Name: Visualisierung der immunologischen Synapse von Dual Color Zeitgesteuerte Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Erfahren Sie die Visualisierung der immunologischen Synapse von NK-Zellen mit zweifarbigem STED-Nanoskopie. Diese Methode erreicht eine Auflösung unter 100 nm für Zytoskelett und Zytolysegranula.

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1. Coat Deckgläser mit Antikörper <ol><li> Vorgewärmte (37 ° C) 30 ml RPMI-10% FCS-Medium und 1 ml BD Cytofix / Cytoperm. </li><li> Eine Lösung von 5 ug / ml gereinigtem Antikörper in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Zur Aktivierung der NK92-Zelllinie, die Verwendung von anti-CD18-und Anti-NKp30 empfohlen. <ol><li> Mark etwa ein Cent großen Kreis für jede Bedingung auf einem Deckglas # 1.5 mit einem PAP-Stift. Unbefleckt, Dual gefärbt, und zwei Einzelbuntbedingungen: Für ein Zweifarben-Experiment sollte es vier Bedingungen. Verzichtet werden 200 ul der Antikörperlösung in jedem Bereich und bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Waschen Deck durch leichtes Eintauchen jeweils in 50 ml PBS in einem 50 ml konischen Röhrchen bei Raumtemperatur. Waschen sollte unmittelbar vor der Zugabe von Zellen und darauf geachtet werden, um Antikörper Trocknen auf dem Deckglas zu vermeiden auftreten. </li></ol></li></ol> 2. Aktivieren NK-Zellen auf Deckrutscht, Fix und permeabilisieren <ol><li> Isolieren Sie 5 x 10 5 Zellen pro NK92 Zustand. Zentrifugen und Dekantierstand. Einmal mit 10 ml vorgewärmtem Medium aus Schritt 1.1 waschen. Zentrifugen und Dekantierstand. <ol><li> Die Zellen in vorgewärmten Medien aus Schritt 1.1 in einer Konzentration von 2,5 x 10 6 / ml. </li><li> Vorsichtig dekantieren 200 ul zum Zentrum der Region in Abschnitt 1.2.1 erstellt. Inkubieren bei 37 ° C für 20 min bei 5% CO 2. (Anmerkung: diese Zeit verlängert oder verringert werden, je nach der biologischen Funktion von Interesse für die NK-Zell-Granulat Polarisation, 20 min ausreichend.). </li></ol></li><li> Nach der Inkubation der Zellen vorsichtig waschen Deckgläser durch Eintauchen jeweils in 50 ml PBS Raumtemperatur in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> 1 ul Triton X-100 zu 1 ml vorgewärmten Fix / Perm-Lösung aus Schritt 1.1 und gründlich vortexen. Fix und permeabilisieren durch Zugabe von 200 ul Fix / Perm-Puffer (Schritt 2.3) zu den Zellen. Inkubation: 10 min der Dunkelheit bei Raumtemperatur. </li></ol> 3. Stain Cells <ol><li> Vorbereitung Färbepuffer: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1% BSA, 0,1% Saponin. <ol><li> Bereiten Lösung des primären Antikörpers in 200 ul Färbepuffer (siehe Schritt 3.1). (Anmerkung: Antikörper sollte vor Gebrauch titriert werden). Vermeiden Sie die Verwendung von primären Antikörper, der in den gleichen zum Beschichten der Deckglas (Schritt 1.2) Arten ausgelöst wird. Vermeiden Sie auch Strepatividin-Biotin-Bindungen für STED-Bildgebung. </li><li> Nach Abschnitt 2.3.1, vorsichtig waschen Deckgläser in 50 ml Puffer Färbung. Dab Kanten der PAP-Pen-Region mit Wattestäbchen, um überschüssige Puffer zu entfernen. Bewerben Antikörper-Lösung in Abschnitt 3.1.1 erstellt. Inkubieren 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. (Empfohlen: