Visualisierung der immunologischen Synapse von Dual Color Zeitgesteuerte Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Strukturen wie F-Aktin in der lytischen Synapse der NK-Zelle mittels TED-Mikroskopie sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Synapse auf Glas mit aktivierendem Antikörper rekapituliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Perme zu fixieren und die Zellen für interessante Strukturen zu färben.

Anschließend werden die Objektträger durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie abgebildet, gefolgt von der Anwendung von Stead Depletion für eine höhere Bildauflösung. Der letzte Schritt besteht darin, die Bilder mit Hilfe eines Dekonvolutionsalgorithmus zu verarbeiten. Letztendlich können die Ergebnisse dank Dual-Color-Stead und Endoskopie eine Auflösung von unter 100 Nanometern von zellulären Strukturen zeigen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Zellbiologie zu beantworten, wie z.B. die Beziehung zwischen dem Zytoskelett und der Exozytose. In unserem Fall interessieren wir uns für die Sekretion von spezialisierten Lysosomen, die als lytische Granula bezeichnet werden, durch natürliche Killerzellen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es mehrere Variablen gibt, die bei der Anwendung des TED-Depletionslasers angepasst werden können.

Eine unsachgemäße Anwendung des Verarmungsstrahls führt zu einer Verschlechterung statt zu einer Verbesserung der Auflösung. Zur Vorbereitung 30 Milliliter RPMI-Medium mit 10 %FCS erwärmen und separat erhitzen. Ein Milliliter BD CY bewirkt eine Dauerwelle von bis zu 37 Grad Celsius. Beginnen Sie dann mit dem Beschichten der Deckgläser mit Antikörpern.

Nehmen Sie Deckblätter Nummer 1,5 und verwenden Sie einen PAP-Stift. Machen Sie Cent-große Quadrate auf den Deckgläsern. Bereiten Sie für jede getestete Bedingung ein Quadrat vor.

Beladen Sie jeden Kreis mit 200 Mikrolitern Antikörper in einer Dosierung von fünf Mikrogramm pro Milliliter in PBS. Für die Aktivierung von NK 92-Zellen verwenden Sie Anti-CD 18- und Anti-NK P 30-Antikörper. Inkubieren Sie die geladenen Deckgläser eine halbe Stunde lang bei 37 Grad Celsius und waschen Sie sie dann mit einem Dip bei Raumtemperatur ab. PBS fährt sofort mit dem Hinzufügen der Zellen fort. Für jeden getesteten Zustand müssen 500.000 Zellen gebrauchsfertig sein.

Waschen Sie die Zellen in 10 Millilitern des vorgewärmten Mediums und suspendieren Sie sie dann wieder in demselben erwärmten Medium. Bei 2,5 Millionen Zellen pro Milliliter mit den Zellen vollständig in Suspension dekantieren Sie 200 Mikroliter in jedes Antikörperquadrat auf dem Deckblatt. Inkubieren Sie die Deckgläser mit Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2, in diesem Fall mit 5 % CO2. 20 Minuten reichen aus, um das Granulat in den NK-Zellen nach der Inkubationswäsche zu polarisieren, der Bezug gleitet sanft in PBS bei Raumtemperatur.

Beginnen Sie mit der Zugabe eines Mikroliters TRITTON X 100 zu einem Milliliter warmer BD CY effects Cyto-Perm-Lösung. Dann wirbeln. Tragen Sie 200 Mikroliter dieser Lösung auf jedes Bedingungsquadrat auf den Deckgläsern auf.

Legen Sie die Zellen dann bei Raumtemperatur ins Dunkel und warten Sie 10 Minuten. Wenn die Inkubation beendet ist, waschen Sie die Einbezugsbeine vorsichtig in Färbepuffer. Trocknen Sie dann die Ränder der umgebenden Bereiche mit einem Wattestäbchen ab.

Geben Sie anschließend 200 Mikroliter des Primärantikörpers in Färbepuffer in die umgebenden Regionen und lassen Sie die Deckgläser eine halbe Stunde lang im Dunkeln inkubieren. Zu den guten Sekundärantikörpern für die stationäre Bildgebung gehören Alexa Floor 4, 88 Pacific Orange und Horizon V 500. Jeder von ihnen funktioniert gut bei einer Verdünnung von eins bis 200.

Nach der Inkubationswäsche schiebt der Bezug Flecken ein, puffert sie und tupft sie trocken. Tragen Sie wie zuvor 200 Mikroliter des Sekundärantikörpers auf jedes Bedingungsquadrat auf. Lassen Sie sie dann weitere 30 Minuten im Dunkeln stehen.

Zu diesem Zeitpunkt ist es möglich, nach weiteren Waschungen zusätzliche Antikörper hinzuzufügen. Zum Beispiel kann Phin bei eins bis 200 angewendet werden, um Aktin nachzuweisen. Wählen Sie als Eindeckmedium prolong anstelle von Vektorabschirmung, die nicht mit Stead kompatibel ist.

