Name: Eine Nasennebenschutz-Protokoll für die Untersuchung Verhaltensplastizität bei Insekten: Anwendung auf Grund, Biomedizinische und Agrarforschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Lernen Sie das Proboscis-Extension-Response-Protokoll zur Untersuchung von Lernverhalten bei Honigbienen. Diese Methode ermöglicht die quantifizierbare Analyse von Verhaltensplastizität in der Verhaltensbiologie.

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(; BH Smith Co-PI J Trumble PI) und der Arizona State University Diese Forschung wurde unterstützt durch Mittel aus NIH NCRR (R01 RR014166 BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS Co-PI), dem US-Landwirtschaftsministerium unterstützt. Die Finanzierung für den Workshop für Studenten (Daten in Abbildung 4) zu trainieren wurde von der Science Foundation of Chile zur Verfügung gestellt.

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<li>Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+and+non-associative+plasticity+in+kenyon+cells+of+the+honeybee+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body.</a> Front Syst Neurosci. 2, (2008).</li>
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<li>Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+blocking+in+odorant+mixtures%3A+an+increase+but+not+a+decrease+in+intensity+of+reinforcement+produces+unblocking%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An analysis of blocking in odorant mixtures: an increase but not a decrease in intensity of reinforcement produces unblocking.</a> Behav Neurosci. 111, 57-69 (1997).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Dieses Protokoll präsentierte zwei zuverlässige Methoden zur Konditionierung mit der pro Verfahren. Dies sind zwei von mehreren Verfahren, die erfolgreich eingesetzt 27, 21 haben. Wir beschäftigen Methode 2 für alle experimentellen Studien mit an, wie es durchgängig zuverlässig ist, auch über verschiedene Experimentatoren. Das gleiche Grundverfahren hat zu viele verschiedene Arten von Studien mit Honigbienen, einschließlich der Verwendung von unterschiedlichen Stimuli Anlage und unterschiedliche Verhaltensreflexe angepasst. Es wurde auch auf Untersuchungen über die genetische Basis von Unterschieden in der Lern 28,29, die physiologische Korrelate der geruchlichen Wahrnehmung und Gedächtnis im Gehirn 13,14,30 verbunden worden, und die modulierende und molekularen genetischen Grundlagen des Verhaltens 15,16,31 . Aufgrund der fortgeschrittenen Kenntnisse der ökologischen Relevanz von olfaktorischen Lernen für Bienen, die vor über 100 Jahren mit den ersten Studien, die von Karl von Frisch gestartet <sup&gt; 31, können die Ergebnisse von PRO leicht zu Lebensbedarf einer Kolonie verbunden werden. In jüngster Zeit hat es einen landwirtschaftlichen Studie angepaßt worden, um die subletale Verhaltenswirkungen von Pestiziden und Umweltgiften 17 zu untersuchen. Die prinzipielle Vorgehensweise ist leistungsstark, dass es angewendet werden, um Probleme in anderen Spezies als auch untersucht werden. Zwei Schmetterlingsarten, Manduca sexta und Spodoptera littoralis, haben in Studien und PRO verwendet worden, um die neuronalen Grundlagen der Geruchsidentifikation und Geruchs Lernfähigkeit 32,33 jeder einzelnen Art zu untersuchen. PRO Experimente mit Fruchtfliegen haben viele Einblicke in die molekularen Signalkaskaden in Chemosensorik und Lern 34 beteiligt sind. Und PER wurde kürzlich zur Gewöhnung auf dem Floh (Rhodnius prolixus) 35, eine wichtige Krankheitsüberträger zu studieren. Im Allgemeinen ist das Verfahren robust gegenüber Änderungen der Verfahren; die Verwendung von different Methoden wird wahrscheinlich produzieren die gleiche relative Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen. Trotz der relativ einfaches Verfahren, mehrere Probleme können manchmal verhindern Honigbienen vom Lernen die geruchs Saccharose Vereins. Die folgenden Themen sind mögliche Änderungen des Protokolls und einige der Probleme, die während PRO Anlage entstehen können. Überlegungen zu Anzahl und Art der Prüfungen in der Anlage Protokoll Jede Lern ​​Protokoll Exposition der Bienen zu einer Reihe von Studien in der Akquisitionsphase erfordern. Diese Anzahl hängt weitgehend von der Schwierigkeit der Aufgabe. Honigbienen können eine einfache Aufgabe nach einem einzigen Versuch zu lernen, aber sie müssen von mindestens drei Studien zur langfristigen Gedächtnisbildung induzieren. Wie erwartet, wird die Honigbienen deutlich mehr Studien erforderlich, um eine schwierige Aufgabe angemessen zu lernen. Im Allgemeinen gibt es eine maximale Anzahl von Versuchen über die Bienen nicht mehr wesentlich verbessern dieir Leistung. Dieses Maximum hängt von der spezifischen Aufgabe, den Geruch Arten und Konzentrationen und der Saccharose-Konzentration. Bei der Verwendung von mehr als einer Art von Versuch mit verschiedenen Gerüchen, präsentieren die verschiedenen Versuchstypen in einer Pseudo-Zufallsfolge, um die Bienen aus Auswendiglernen eine einfache Abfolge von Geruch Präsentationen anstatt zu lernen, die Unterschiede zwischen den Gerüchen 36 zu halten. In diesen Pseudo-Zufallsfolgen, muss eine gleiche Anzahl von Versuchen für jedes der Geruchsarten sein. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit einer Studie mit einem Geruchstyp durch Vor und nach dem gleichen Geruch oder eine der anderen Gerüche, muss für alle Gerüche werden. Für zwei Gerüche - A und B - nutzen Sie die folgende Sequenz: ABBABAAB. Über acht Studien jeder Geruch wird vier Mal vorgestellt. Verketten identischen Sequenzen, um die gewünschte Anzahl von Studien für jede Geruchs erreichen. Unabhängig von der experimentellen Design gibt es einige Parameter, bleiben müssenKonstante, um die Lern ​​optimieren. Die Überlappung zwischen der CS und dem US ist entscheidend für die effektive Anlage. Die Inter-Prozess-Intervall (Abbildung 1, Tabelle 1) muss konstant sein und optimiert werden, weil Unregelmäßigkeiten oder eine zu kurze oder zu lange zwischenProbeIntervall kann deutlich die Wirksamkeit des Protokolls 1 Anlage beeinflussen. Überlegungen über die Bedeutung und Gestaltung von Behavioral Testing Trials Antworten während der &quot;Erfassungsphase&quot; von einem Experiment, wenn die CS und US werden gemeinsam präsentiert aufgezeichnet, kann nützlich sein. Doch Vorsicht, dass die Geruchspräsentationsbedingungen können von einer Art von Studie zu Land unterschiedlich. Während verstärkt Studien wird der Geruch gefolgt von Sucrose in Kombination mit einem visuellen Reiz (Bewegung der Einrichtung zum Abgeben des Tröpfchens Saccharose), die Reaktion der Bienen beeinflussen können dargestellt. Und die Bienen haben nur 3 Sekundens, um eine Antwort (Abbildung 1 von vier Sekunden nach Geruch Stimulation minus einer Sekunde Überlappung mit Saccharose Präsentation) zu zeigen. Wenn das Experiment beinhaltet die Bienen lernen, zwei Gerüche zu unterscheiden (zB verstärkte und unverstärkte), der unverstärkten Geruch auf alternative Studien vorgestellt tritt ohne den visuellen Reiz der Belohnung Präsentation und die Bienen haben die vollen vier Sekunden, um zu reagieren. Daher werden die Reaktionen auf die beiden Gerüche nicht während der Akquisition vollständig vergleichbar. Mit jedem Anlage Protokoll, nicht allein auf Erwerb Kurven 1 angewiesen sind. Um besser zu ermitteln, was die Bienen gelernt haben, stellen eine Reihe von unverstärkten Testversuche, bei denen weder Geruch verstärkt, die dafür sorgt, dass die Prüfung aller Reize unter gleichen Bedingungen stattfindet. Je nach dem spezifischen Zweck des Experiments kann das Testen der einzelnen Testversuche der konditionierten Geruch oder eine Reihe von Studien mit dem konditionierten OD bestehenoder oder eine Kombination aus den aufbereiteten und neuartige Geruchsbildung. Ein einzelner Test-Studie mit dem Geruch Anlage bietet einen einfachen Test, ob die Bienen erinnere mich an den Geruch konditioniert. Allerdings kann die Reaktion auf den ersten Testversuch der Bienen Motivation Ebene sowie deren Abberufung des Anlage Geruch zu reflektieren. Eine Reihe von Testversuchen, entweder eine Reihe von Studien Erlöschen der bedingten Geruch oder einer Reihe von Einzeltests der konditionierten und einen oder mehrere neue Gerüche, können auch verwendet werden, um Speicher zu beurteilen. Die Reihe der vom Aussterben Studien beurteilen kann, wie stark die Bienen erinnern die klimatisierte Vereins. Je stärker die Rückruf die größere Anzahl von Studien benötigt, um die bedingte Reaktion zu löschen. Eine Reihe von Einzeltests von konditionierten und neue Gerüche können auch prüfen, die Spezifität des Speicheranlage Geruch der Bienen. Es ist auch zwingend notwendig, um zu konditionieren und testen sowohl Kontrolle und behandelten Gruppen zu den gleichen Zeitpunkten. Comparing die Leistung der Bienen bald nach Anlage für Bienen über einen längeren Zeitraum gehalten ist aufgrund der Exposition gegenüber dem US-Saccharose, indem die Bienen bis zur Sättigung problematisch. Zum Beispiel könnte eine Abnahme der Leistung nach langen Intervallen aufgrund von Speicher Zerfall oder es könnte aufgrund von Änderungen der Motivationszustand und / oder Lernen durch unverstärkte Engagement am US-induziert sein, so dass die Ergebnisse nicht eindeutig. Daher sollte die Leistung einer Behandlungsgruppe immer relativ zu einer Kontrollgruppe, konditioniert und in den gleichen Zeitpunkten getestet, beurteilt werden. Geruchsstoffkonzentration und Integrität Es gibt mehrere Möglichkeiten, in denen die Konzentration und Integrität des Geruchs (CS) verglichen werden kann. Die am weitesten verbreitete Problem mit Geruchs Lieferung ist die Erschöpfung der Geruchspatronen durch Überbeanspruchung (Abbildung 2). Ersetzen Sie die Patronen 10-12 Nutzungen (alle 2 oder-3-Studien mit Gruppen von 5 Honigbienen), um diese Gefahr zu vermeiden. Es ist auch wichtig zu bedienenfrische Patronen für Testversuche, da gebrauchte Patronen können unterschiedlich aufgebraucht sein und somit ungleichen Geruch Reize. Ein weiteres allgemeines Problem ist geruchsPatrone Kontamination durch Verwendung der Kartusche für mehr als einen Geruch, ohne vollständig reinigen. Eine schmutzige oder kontaminierte Luftstrom kann auch unbeabsichtigt führen zusätzliche Geruchsreizes (Aktivkohlefilter können Hintergrundbelastung zu verhindern). Dies ist besonders problematisch, wenn die Kopplung PER Anlage mit Messungen der physiologischen Reaktionen auf den Geruch. Leaky Geruchspatronen stellen ein Problem dar, da die Bienen ausgesetzt sind geruchs bevor der Prozess beginnt, was den Stellenwert der Geruchsreiz reduziert. Locker sitz auf der Luftzufuhr für die Geruchs Lieferung kann in wenig oder gar keine Geruchs Lieferung führen, wenn das Ventil geöffnet wird, künstlich Reaktion der Bienen auf die vorgesehene Verringerung der Geruch. Saccharose-Lösung und unbedingten Reiz (Belohnung) Die eineHalterung, Konzentration und Integrität der wie die USA verwendet Saccharose-Lösung sind entscheidend für den Erfolg des Experiments. Anlage ist eine Funktion der Menge und Konzentration der Saccharose-Wasser-Lösung als US 37 verwendet. Die Mikrometer-Spritzen in Methode 2 verwendet werden, erlauben eine sehr präzise (bis zu 0,2 ul) Kontrolle von US-Lieferung, und wir empfehlen die Verwendung von ihnen für beide Methoden beschrieben. Verwendung der Zahnstocher (Methode 1) ist ausreichend für Umstände, unter denen die teuren Spritzen kann nicht verwendet werden, wie in der Ausbildung große Gruppen von Studenten, Arbeit auf dem Feld, oder mit geringeren Budgets. Sorgfältige Umsetzung der Methode 1 ist in Ordnung, solange Timing wird mit regelmäßigen Austausch der Zahnstocher gehalten, um den Aufbau von Saccharose (und die gelieferte Konzentration) zu vermeiden. Verwendung Zahnstocher ist es jedoch schwieriger, genau zu steuern und die Schätzung der Menge und der Größe der US geliefert, die für Studien Anlage 1 ist. Die Konzentration von Saccharose zu benötigteneine ausreichende Belohnung, um die Bienen motiviert, um das konditionierte Verein erfahren Sie auf der Schwierigkeit der Aufgabe und inneren Zustand der Bienen oder der Jahreszeit abhängig zu halten. Die schwierigeren Aufgaben erfordern einen höheren Saccharose-Lösung für die Bienen &quot;, um die Aufgabe erfolgreich zu lernen. Schimmel kann Aufbau in Saccharoselösungen selbst bei 5 ° C, die