Inkubation Deckschieber in-Box mit einem feuchten Papiertuch, um Feuchtigkeit zu halten). </li></ol></li><li> Bereiten Lösung des sekundären Antikörpers in 200 ul FärbungPuffer. Empfohlene Fluorophore Alexa Fluor 488, Pacific Orange und V500. Im Allgemeinen ist eine 1:200-Verdünnung für STED-Bildgebung. <ol><li> Behutsam Deckgläser in 50 ml Puffer Färbung. Dab Kanten der PAP-Pen-Region mit Wattestäbchen, um überschüssige Puffer zu entfernen. Bewerben sekundären Antikörperlösung. Inkubieren 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Wiederholen Waschen und Färbung für zusätzliche Proteine ​​von Interesse. Erfassen, wenn F-Aktin mit Phalloidin, kann dies mit sekundären Antikörper enthalten, die allgemein bei einer 1:200 Verdünnung. </li></ol> 4. Berg Deckgläser auf Folien <ol><li> Bereiten Montagemedium. Hinweis: Verlängern oder Prolong Gold-vorzuziehen. Vectashield müssen vermieden werden, da es nicht mit STED kompatibel. 2,2-thiodioethanol muss vermieden werden, wenn Phalloidin verwendet werden. Mowiol akzeptabel ist. </li><li> Es werden ca. 10-20 ul Eindeckmedium auf einer Folie. Invert Deckglas (Zellseite nach unten) und montieren Deckglas vorsichtig, wobei darauf zuvermeiden Einführung von Luftblasen. Die Objektträger für 24 h (Deckglas nach oben) vor der Bildgebung. </li><li> Siegel Kanten des Deckglases mit Nagellack. </li></ol> 5. Versuchsaufbau <ol><li> Initiieren erforderlich Laser-und Software. Initiieren STED Erschöpfung Laser bei 100% Leistung. Richten STED-Laser, der im Falle von kommerziellen Systemen ist oft ein automatisiertes Verfahren. </li><li> Fokus der Probe, beginnend mit Einzelbuntkontrolle, am Mikroskop mit Okularen. </li></ol> 6. Optimierung der Einstellungen <ol><li> Scannen Sie den ersten Kanal und optimieren Laserleistung, Erregung Strahlposition und Detektor-Bereich. Wenn möglich, vermeiden einen Gewinn von&gt; 100. Nehmen Sie das Bild in der konfokalen, um die Einstellungen zu optimieren. Linien-und / oder Bildmittelung wird die Auflösung zu erhöhen. Überprüfen Sie für Pixelsättigung. Hinweis: Einige Sättigung ist in der konfokalen akzeptabel Anwendung der STED wird die Intensität der Emission zu reduzieren. Für STED wird eine optimale Pixelgröße unter 30 nm sein, wieimmer bessere Auflösung wird mit kleineren Pixelgrößen erreicht werden. Die Größe der Region von Interesse, das abgebildet wird die untere Grenze der Pixelgröße zu diktieren. Kleinere Pixelgrößen Photobleaching zu erhöhen. <ol><li> Bewerben STED Erschöpfung Strahl und Bildaufnahme, beginnend mit 50% Erschöpfung Laserleistung. Wenn eine Verbesserung der Auflösung zu sehen ist, können weitere Verarmung Laserleistung aufgebracht werden. Auf dieser Stufe kann es notwendig sein Anregungslaserleistung, Leitungs Durchschnitt und / oder Verstärkung einzustellen. </li><li> Bewerben Zeit-Gating in den Hintergrund (mindestens 0,3 ns) zu reduzieren. Passen Sie die Einstellungen, bis eine Verbesserung der Auflösung über konfokalen gesehen werden kann. Auflösung kann durch Schätzen Halbwertsbreite (FWHM) angenähert werden. Dies ist der Abstand, bei dem die Hälfte der maximalen Intensität eines Gaußschen Spitzen erstellt, indem eine Linie Profil über die Struktur von Interesse, und ist eine