Wenn Phin Färbung verwendet wird, vermeiden Sie die Verwendung von zwei zwei Thio Ethanol Dies ist jedoch in Ordnung, tragen Sie jetzt 10 bis 20 Mikroliter Eindeckmedium auf einen Objektträger auf. Senken Sie den Deckschirm umgedreht vorsichtig in das Medium ab und vermeiden Sie dabei Luftblasen. Inkubieren Sie die Objektträger dann 24 Stunden lang.

Mit dem Cover am nächsten Tag schlüpfen, den Deckslip mit Nagellack versiegeln und mit der Bildgebung fortfahren. Starten Sie die Laser und die Software. Der Stead-Depletion-Laser sollte sich bei 100 % Leistung erwärmen und ausgerichtet sein.

Fokussieren Sie mit dem Okular auf die Probe und wenden Sie sich dann der Software zu. Scannen Sie den ersten Kanal, den Kanal mit der längsten Wellenlänge. Optimieren Sie im vierten Stockwerk die Leistung des Lasers, die Position des Anregungsstrahls und die Reichweite des Detektors.

Vermeiden Sie es, über 100 einzustellen. Nehmen Sie als Nächstes ein konfokales Bild auf und prüfen Sie, ob es Pixel gibt. Sättigung, Linien- und Frame-Mittelung verbessern die Pixelauflösung.

Ziel ist es, unter 30 Nanometer pro Pixel zu liegen. Eine gewisse Sättigung ist für stead akzeptabel. Wenden Sie als Nächstes den Stead Depletion Beam mit 50 % Leistung an und nehmen Sie ein Bild auf.

Wenn sich die Auflösung verbessert, kann mehr Leistung angewendet werden. Darüber hinaus könnte auch die Anpassung der Anregungslaserleistung oder des Linienmittelwerts oder der Verstärkung die Auflösung verbessern. Um den Hintergrund zu verkleinern, wenden Sie ein Zeitlimit von 0,3 Nanosekunden an und passen Sie es nach oben an.

Die neue Auflösung sollte anhand einer Berechnung der maximalen Breite der vollen halben Breite geschätzt werden. Wenn Sie zufrieden sind, wiederholen Sie diese Schritte mit dem zweiten Kanal, wenn alle Kanäle optimiert sind. Überprüfen Sie auf spektrale Überlappung, indem Sie einzelne Fleckenkontrollen mit allen Scansequenzen abbilden.

Leichte Überlappungen können durch spektrale Entmischung durch die Software korrigiert werden, sollten aber am besten vermieden oder auf ein Minimum beschränkt werden. Erfassen Sie jetzt Bilder für die quantitative Bildgebung. Erhalten Sie mindestens 20 Bilder pro Bedingung entsprechend den Versuchsbedingungen.

Um die gespeicherten Bilder zu übertragen, öffnen Sie die Dateien in der entsprechenden Software. Überprüfen Sie die Parameter jedes Kanals, insbesondere die Anregungs- und Eintrittsspektren, die Stead-Depletion-Emission und die Abbildungsrichtung. Wenden Sie dann die Dekonvolutionsberechnungen der Software an.

Die Standardeinstellungen sind in der Regel ausreichend, aber das Signal-Rausch-Verhältnis variiert je nach Bodenkraft, so dass dieser Parameter für das Experiment manuell eingestellt werden muss. Es gibt ein paar häufige Fallstricke, die zu einer suboptimalen Auflösung führen können. Einer befindet sich in der Stichprobenprobe.

Dies führt zu Körnigkeit und einem Verlust von Pixelinformationen wie bei diesen Filamenten. Durch Erhöhen des Linien- oder Frame-Mittelwerts wird dieses Problem häufig behoben. Ein weiteres Problem ist das Bleichen oder Oversampling, das durch lange Pixel verursacht wird.

Die Verweildauer, die in der Regel auf eine übermäßige Zeilenmittelung beim Scannen vor der Bildaufnahme zurückzuführen ist, kann ebenfalls der Übeltäter sein und kann durch einen kleineren Scan vor der Bilderfassung oder durch eine höhere Scangeschwindigkeit korrigiert werden. Die Reduzierung der Laserleistung kann auch dazu beitragen, dass alles funktioniert. Das Bild wird sich dramatisch verbessern.

Die Entfaltung wird das Bild noch weiter verbessern. Sowohl quantitativ als auch qualitativ. Bei diesem Verfahren sollte routinemäßig eine Auflösung von unter 100 Nanometern erreicht werden.

Es ist wichtig, daran zu denken, die Steady-Beam-Ausrichtung vor jedem Experiment und danach etwa einmal pro Stunde nach diesem Verfahren durchzuführen. Andere Methoden, wie z.B. die quantitative Analyse, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Kolokalisation, zur subzellulären Lokalisation und zu molekularen Wechselwirkungen zu beantworten.