durchschnittliche Anzahl lebender geschlüpfter Würmer pro fünf Mikroliter mit einem Stereomikroskop, um die Gesamtzahl zu schätzen.

Tauen Sie die zuvor vorbereitete gefrorene OP 50-Bakterienkultur auf, indem Sie sie einige Minuten lang auf eine Bank legen. Fügen Sie dann drei Milliliter 50%OP 50 pro 500.000 geschlüpfte Würmer hinzu. Schütteln Sie den Kolben 100 U/min bei 20 Grad Celsius.

Die Würmer entwickeln sich in etwa 51 Stunden zu L-4-Larven und jungen adulten Stadien. Überwachen Sie die Menge an Bakterien während der gesamten Inkubation durch visuelle Inspektion. Fügen Sie weitere Bakterien hinzu, wenn das Medium klar wird.

Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um etwa 0,5 Milliliter der suspendierten Wurmkultur auf eine Standard-NGM-Agarplatte zu übertragen. Betrachten Sie die Würmer mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass es sich bei den meisten um L-Vier-Larven und junge Erwachsene unter Hellfeldmikroskopie handelt, L-Vier-Larven haben einen ventralen klaren Fleck in der Mitte des Körpers. Junge Erwachsene werden etwas größer sein und keinen freien Fleck haben.

Als nächstes ziehen Sie die Wurmkultur in sterile 50-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie die Röhrchen in ein Reagenzglasgestell in der Haube und lassen Sie sie ungeschlüpfte Eier oder Würmer absetzen, die sich nicht entwickeln. Siedeln sich langsamer an als entwickelte Würmer.

Entfernen Sie nach 10 Minuten das Supinat, das noch nicht geschlüpfte und unentwickelte Würmer enthält, indem Sie etwa 10 Milliliter NGM-Puffer an jedes Pellet ansaugen und die Würmer durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen suspendieren. Sammle alle Würmer in einer einzigen 50-Milliliter-Tube. In der schwingenden Schaufelzentrifuge bei 500 RCF 30 Sekunden lang drehen.

Dann resuspendieren Sie die Würmer in 50 Millilitern NGM mit 1%lb, um sie zu waschen. Wiederholen Sie dies, waschen Sie drei- bis viermal, um die Bakterien nach dem Waschen zu entfernen. Füllen Sie die Tube mit NGM plus LB Puffer auf 50 Milliliter.

Gießen Sie diesen in einen speziell angefertigten Wurmspender an einem Rührstab und legen Sie ihn auf eine Rührplatte. Mindestens etwa 20 Milliliter oder 60.000 Würmer werden benötigt, um den Totraum an der Dosierkolben- und Spenderkassette zu füllen. Zählen Sie die Anzahl der Würmer in drei Fünf-Mikroliter-Tropfen, wie zuvor gezeigt.

Nach Zählung bei NGM plus LB bis zu einer Konzentration von 12 bis 15 Würmern pro Fünf-Mikroliter-Tropfen pro 3,84-Well-Platte werden etwa 35.000 Würmer oder 11,5 Milliliter suspendierte Würmer benötigt. Legen Sie eine 10-Mikroliter-Dosierkassette in den Spender und sterilisieren Sie sie durch Grundierung mit 70%igem Ethanol. Spülen Sie das Ethanol aus, indem Sie es mit sterilem Wasser grundieren.

Führen Sie das Ende der Dosierkassette so in den Kolben ein, dass es sich knapp über dem Rührstab befindet, ohne dessen Bewegung zu unterbrechen. Es ist darauf zu achten, dass die Würmer im gesamten Kolben aufgehängt bleiben. Programmieren Sie den Dispenser so, dass er Würmer bei niedriger Geschwindigkeit mit zwei Vorpulsen abgibt, die mindestens 10 Milliliter suspendierte Würmer ansaugen und laufen lassen.

Füllen Sie die Mikrotiterplatten, die bereits Testverbindungen enthalten sollten, schnell, um zu verhindern, dass sich die Würmer in den Schläuchen absetzen. Hier kommt die zuvor auf die Mikrotiterplatte geladene Testmasse zur Verfügung. Glühen. Versiegeln Sie die Platten mit atmungsaktivem Klebeband, um zu verhindern, dass sich Staub in den Vertiefungen ansammelt.

Legen Sie die Platten auf eine Schüttelplattform in einem Inkubator bei der für den Assay geeigneten Temperatur. Stapeln Sie die Platten nicht, da dies den Luftstrom einschränken kann. Platzieren Sie die Zielplatte in einem Mikroplatten-Reader, um die Fluoreszenzintensität jedes Wells mit den entsprechenden Emissions- und Anregungswellenlängen zu messen.