weit verbreitete Methode zur Schätzung Auflösung. </li><li> Sobald der erste Kanal zufriedenstellend ist, initiieren eine zweite Folge für sichQuential Scannen. In der Regel ist es am besten, die längere Wellenlänge Fluorophor ersten scannen. Wiederholen Sie Schritt 6.1 auf zweiten Kanal. </li></ol></li><li> Mangel an spektrale Überlappung Bestätigen System einzelne Bunt Kontrollen mit beiden Scan-Sequenzen. Mild spektrale Überlappung kann mit spektralen un-Mixing-Funktionen in der Software korrigiert werden, jedoch sollte nach Möglichkeit vermieden werden. </li></ol> 7. Image Acquisition <ol><li> Erwerben Bilder. Für die quantitative Bildgebung, ist es empfehlenswert, mindestens 20 Bilder / Zustand zu erhalten. Die genaue Zahl sollte jedoch nach der experimentellen Frage im Konzert mit einem statistischen Ansatz wie Probengrößenberechnung definiert werden. Sparen Experiment. </li></ol> 8. Entfaltung <ol><li> Öffnen Sie die Datei mit Entfaltungs Software oder Stapelverarbeitung. Überprüfen Sie die Parameter für jeden Kanal mit Hilfe von Software. Bestätigen Anregungs-und Emissionsspektren der einzelnen Kanäle, STED Erschöpfung Emission und Bildrichtungtion (nach oben oder unten, wenn das Bild 3-dimensional) im besonderen. </li><li> Entfalten, mit der Entfaltung Assistenten. Standardeinstellungen sind in der Regel ausreichend, jedoch Rausch-Verhältnis (sntr) Signal vom Fluorophor Fluorophor variieren und müssen für jeden Kanal und jedes Experiment individuell bestimmt werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren. Teilweise Veröffentlichung Kosten dieser Artikel wurde von Leica Microsystems, Inc. bestritten

Die Verbesserung der Auflösung über konfokale wird etwas abhängig von Faktoren, die nicht kontrolliert werden können. Diese Faktoren schließen kleinere Aberrationen in Deckglasdicke und Ungereimtheiten bei der Montage Medien. Es ist wichtig, die Temperatur und Feuchtigkeit in dem Abbildungsraum so konstant wie möglich zu halten, und die STED-Strahl sollte etwa alle 60 min ausgerichtet werden. Wie im Verfahren erwähnt, muss Einsatz von Vectashield Montagemedium vermieden werden, da dies nicht mit der STED-kompatibel. Zusätzlich zu dem, sollte man immer mit # 1.5 Deckgläser, und wenn vorhanden, verwenden solche, die zu einer bestimmten Dicke verifiziert worden sind. Eine Modifikation der hier beschriebenen Ansatz ist es, Bild zusätzliche Kanäle in der konfokalen mit Fluorophore, die bei einer längeren Wellenlänge als der STED-Strahl emittieren. Auf diese Weise kann ein Bild bis zu vier Kanälen (zwei in der konfokalen, zwei in STED). Wenn die diesen Ansatz jedoch die Kanäle mit Fluorophore emitting über der STED-Laser Erschöpfung müssen zuerst abgebildet werden, als Anwendung der STED-Strahl Photonen in diesen Kanälen führen. Ein Vorteil dieser Technik ist die Anwendung von Zeit-Gating, die auch in der konfokalen Auflösung zu verbessern, indem Emission von Photonen mit kurzer Lebensdauer 34. Insbesondere wird der Einsatz von Zeit-Gating, den Zeitpunkt der Emissionsdetektoren mit gepulster Anregung STED entsprechen, Hintergrundfluoreszenz von Reflexion Deckglas zu verringern, wenn die Abbildung in dessen Nähe. Selbst in einem Experiment nicht für STED geeignet, wenn