die Integrität der Lösung beeinträchtigt wird, die Gesundheit und die Wahrnehmung der Belohnung der Bienen beeinflussen während des Experiments. Es ist am besten, um die Lösung alle paar Tage zu ersetzen. Präzision, Timing, und die Konsistenz der CS und US-Lieferung Die entscheidende Frage über die richtige Umsetzung einer pro Verfahren, oder für diese Angelegenheit jeder Konditionierungsverfahren beinhaltet Präzision, Timing und Konsistenz von CS und US-Lieferung (Abbildung 1). Die Ermittler, die neu in das Verfahren sind häufig ungenau sind über Lieferung von einem oder beiden Reize. ISI, die für die CS überlappen zu lassen scheitern und US in den armen Anlage Leistung führen. Die SPS automatisiert ein akustisches Signal für den Experimentator zu Saccharose 3 Sekunden nach dem Beginn der Geruch Lieferung zu liefern. Die Ermittler sollten die Saccharose / Wasser-Tröpfchen in der Nähe des Bienen für die schnelle Lieferung, nachdem das Signal zu halten. Diese Verfahren helfen mitzureißen eine konsistente ISI. Platzieren einer Stoppuhr durch die Arena Anlage ermöglicht die komfortable Platzierung Zeit der Studie sowie die Überwachung der Bienen Zeit in der Arena vor und nach der Lieferung von Reizen. So werden die ITI relativ konsistent sein und die gesamte Prozedur kann bei einer kontrollierten Tempo ausgeführt werden. ITI, die zu kurz sind, beispielsweise weniger als 1 min, oder zu lang kann zu schlechter Leistung Anlage 1 führen. Saisonale, ökologische und Kontext-bezogene Auswirkungen auf die Honigbiene Leistungs Leistung Honigbienen &#39;durch seine Umgebung deutlich beeinflusst werdensowohl vor als auch während der Konditionierung. Häufig werden die Temperaturschwankungen und die Verfügbarkeit von Nahrungsmitteln, die mit dem Wechsel der Jahreszeiten kommen der Bienen Motivation zum Lernen zu verändern. Wenn die Blüten in voller Blüte, um die Bienen Motivation lernen die klimatisierte Verein im Labor nimmt 38. Wenn die Kolonie wird betont - von extremen Temperaturen, Nahrungsmittelknappheit, Krankheit oder Stress - die Bienen &quot;wird eine Verringerung ihrer Lernleistung im Inneren zeigen. Honigbienen in einem Flugraum kann auch für eine Weile gehalten lernen, aber es gibt auch den Stress der Krankheit und Alterung ihrer Lernleistung im Laufe der Zeit verschlechtern. Der Kontext während der Konditionierung kann auch die Leistung der Bienen zu verringern. Etwaige Fremdgeruch, Bewegung und andere Reize können die Biene aus den experimentellen Stimuli abzulenken. Um dieses Problem zu vermeiden, halten Sie einen einigermaßen konsistent, vereinfachte visuelle Kontext. Genotyp und Erfahrung wirkt sich pro Vorstellung &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Honigbiene Arbeiter erheblich in der Leistung auf jedem Konditionierungsverfahren wegen Aufgabe Spezialisierung, Genotyp, oder andere Umweltfaktoren 20 abweichen. Daher ist es wichtig, zu standardisieren, so viel wie möglich, die Arten der Tiere in einem Experiment verwendet, um interindividuelle Schwankung zu verringern. In einer Kolonie von einer offen begattete Königin, was bedeutet, sie mit vielen verschiedenen Drohnen gepaart führte, werden die Arbeiter in väterlicher Genotyp unterscheiden. Genetischen Hintergrund kann zu dramatischen Unterschiede in der sensorischen Reaktions 39 und 29 Lernleistung führen. Mit Kolonien, die von Königinnen instrumentell durch Spermien aus einzelnen Drohnen besamt 28 geführt reduziert diese interindividuellen Schwankungen. Die oben beschriebenen Protokolle, umfasst ein Verfahren zum Sammeln Honigbiene Arbeiter aus dem Nesteingang. Allerdings sind diese Bienen unterscheiden sich voneinander in Bezug auf das Alter oder Verhaltens Aufgabe. Sie können jung sein (inexperienCED) oder älter (mehr erfahren) Sammlerinnen. Sie können junge Honigbienen, die ihre erste Orientierung Flüge sein. Oder sie können Schutz Bienen sein. Um die Variabilität zu verringern, markieren die Bienen mit einem schnell trocknenden Lackfarbe oder Kennzeichnung Tags entweder so wie sie als Erwachsene (für Age Control) und treten / oder wie sie Nahrungssuche (für Erfahrungen zu kontrollieren) beginnen. Dann, ein paar Tage später, sammeln die Bienen für die deutliche Anlage. Arbeiter, die in der Pflege tätig sind, können das Verhalten von den Rahmen in den Bienenstock gesammelt werden. Krankenschwestern können positiv identifiziert werden, wenn sie ihre Köpfe in eine Brutzelle einfügen, um für die Larve innerhalb füttern und pflegen. Mit Virgin Queens oder Drohnen für PRO Anlage Neben der Arbeiter Honigbienen, Bienenköniginnen Jungfrau und Drohnen können ohne weiteres in einer pro Verfahren für ein Studium an der Entwicklung genetischen Linien von Honigbienen, die in Lernleistung 28 unterscheiden sollen konditioniert werden. Virgin Königinnen sollten nach th bald gesammelt werdeney ergeben sich aus der Verpuppung und direkt in Rückhaltegurte ohne Betäubung gesetzt. Junge, unreife Drohnen aus der Brutwaben in der Kolonie gesammelt werden, sind in der Regel nicht motiviert zu lernen. Nachdem sie begonnen haben Paarungsflüge, Drohnen leicht zu lernen und PRO Aufgaben 28. Sie sollten gesammelt werden, da sie von einem Hochzeitsflug in einer Kolonie für die Aufzucht von Königinnen zurück und gepflegt über Nacht in einem kleinen Käfig. Versuchen Sie nicht, um sie am Tag vor Anlage nutzen; sie nicht gut in Bäume über Nacht zu überleben. Ein paar Stunden vor der Konditionierung können die Drohnen aus den Käfigen gesammelt und ohne Betäubung in die Haltegurte angebracht werden. Schlussfolgerungen Dies PER Verfahren in der Art der Verfahren, beträgt ein Ausgangspunkt für die Gestaltung PER Experimenten. Die meisten Protokolle und PRO wird verlangen, dass das Verfahren in irgendeiner Weise umrissen geändert werden die spezifischen Ziele des Experiments und Unterkünfte zu implementierene mehrere Behandlungsgruppen. Es ist einfach zu implementieren. Allerdings erfordert die ordnungsgemäße Umsetzung Liebe zum Detail und Praxis. Einmal gemeistert es kann ein leistungsfähiges Verfahren, um als Forschungswerkzeug für mehrere grundlegende und angewandte Forschungsprogramme mit verschiedenen Insektenarten hinzufügen.