Die für GFP verwendeten Filter sind die Anregung bei 4 85 und die Emission bei 5 28. Die Filter für RFP sind Anregung bei fünf 40 und Emission bei fünf 90. Berechnen Sie nach dem Ablesen der Platte das Verhältnis von GFP zu RFP und normalisieren Sie es mit den Messwerten der Kontrollvertiefungen, die die aktivierende Verbindung nicht enthalten, um die genaue Faltendifferenz der Fluoreszenzintensität zu bestimmen, die aus einzelnen Behandlungen abgeleitet wurde.

Der hier gezeigte SSKN one Assay verwendet einen chromosomal integrierten Dual-Report, einen Stamm, bei dem die Würmer manuell mit einem Stereomikroskop gezählt wurden. Die Anzahl der Würmer korrelierte mit dem abgegebenen Volumen mit einem R-Quadrat-Wert von 0,94 und einem p-Wert von weniger als 0,0001. Dies bedeutet, dass die Anzahl der Würmer, die in jede Vertiefung abgegeben werden, durch Anpassen des abgegebenen Volumens gesteuert werden kann.

Die gesamte GFP-Fluoreszenz pro Well, die links dargestellt ist, und die RFP-Fluoreszenz pro Well, die rechts dargestellt ist, sind in diesen Abbildungen von Well zu Well über eine 3 84-Well-Platte hochgradig reproduzierbar. XS gibt die relative Fluoreszenz an, die in jeder Vertiefung gemessen wird. Durchgezogene Linien zeigen die Mittelwerte und gestrichelte Linien zeigen drei Standardabweichungen über oder unter der mittleren Fluoreszenz aller Wells an, die einen Variationskoeffizienten von weniger als 9 % aufwiesen. Wie in dieser Abbildung gezeigt, ist die GFP-Fluoreszenz aus dem GST-Vier-Promotor linear mit der RFP-Fluoreszenz aus dem DOP-3-Promotor über 3 84 Wells korreliert, mit einem R-Quadrat-Wert von 0,62 und einem p-Wert von weniger als 0,0001.

Daher kann der nicht induzierbare RFP-Reporter verwendet werden, um das induzierbare zu normalisieren. GFP-Reporter. Wenn ein Verhältnis von GFP zu RFP exprimiert wird, wird die Fluoreszenz von Well zu Well über eine 3 84 Well-Platte hochgradig reproduzierbar.

Die Berechnung des Verhältnisses von GFP zu RFP reduzierte den Variationskoeffizienten auf unter 6 %, was die Fähigkeit des RFP-Reporters DOP mit drei Promotoren zeigt, die Variabilität zu reduzieren, wie hier gezeigt. Die Induktion von GFP im Verhältnis zu RFP mit einem SK N aktivierenden Xeno-Biotikum ist robust und hochgradig reproduzierbar über eine 3 84-Well-Platte, die mittleren relativen Fluoreszenzverhältnisse aller Kontroll- und Due-GLO-Wells sind mit durchgezogenen Linien markiert. Drei Standardabweichungen über dem Kontrollmittelwert und unter dem dlo-Mittelwert sind mit gestrichelten Linien markiert.

Sobald Sie es gemeistert haben, kann das Starten einer Wurmkultur am ersten Tag etwa eine Stunde lang erfolgen und dann eingesammelt und ausgegeben werden. Ein Wurmkampf kann etwa zwei Stunden durchgeführt werden, wenn er richtig gemacht wird. Während der Versuch dieses Verfahrens wichtig ist, daran zu denken, mit mindestens 60.000 Würmern zu beginnen und sie während der Abgabe in der Schwebe zu halten, können nach diesem Verfahren Screenings mit anderen, z. B. Berichtsstrings für andere induzierbare Signalwege durchgeführt werden, um Modulatoren für andere Signalwege nach seiner Entwicklung zu entwickeln.

Diese Technik kann Forschern in den Bereichen Hochdurchsatz-Screening und Biosensorik den Weg ebnen, um kleine molekulare Signalweg-Modulatoren schnell zu identifizieren oder Umweltschadstoffe nachzuweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie fluoreszierende Eleganstämme für das Hochdurchsatz-Screening induzierbarer Transkriptionswege kultiviert und gemessen werden, um induzierbare Transkriptionswege zu untersuchen oder mehrere Proben auf Umweltschadstoffe zu testen.