mit einem gepulsten Anregungsquelle, Zeit-Gating kann ein nützliches Instrument zur Verbesserung der Auflösung in der konfokalen sein. Es gibt verschiedene Modifikationen, die genutzt werden können, um die Auflösung in der STED verbessern. Einer ist, die Größe der Lochblende von der Standard 1 Airy Einheit zu verringern, obwohl dies auch die Menge an Licht, das die Probe zu verringern. Dies kann durch Erhöhung las kompensiert werdener Macht oder Gewinn. Eine andere ist, Rauh erhöhen, was die Menge an Informationen für jedes Photon gesammelt erhöhen wird, die Verbesserung der Auflösung. Wiederum kann dies jedoch auf Kosten der Photobleichung der Probe sein, damit ein Gleichgewicht muss zwischen Auflösung und Bleich gefunden werden. Ebenso wird die Verwendung von fluoreszierenden Proteine ​​wie GFP sorgfältige Optimierung erfordern, um die Bleich vermeiden. Dies kann durch eine Verringerung der STED-Laserleistung bei Bedarf durchgeführt werden. Längere Zeitpunkte werden auch für größere Photonen Erholung zu ermöglichen und zu reduzieren Bleichen. Korrektur für Photobleaching sollte bei der Analyse von Live-STED berücksichtigt werden. Natürlich ist Bildgebung in 3 Dimensionen in STED auch möglich, und wird auch eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen konfokalen Abbildung geben. Dies gilt insbesondere, wenn es in Kombination mit Dekonvolution durchgeführt wird, wobei darauf zu achten, um die Drift, die während der Bild mehreren Ebenen in der z-Achse erfolgt korrigieren. Bei Verwendung von Huygens Softwarezu entfalten, ist diese Korrektur mit der &quot;Bild stabilisieren&quot;-Funktion erhalten. Mit diesem Ansatz wird eine Auflösung in der z-Achse verbessert werden. Dies ist eine große Verbesserung gegenüber herkömmlichen konfokalen Bildgebung, die schlechte axiale Auflösung hat, und sogar über sich selbst nur STED, die auch eine relativ schlechte Auflösung der z-Achse. Während Erwerb mehrere Stapel in STED, muss darauf geachtet werden, um ein Ausbleichen der Probe zu vermeiden, und wenn nötig kann man Linie Mittelung oder Laserleistungsstärke, um so zu tun zu reduzieren. Wiederum sei darauf hingewiesen, dass, wenn die Abbildung anderer Fluorophore, die nicht geeignet sind für STED Anwendung des Verarmungsstrahls in der ersten sequentiellen Abtastung würde Emission aus diesen Kanälen zu verhindern. Daher ist eine gemischte STED / konfokalen Ansatz (bei Verwendung der konfokalen Scan in Kanäle, die bei einer Wellenlänge größer als 592 nm emittieren) wird leider nicht geeignet für 3D sein. Zusammenfassend haben wir STED als Ansatz aufgrund seiner relativen Einfachheit der App ausgewähltlichung und Verbesserung der Auflösung gegenüber Standard-konfokale Bildgebung. Für die Abbildung der Immunsynapse ist es eine effektive und wertvolle Technik, die uns zu Details in F-Actin-Architektur nicht möglich, bei einer Auflösung von mehr als 200 nm sehen können bewährt. Während viele dieser Details scheinen subtile, können sie eine tiefgreifende Wirkung auf die NK-Zell-Funktion. So werden wir die Anwendung der neuesten Imaging-Technologie, um nanoskopische Gewinnung von Informationen, die entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gesundheit des Menschen ist.