Viele Insekten lernen über ökologisch relevante Reize, und sie dann ihre Verhaltensreaktionen auf diese Reize, um neue prädiktive Beziehungen in ihrer Umgebung anpassen ändern. Mehrere verschiedene Mechanismen können diesen Verhaltensplastizität zugrunde liegen (zB nicht-assoziativen, assoziative / Pawlowschen und operante / instrument 1). Diese Arten von Plastizität unterscheiden sich in die Stimuli oder Verhaltensweisen sind mit wichtigen Ereignissen, wie das Auftreten von Lebensmitteln, einem Kumpel, oder Gefahr verbunden. Das Verständnis dieser Formen der Plastizität ist für die Grundlagenforschung sehr wichtig, wie sich das Nervensystem verändert, neue Erinnerungen zu 2 kodieren. Es ist auch wichtig für das Verständnis der adaptiven Verhalten von Insekten, die wichtige Überträger von Krankheiten (zB Tsetse-und Moskito) und Insekten, die landwirtschaftlich wichtig sind, sind entweder in der Pflanzenproduktion (Honigbienen) oder als Schädlinge. Studium Verhaltensplastizität in jedem animal erfordert aufgrund der experimentellen Kontrolle über eine Anzahl von Variablen, die nicht in dem Gebiet 1 erreichbar. Es erfordert die Entwicklung eines robusten Anlage Protokoll, das unter kontrollierten Bedingungen mehr eingesetzt werden können, aber die immer noch relevant, um das Verhalten unter natürlichen Bedingungen sind. Die Honigbiene (Apis mellifera) ist ein ausgezeichnetes Modell dafür, wie ein Protokoll für die Durchführung kontrollierter Analysen der Verhaltensplastizität 3,4 zu entwickeln. Die Nasenneben Response (PER) in Honigbienen ist ein natürlicher Reflex Verhaltens, in dem die Honigbiene erweitert sein Rüssel in Reaktion auf anten Stimulation mit einer Zuckerlösung. Während der normalen Nahrungssuchverhalten tritt PRO, wenn die Honigbiene Nektar findet in einer Blume. Glücklicherweise wird Honigbienen leicht zeigen diese einfache und leicht quantifizierbare Verhalten im Labor. Dies macht es möglich, zu untersuchen, in einer kontrollierten Umgebung, die Mechanismen, die diese ökologisch relevanten Verhalten 5 beeinflussen. PRO can auch innerhalb einer Konditionierungsprotokoll verwendet, um Reizwahrnehmung und Lern-und Gedächtnis unter verschiedenen Behandlungsbedingungen, die bestimmt sind, die Verhaltens-und neuronalen Mechanismen, die die Plastizität zugrunde liegen 6 zeigen untersuchen. Seit den ersten Untersuchungen von Kuwabara 7, hat PRO Anlage sehr stark genutzt, um nicht-assoziativen, assoziativ und operante Verhaltensmechanismen, die Plastizität im Honigbienen 8 zugrunde liegen, zu offenbaren. Diese Mechanismen sind identisch mit den in den Studien der frei fliegenden Bienen 9 offenbart. Im Gegensatz zu Untersuchungen von frei fliegenden Bienen können PER Anlage Protokolle mit Elektrophysiologie 10,11 oder Live-Zell-Fluoreszenz-Bildgebung des Gehirns 12-14 gekoppelt werden. Außerdem ermöglichen PRO Protokolle für experimentelle Manipulation von Nervenbahnen durch pharmakologische oder molekulargenetische Behandlungen, um Hypothesen über die Rolle der spezifischen Komponenten des Netzwerks, wie nehmer testenomodulators 15,16. PRO-Protokolle haben auch eine wichtige Möglichkeit, die subletale Auswirkungen der Umweltbedingungen sowie Giftstoffe auf die Gesundheit und Leistungsfähigkeit der Nahrungssuche Honigbienen 17 zu bewerten ist. Dieses Verfahren beschreibt zwei Geruchsversandmethoden parallel. Verfahren 1 ist eine Version des Geruchs und unbedingter Reiz (Saccharose) Lieferung, das eine kostengünstige und technisch einfache Methode zur Darstellung der Geruch und Saccharose Belohnung bietet. Diese Methode ist gut für die Grundausbildung und wenn Automatisierung ist nicht möglich. Es ist eine hervorragende Möglichkeit, um diese Technik zu einem Klassenzimmer oder Labor Lehre einzuführen. Während Anlage für Experimente mit schwierigeren Aufgaben und gekoppelt physiologischen Beurteilung der Geruchswahrnehmung, Lernen oder Gedächtnis, ist es sehr wichtig, genau und präzise regeln den Beginn, Dauer Lieferzeitpunkt Reize. Für die zuverlässigsten Konjunktur Lieferung, verwenden ein Mittel zur Automatisierung der Geruch Lieferung einnd eine genaue Methode der Belohnung Lieferung. Methode 2 verwendet automatisierte Geruch Lieferung und präziser Saccharose Lieferung. Es ist technisch anspruchsvoller und erfordert mehr für die Ersteinrichtung als Methode 1, aber es die Konsistenz der Zeitpunkt und die Menge der Impulse für Anlage verwendet deutlich erhöht und sollte wenn immer möglich genutzt werden.

<table><tbody><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1KG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Duftstoffe (zum Beispiel)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;1-Hexanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471402-100ML</td><td>Weitere Beispiele</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;2-Octanon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W280208-800G-K</td><td>von Duftstoffen, siehe beliebige davon</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;Heptanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51778-5ML</td><td>die Arbeiten zum Geruchssinn</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;Geraniol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163333-25G</td><td>Verarbeitung von der</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;Nonanal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131210-100ML</td><td>Smith-Laboratorium</td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>Schweres Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td>Stellen Sie sicher, dass es&amp;rsquo;geruchlos.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationsgefäße</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z190535-1PAK</td><td>Verwenden Sie einen kleinen Bohrer, um ein kleines Loch in den Verschluss der Gefäße zu bohren.</td></tr><tr><td>Bienenhalterung</td><td></td><td></td><td>Speziell angefertigt aus Kunststoff-Strohhalmen mit einem Durchmesser von 0,9 cm oder aus Hartkunststoff-/Metallrohren.</td></tr><tr><td>Klebeband</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Spülgflaschen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z560847-3EA</td><td>Für 70 % Ethanol.</td></tr><tr><td>Trockenrohr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;NUR FÜR METHODE 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Einweg-Spritzen aus Kunststoff, 20 ml</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-07945-18</td><td></td></tr><tr><td>15 mm Filterpapierkreise</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274844-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Reißzwecken</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zahnstocher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;NUR FÜR METHODE 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Gilmont-Mikrometer-Spritze, 0,2 ml</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07840-00</td><td></td></tr><tr><td>Gilmont-Mikrometer-Spritzenaufsatz</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07841-00</td><td></td></tr><tr><td>26 G 3/8&amp;rdquo; Leur-Hub-Hypodermikanädel</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-10</td><td></td></tr><tr><td>1-cc-Tuberkulinspritzen (Plastik/Glas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z181641-1EA ODER Z192090-200EA</td><td>Glas-Tuberkulinspritzen sind erhältlich, aber Plastikspritzen sind deutlich kostengünstiger und eignen sich für eine begrenzte Anzahl von Anwendungen.</td></tr><tr><td>Kleine Gummikautschuk-/Silikon-Stopper</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-02</td><td>Hergestellt aus Silikonrohr mit 4,8 mm Außendurchmesser oder aus den Gummispitzen von 1-cc-Spritzenkolben.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier, 75 x 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695106-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Direct Logic 05 programmierbare Logiksteuerung</td><td><a href="http://www.koyoele.co.jp/english/product/plc/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Koyo Electronics Industries Co, Ltd</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm, 4 mm, &amp;amp; PVC- oder Silikon-Schlauch mit 6 mm Innendurchmesser</td><td>Cole-Parmer</td><td>Verschiedene</td><td>Cole-Parmer bietet eine große Auswahl an geeigneten Schläuchen.</td></tr><tr><td>Polypropylen-Steckverbinder &amp;amp; ihre Armaturen</td><td>Cole-Parmer</td><td>Verschiedene</td><td>Cole-Parmer bietet eine große Auswahl an Verbindern und Armaturen für zahlreiche Schlauchgrößen.</td></tr><tr><td>65 mm korrelierter Durchflussmesser</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-03216-08</td><td>Aluminium mit Glasfloat; für Flüssigkeiten und Gase, mit Ventil.</td></tr><tr><td colspan="4">ODER</td></tr><tr><td>Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium-Luftpumpe</td><td><a href="http://www.aquacave.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquacave</a></td><td>AE-TETRA-300</td><td></td></tr><tr><td>LIF-Serie Magnetventile für Schläuche mit 0,042" Innendurchmesser, Konfiguration „E“</td><td><a href="http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> The Lee Company</a></td><td>LFAA1200118H</td><td>Neopren, 430 SS, 302 SS, 280 mW</td></tr><tr><td>PC-Platine 12 V DC, 70 dB, Piezo-Buzzer</td><td><a href="http://www.radioshack.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> RadioShack</a></td><td>273-074</td><td></td></tr></tbody></table>

eine nasennebenschutz-protokoll für die untersuchung verhaltensplastizität bei insekten: anwendung auf grund, biomedizinische und agrarforschung

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insekten ihre Antworten zu modifizieren, um durch Reize Erfahrung assoziieren diese Reize mit Ereignissen wichtig für das Überleben (zB Essen, Kumpels, Drohungen). Es gibt mehrere Mechanismen, durch die Verhaltens ein Insekt lernt hervorstechenden Verbänden und bezieht sie auf diese Ereignisse. Es ist wichtig, diese Verhaltensplastizität für Programme auf die Unterstützung von Insekten, die vorteilhaft für die Landwirtschaft ausgerichtet zu verstehen. Dieses Verständnis kann auch für die Entdeckung Lösungen für die biomedizinische und landwirtschaftliche Probleme, die durch Insekten, die als Krankheitsüberträger und Schädlinge verwendet werden. Die Nasenneben Response (PER) Anlage Protokoll wurde für Honigbienen (Apis mellifera) vor über 50 Jahren entwickelt, um zu studieren, wie sie wahrnehmen und erfahren Sie mehr über Blumen Gerüche, die den Nektar und Pollen Ressourcen einer Kolonie Bedürfnisse für das Überleben zu signalisieren. Die pro Verfahren bietet eine robuste und einfach zu beschäftigen Rahmen für die Untersuchung mehrere verschiedene ökologisch relevanten mechamen der Verhaltensplastizität. Es ist für den Einsatz leicht anpassbar mit einigen anderen Insektenarten und andere Verhaltens Reflexe. Diese Protokolle können leicht in Verbindung mit verschiedenen Mitteln zur Überwachung neurale Aktivität im ZNS mittels Elektrophysiologie oder bioimaging oder zur gezielten Manipulation neuromodulatorischen Wege eingesetzt werden. Es ist ein robustes Assay zum schnellen Nachweis subletalen Auswirkungen auf das Verhalten von Umwelt-Stressoren, Toxine oder Pestizide verursacht. Wir zeigen, wie der Per-Protokoll ist einfach zu implementieren mit Hilfe von zwei Verfahren. Eine ist als Laborübung für Studenten oder für schnelle Tests der Wirkung einer experimentellen Behandlung geeignet. Der andere bietet gründlichere Kontrolle der Variablen, die für Studien von Verhaltensanlage ist. Wir zeigen, wie verschiedene Maßnahmen zur Verhaltensreaktion von binären ja / nein, mehr kontinuierliche Variable wie Latenz und Dauer der Rüssel-Erweiterung kann verwendet werden, um zu testen Hypothese werdens. Und diskutieren wir einige Fallstricke, die Forscher häufig begegnen, wenn sie zum ersten Mal verwenden Sie den Vorgang.

Wir stellen zwei Beispiele für die Verwendung der oben beschriebenen PRO-Protokolle. Das erste Beispiel hat die Verwendung von Verfahren 2 zu untersuchen, wie Honigbienen wahr verschiedene Gerüche in Abhängigkeit von dem Molekular Ähnlichkeit als CS 5,24,25 verwendet Geruch. Der zweite ist ein Beispiel für die Verwendung von Methode 1 und einige der Vorsichtsmaßnahmen, die beim Beginn PER Anlage Experimente im Forschungslabor Gebrauch genommen werden müssen. Studien wie diese sind verwendet worden, um die Geruchs &quot;Wahrnehmungsraum&quot; der Bienen und Motten in Verbindung beschreiben mit BioImaging 13 oder elektrophysiologische Analysen 26. Honigbienen (n = 20) wurden konditioniert, um den Geruchsstoff Dekanats mit Saccharose Verstärkung über 12 Vorwärts-Paarung Anlage Studien (3A) zu verknüpfen. Etwa 10% der Honigbienen hat &#39;spontan&#39; auf der ersten Studie, die normal ist. Danach wird der Prozentsatz responded in den nächsten Studien zu erhöhen, bis 100% der Honigbienen hat auf der fünften Versuch und jede weitere Prüfung. Mehrere Studien haben gezeigt, dass dieser Anstieg der Reaktion ist spezifisch für die Vorwärtskopplungsanlage (1) in Bezug auf mehrere wichtige Kontrollverfahren 3. Nach der Akquisitionsphase wurde jede Honigbiene auf einer Reihe von Testversuchen unverstärkt (3B), die Exposition gegenüber dem Geruch CS und auf mehrere andere Geruchsstoffe, die systematisch von der CS in der molekularen Strukturen unterschieden sich beteiligt unterzogen. Honigbienen reagierte am stärksten auf die CS. Ihre Reaktionen auf die anderen Duftstoffe verringert als Funktion der systematischen Änderungen in der Struktur, mit den niedrigsten Antworten auf die Geruchsstoffe wenigstens wie der CS. In Abbildung 4 sind die Ergebnisse aus einer aktuellen Workshop, in dem Studenten gelernt haben, zum ersten Mal, wie man Bienen mit Methode 1 dargestellt zu konditionieren. Studenten Tannen<html> t Anlage Honigbienen durch Vorwärtspaarung methycyclohexanone (MCH) oder Octanol (OCT) mit Saccharose Verstärkung (4A). Antworten Prozent niedriger waren auf dem ersten Versuch und erhöht bei zukünftigen Studien, was darauf hinweist, dass die Bienen gelernt, den Geruch-Saccharose Vereins. Es gab Unterschiede in dem Maße, wie die Bienen lernten die konditionierten Assoziation zwischen den verschiedenen Gruppen von Studenten. Nach unserer Erfahrung können diese Arten von Differenzen aufgrund der Geruch, der wie der CS verwendet wurde, zu den ungenauen Elemente im Verfahren (Verfahren 1) oder auf den Ausbildungsstand der Experimentatoren. Im dritten Fall, wird schnell Leistung mehr im Einklang mit zunehmender Erfahrung die Experimentatoren. Nach der Konditionierung wurde jede Honigbiene zweimal mit je Geruch getestet. In Gruppen von Honigbienen, die mit zukunfts Paarung von OCT oder MCH konditioniert worden war, die Antwort war, wie erwartet, am stärksten in den klimatisierten Geruch (4B). <html> ent &quot;&gt; Die zweite Gruppe von Honigbienen, die nach vorne Paarung an Oktober erlebt wurde parallel zu einer anderen Gruppe, in der der Geruch Oktober wurde rückwärts mit Saccharose gepaart Anlage. Rückwärts-Paarung ist eine von mehreren Arten von Kontrollverfahren, um zu zeigen, dass der Anstieg in Reaktion ist spezifisch für Paarung weiterzuleiten und nicht durch einen anderen Prozess, wie unspezifische Erregung von Sensibilisierung. Für Abwärts Paarung, die Saccharose USA und Geruch CS werden in umgekehrter Reihenfolge zu dem, was in Abbildung 1 zeigt von hinten Paarung vorgestellt. Acquisition Daten nicht gezeigt, weil der CR kann nicht erzielt wurden gegeben werden die Präsentation des Geruchs CS nach Vorlage von Saccharose. Als würde für assoziative Anlage vorhergesagt werden, die Antwortstufen Oktober waren in der Vorwärts gepaart Gruppe in Bezug auf die Rückwärtsgruppe (4C) höher. 7fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 1. Diagramme der Versuchsplanung für Anlage mit zukunfts Paarung. Siehe Tabelle 1 für Definitionen der in dieser Abbildung verwendeten Begriffe. (A) Die CS (Geruch) vorangeht und überschneidet sich mit den USA (Saccharose / Wasser-Lösung). Die Beziehung zwischen der CS und US gezeigt ist optimal für Anlage Bienen und Motten. Aber die optimale ISI finden Sie auf der Anlage Protokoll-und Tierarten 1 abhängen. (B) Pannenhilfe und relative Zeit von CS, CR, USA, und UR. Der CR, die entweder vor oder während der US-Präsentation unverstärkten &#39;test&#39; Studien auftritt, ist die abhängige Maß für experimentelle Protokolle. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Geruch Erschöpfung mit Wiederverwendung von Patronen. Für diesen Daten wurden GeruchspatronenSet-up mit Hexanol, wie im Text beschrieben. Hexanol wird allgemein als CS PRO Studien verwendet; Jedoch wird die tatsächliche Geschwindigkeit der Verarmung auf den Geruch und Lösungsmittel abhängen. Patronen wurden dann noch einmal 4 Sekunden jede Minute über 8 Studien (unter der Annahme, 5 Honigbienen / Versuch in einem Standard-Experiment, das 40 Anwendungen entsprechen würde) verwendet. Die Verdünnungen in der angegebenen Lösungsmittel, die für die PRO-Experimente relativ üblich waren, wurden 2,0 M (A) und 0,2 M (B). (A, B) Der Geruch wurde nach der ersten und der achten Studien durch Adsorption an einer festen Phase abgetasteten Mikroextraktion (SPME) Faser, die dann auf einen Gaschromatographen desorbiert wurde. Die relativen Flächen unter den Peaks höher waren nach dem ersten Versuch in Bezug auf die achte für beide Lösungsmittel und für beide Konzentrationen (Wilcoxon matched pairs Vorzeichen-Rangtest p &lt;0,05 [*] oder höher), die zeigt, dass weniger Geruch wurde von der Patrone geliefert nachdem die Kassette hatte eine Anzahl von Malen. (C, D) die gleichen Daten, die gerade die achte tr verwendet<html> ial mit dem erweiterten y-Achse. Es zeigt, dass Verarmungs geringfügig größer für Hexan, bezogen auf Mineralöl, sondern nur bei der niedrigeren Konzentration. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Erwerb und Test mit Dekanats als CS und Verfahren 2 bis Anlage. (A) Test-by-trial-Reaktion (CR) über 12 Vorwärts-Paarung Studien (Abbildung 1). Die Daten stammen aus n = 20 Honigbienen in vier Gruppen von jeweils 5 Honigbienen konditioniert. Der ISI war 3 Sekunden und die ITI war 6 min. (B) unverstärkt Tests mit Gerüchen, die von Dekanats von Kohlenstoffkettenlänge und / oder die Position des Carbonylkohlenstoff abweichen. Die Gerüche wurden in einer randomisierten Serie über die vier Gruppen vor und wurden mit verstärkten Versuchen mit Dekanats (alle zwei bis drei Versuche), um Aussterben der CR vermeiden setzt. e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Die Daten aus einem Workshop, in dem Studenten wurden ausgebildet, um Bienen zu konditionieren mit PER-Methode 1. (a) Erwerb von Daten aus drei Gruppen von Honigbienen Anlage zu Octanol (n = 23 und 15 für die GPS-1 bzw. 2) und Methylcyclohexanon (n = 10), (B) CRs bei unverstärkten Tests mit beiden Gerüche. vier Studien in zufälliger Reihe über Gruppen vorgestellt. (C) unverstärkt Tests mit beiden Gerüche in zwei Gruppen von Honigbienen, eine zukunfts gepaart (Gp 1, n = 23) und eine nach hinten gepaart (n = 25). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Begriff (Abkürzung) </td><td> Definition </td><td> Relevante Beispiel </td></tr><tr><td> Bedingten Reiz (CS) </td><td> EinReiz, der eine geringe oder keine Reaktion auslöst, an ersten und signalisiert US </td><td> GERUCH </td></tr><tr><td> Konditionierte Reaktion (CR) ein </td><td> Die Antwort auf das CS nach Verbindung mit dem US </td><td> Rüssel EXTENSION </td></tr><tr><td> Unbedingten Reiz (US) </td><td> Ein biologisch wichtige Impulse, die eine Antwort entlockt </td><td> Saccharose / Wasser-Lösung </td></tr><tr><td> Unbedingte Reaktion (UR) ein </td><td> Die Reaktion auf die US </td><td> Rüssel EXTENSION </td></tr><tr><td> Inter-Stimulus-Intervall (ISI) </td><td> Die Zeit zwischen dem Beginn des KS und Einsetzen der US </td><td> Geruch SUCROSE Intervall </td></tr><tr><td> Inter-Testintervall (ITI) </td><td> Die Zeit zwischen aufeinander CS-US-Paarungen für ein einzelnes Tier </td><td> Geruch (Studie n), um Geruch (Test n + 1)-Intervall </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Imwichtige Begriffe. Siehe für eine Darstellung dieser Begriffe Abbildung 1 a. Für PRO Anlage der CR und UR sind die gleichen, wenn auch für andere Arten von Verbänden und Reflexe der CR und UR können abweichen. <a href="/files/ftp_upload/51057/BEE_4.avi" target="_blank">Film 1.</a> Ein Video einer Honigbiene, Durchführung und PRO nachdem sie konditioniert worden, um einen Geruch zu reagieren. Beachten Sie die PRO Reaktion der Biene ca. 1,5 sec nach Beginn Geruch. Tracking-Software abgebildet, die Antennenbewegungen als Reaktion auf Präsentation der Geruch. Die in der oberen rechten Ecke des Videozeichneten Linien veranschaulichen die tatsächlichen Antennenbewegungen. Die beiden Grafiken unten auf dem Bildschirm zeigen anten Bewegungen auf der X-(links) und Y (rechts) koordiniert. Die vertikalen Linien in der Grafik in dem Video zu sehen geben, von links nach rechts, Licht an, PRO, Licht aus und Rüssel Rückzug.

Das Proboscis Extension Response (PER) Konditionierungsprotokoll, das für die Honigbiene (Apis mellifera) entwickelt wurde, bietet ein ökologisch relevantes und leicht quantifizierbares Mittel, um verschiedene Lernmechanismen bei vielen Insektenarten zu untersuchen.

Eine Nasennebenschutz-Protokoll für die Untersuchung Verhaltensplastizität bei Insekten: Anwendung auf Grund, Biomedizinische und Agrarforschung

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu zeigen, wie eine verhaltensmäßige Konditionierung einer einfachen reflexiven Nahrungsreaktion bei Honigbienen durchgeführt wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Honigbienen gefangen, in Halterungen fixiert, mit einer kleinen Menge geheimer Lösung gefüttert und dann an die Fixierung gewöhnt werden. Anschließend werden Perlen zur Konditionierung ausgewählt, die ausreichende Motivation zeigen, wenn ihre Antennen mit Saccharose berührt werden.Während der Konditionierung wird die Präsentation eines Geruchs mit einer Saccharose-Belohnung gekoppelt, um die konditionierte Reaktion hervorzurufen. Anschließend messen nicht verstärkte Versuchsdurchgänge das Vorhandensein oder Fehlen der Reaktion, die Reaktionslatenz sowie die Dauer der Reaktion. Der letzte Schritt besteht aus der Datenanalyse und der grafischen Darstellung der Konditionierungs- und Testdurchgänge.Diese Technik wurde erfolgreich in Studien zur Biologie und Gesundheit der Honigbiene angewandt; das Lernverhalten ist besonders empfindlich gegenüber störenden Behandlungen wie Pestiziden, wodurch es möglich ist, die Auswirkungen dieser Behandlungsarten auf das Verhalten der Honigbiene auf subletalen Dosen zu bewerten. Die visuelle Demonstration dieser Methode trägt zum Verständnis der für eine effektive Konditionierung erforderlichen Reiztiming und der häufig auftretenden Fehler bei, die die Wirksamkeit verringern. Eine Einzelperson, die neu in dieser Methode ist, wird Schwierigkeiten haben, die erforderliche Sorgfalt sowohl hinsichtlich des Protokolls als auch der umgebenden Bedingungen aufzubringen.Sammeln Sie zunächst Arbeiterinnen an der Kolonieeingang, während sie kurz verharren, bevor sie das Stock verlassen, oder bei ihrer Rückkehr von der Nahrungssuche. Füllen Sie jeweils nur eine Biene pro Probengefäß ab. Halten Sie die Öffnung des Gefäßes während des Verschließens waagerecht oder nach unten gerichtet, um ein Entkommen zu verhindern.Nachdem die Bienen gesammelt wurden, kehren Sie ins Labor zurück und geben Sie jeweils einige der Röhrchen in eine Eiswasser-Schlamm-Mischung. Sobald eine Biene bewegungsunfähig ist, nehmen Sie das Röhrchen unverzüglich aus dem Eis, um eine Überkühlung zu vermeiden, und legen die Biene in eine Fixiervorrichtung. Fixieren Sie die Biene so, dass ihr dorsaler Thorax zur ausgeschnittenen Seite des Haltesystems weist und ihr Kopf knapp über der Oberkante liegt.Drücken Sie die Biene vorsichtig, sodass ihre Mundteile über den Rand des Haltes erweitern. Führen Sie einen Streifen Klebeband zwischen Kopf und Thorax auf der dorsalen Seite ein und befestigen Sie das lose Ende fest an der Seite des Halters. Achten Sie darauf, dass das Band am Geschirr glatt und straff sitzt.Es sollten keine erkennbaren Lücken zwischen der Vorderseite des Bienenhalters und dem Klebeband bestehen. Bei vorhandenen Lücken könnte die Biene ihren Rüssel möglicherweise nicht richtig ausstrecken oder könnte entkommen. Lassen Sie den Bienen etwa 30 Minuten Zeit, sich von der Fixierung zu erholen, bevor Sie sie füttern.Danach füttern Sie jede Biene in einem Bereich, der weit vom Trainingsbereich entfernt liegt, während des Zeitintervalls zwischen Fütterung und Konditionierung mit etwa drei bis vier Mikrolitern einer 0,5-molaren Saccharoslösung. Stellen Sie die Bienen in einem ruhigen Bereich des Labors in einen Plastikbehälter mit nassen Papiertüchern. Kurz vor Beginn der Konditionierung testen Sie wenige Minuten vorher die Fressmotivation der Biene, indem Sie ihre Antennen mit einem kleinen Tropfen einer 0,5-molaren Saccharoslösung berühren.Lassen Sie sie während dieses Tests nicht füttern. Wenn sie darauf reagieren, dass sie ihre Psis ausstrecken, sind sie wahrscheinlich ausreichend motiviert, um zu lernen, und können für das Protokoll verwendet werden. Wenn Sie bereit sind, platzieren Sie die Glasgeruchsspritze in einem Halter aus Modelliermasse und justieren Sie sie so, dass die Öffnung am breiten Ende direkt auf die Bienen und 10 E gerichtet ist. Das Ende der Spritze sollte sich ein bis zwei Zentimeter von der sicher platzierten Biene entfernt befinden, wobei die passende Verbindung, die die Kartusche mit dem Airstream-Schlauch- und Ventilsystem verbindet, über das schmale Ende der Spritze gesteckt wird.Zu Beginn jedes Versuchs wird die fixierte Biene mit den Antennen direkt auf die Düse in der Konditionierungsarena platziert, sodass sie auf die Duftkartusche gerichtet sind. Die Biene verbleibt 15 bis 25 Sekunden lang in der Arena, um sich an die neue Umgebung zu gewöhnen, bevor der Duftreiz beginnt. Drücken Sie die Starttaste, um die Zeitschaltung für die Duftfreigabe einzuleiten.Beobachten Sie die Reaktion der Biene auf den Geruch nach Beginn des Stimulus und vor der Darbietung des unkonditionierten Stimulus. Lassen Sie nach jedem Durchgang die Biene 15 bis 25 Sekunden lang im Konditionierungsbereich ruhen, um die anfängliche Gedächtnisbildung zu ermöglichen. Wenn die Biene zu früh nach dem Durchgang bewegt wird, verringert dies die Wirksamkeit jedes Konditionierungsdurchgangs erheblich.Um den Zucker zuzuführen, halten Sie die Nadelspitze während der Präsentation des Geruchs zwei bis drei Zentimeter von der Biene entfernt. Nutzen Sie den Rand der Trainingsarena, um ein Zittern der Spritze zu vermeiden, da diese Bewegung die Biene ablenken könnte. Während der Präsentation des Geruchsreizes ertönt ein Fütterungssignal.Sobald das Fütterungssignal ertönt, leicht die Antennen berühren, bis die Biene den Rüssel ausstreckt, dann die Biene füttern. Der Zeitpunkt zwischen der Präsentation des Geruchs und der Präsentation des Saccharose ist entscheidend. Idealerweise sollten diese beiden Reize sich kurz überlappen.Wenn mehr als nur wenige Sekunden zwischen der Präsentation des Geruchs und der Präsentation des Saccharose verstreichen, nimmt die Leistung beim Konditionieren ab. Führen Sie nach der Konditionierung ungekoppelte Testdurchläufe durch, um zu bewerten, wie gut die Bienen die konditionierte Assoziation behalten haben. Stellen Sie zunächst eine Videokamera auf ein Stativ über dem Trainingsbereich auf und richten Sie die Kamera auf den vorderen Teil des Kopfes der Biene aus, sodass die Antennen und der Rüssel scharf abgebildet sind.Stellen Sie sicher, dass eine kleine LED-Leuchte, die die Präsentation des Geruchsstimulus anzeigt, sich in einem Bereich hinter der Biene befindet und im Video sichtbar ist, jedoch nicht für die Biene selbst. Dies ermöglicht die Identifizierung des Zeitpunkts des Geruchsbeginns und -endes während der Analyse. Für die konsistentesten Ergebnisse verwenden Sie frisch zubereitete Duftkartuschen für die Tests, sobald alles eingerichtet ist.Beginnen Sie mit der Testung, indem Sie den Geruch wie zuvor gezeigt präsentieren. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung 20 Sekunden vor der Präsentation des Geruchs und setzen Sie die Aufzeichnung danach mindestens 20 Sekunden lang fort. Verwenden Sie nach der Testung eine Videobearbeitungssoftware, um die Reaktion jeder Biene auf die Bedingung gegenüber dem Stimulus auszuwerten.Verwenden Sie ein binäres Bewertungssystem, um die Psi-Erweiterungsreaktion zu bewerten, wobei die Reaktionen entweder als positiv oder negativ eingestuft werden. Stufen Sie die Reaktion von B als positiv ein. Wenn sich der B-Extensus-Psis über die Linie hinaus erstreckt, die durch die Verbindung der Spitzen der geöffneten Mandibeln gebildet wird, bewerten Sie die Reaktion nur dann als positiv, wenn sich B seinen Prob-Bois nach Beginn, aber vor Ende des Geruchsreizes ausdehnt. Stufen Sie die Reaktion von B als negativ ein, wenn während des Versuchs keine Ausdehnung des Prob-Bois erfolgt oder wenn der Prob-Bois erst nach Beendigung des Geruchsreizes ausgestreckt wird. Weitere Parameter können erhoben werden, wie beispielsweise die Latenz bis zur Ausdehnung sowie die Anzahl und Gesamtdauer der Ausdehnungsreaktionen unter den gegebenen Bedingungen.Der Reiz wurde über die nachfolgenden Konditionierungsversuche hinweg gesteigert. Die Antworten auf neue Testgerüche, die sich vom Reiz in der Kohlenstoffkettenlänge und/oder in der Position der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung unterschieden, nahmen proportional zum Grad des Unterschieds zwischen dem Konditionierungsreiz und dem neuen Testgeruch ab. Diese Daten veranschaulichen die Variabilität und den erfolgreichen Erwerb der Konditionierung zwischen verschiedenen Untersuchern.Die Reaktionen auf Octal unterschieden sich je nach der Gruppe, die die Tests durchführte. Während der Testdurchläufe löste der als konditionierter Reiz verwendete Geruch die stärkste Antwort aus. Wenn Octal als konditionierter Reiz verwendet wurde, war die Antwort während der Tests im Vergleich zu Methylcyclon, einem neuen Geruch, stärker.Ebenso zeigten sich stärkere Reaktionen, wenn Methylcyclon als konditionierter Reiz verwendet wurde. Bei rückwärtsgekoppelter Paarung reduzierte sich die konditionierte Reaktion nahezu auf das Niveau des neuen Geruchs, was die Bedeutung einer präzisen zeitlichen Abstimmung für eine erfolgreiche Konditionierung verdeutlicht. Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die neuronalen Grundlagen von Lernen und Gedächtnis an Insekten-Modellorganismen wie der Honigbiene zu erforschen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Insekten, insbesondere mit Honigbienen, gefährlich sein kann. Stellen Sie sicher, dass Sie geeignete Schutzausrüstung tragen, wenn Sie mit diesen Tieren arbeiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

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