Die immunologische Synapse ist ein komplexes Milieu von Signalproteinen und Zytoskelett-Elemente. Die zytolytische Synapse wurde ursprünglich als mit einer &quot;Bullaugen&quot;-Struktur mit einem Ring aus Aktin und Adhäsionsmoleküle um einen zentralen sekretorischen Domain 1-4 beschrieben. Allerdings wissen wir jetzt, dass es aus der mikroskopischen Domänen aktives Melde, die eine kontinuierliche dynamische Reorganisation des Zytoskeletts für die Funktion benötigen 5-11. Viele der Informationen, die wir jetzt haben, über die Synapse ist von Mikroskopie abgeleitet und Immunologen haben Early Adopters von innovativen Imaging-Technologie. Eine dieser neuen Technologie ist Super-Resolution-Mikroskopie. Konventionelle Lichtmikroskopie ist räumlich durch die Beugungsgrenze des Lichts, das die untere Grenze der Auflösung der Fluoreszenzmikroskopie für alle, einschließlich der konfokalen, bei ca. 200 nm setzt begrenzt. In den letzten Jahren wurden verschiedene Techniken wurden developed, die Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze zu ermöglichen. Dazu gehören Stimulation Emission Depletion-Mikroskopie (STED), Structured Illumination Microscopy (SIM), stochastisch gelöst Mikroskopie (STORM) und photoaktivierbares Lichtmikroskopie (PALM). Diese Techniken wurden an anderer Stelle ausführlich 12-15 gelesen, dennoch werden im Folgenden erläutert. Subdiffraction begrenzte Auflösung wird in einzigartiger Weise in jedem System erzeugt. Die Auswahl der Super-Auflösungstechnik sollte daher durch das Experiment und Versuchssystem von Interesse bestimmt werden. STED Super Resolution wird mit einem hochintensiven Ringkernstrahl Erschöpfung, die selektiv &quot;Schweigen&quot; Fluoreszenz um jedes Fluorophor von Interesse nach der Anregung, was subdiffraction begrenzten Fluoreszenzmikroskopie 16-18 erreicht. Ein Vorteil ist, dass STED-Bildaufnahme ist schnell und erfordert relativ wenig Nachbearbeitung. Während die Farbstoffauswahl wird durch die Spezifikation vorgegebenLaufstellung der Sperrbalken, der in dem im Handel erhältlichen Systems bei 592 nm liegt, sind mehrere im Handel erhältliche Farbstoffe zur Verfügung, die Kombinationen von zwei Fluorophoren zu ermöglichen. Zusätzlich können häufig verwendete fluoreszierende Reporter wie GFP abgebildet werden, wodurch der Lebendzellexperimente möglich 19,20. Wir haben früher verwendet STED zur Identifizierung und Quantifizierung Regionen von F-Aktin Hypodensität die von NK-Zellen für die Degranulation 21,22 verwendet werden. Wir schlagen vor, dass STED ist eine gute Wahl für die Abbildung der Immunsynapse aufgrund seiner relativ flexible Verfügbarkeit der Fluorophore und überlegene Verbesserung der Auflösung in der xy-Achse. Zusätzlich zu den im Handel erhältlichen STED System für diese Experimente verwendet, ermöglicht eine schnelle Erfassung von Bildern mit minimalen Schäden an Proben die Verwendung einer hohen Geschwindigkeit (12.000 Hz) Tomographen. Eingeschränkte Flexibilität in Farbstoffauswahl gilt als ein Nachteil der STED-12,jedoch zweifarbigen STED ist relativ einfach mit einigen handelsüblichen Fluorophore. Die Integration der STED mit einem konfokalen Laserrastermikroskop bietet außerdem zusätzliche konfokale Bildgebung in Kombination mit STED, also, während STED ist auf zwei Kanäle, zusätzliche Strukturen in der konfokalen mit einer Auflösung von etwa 200 nm (E. Mace, unveröffentlichte Beobachtungen abgebildet werden ). Während wir beschreiben die Verwendung von STED zum Abbilden Immunzellen ist diese Technologie auf eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich neuronaler Zellen, und zur Visualisierung einer Vielzahl von Zellstrukturen 23-26 angelegt. SIM verwendet einen anderen Ansatz, um subdiffraction begrenzte Bilder zu erzeugen. Durch die Visualisierung bekannten periodischen Erregungsmuster können dann Informationen über den unbekannten Struktur, die folgende mathematische Transformation 27 studierte erhalten werden. Dies ergibt eine Erhöhung der Auflösung auf ~ 100 nm seitlich 28,29. Der Vorteil ist, dass es SIM-is mit allen Standard-konfokalen Farbstoffe und Sonden-kompatibel, aber der Nachteil ist, dass es viel langsamer, um Bilder zu erwerben und diese erfordern eine lange Post-Processing-12. Dies schränkt auch die Verwendung für Live Cell Imaging. Schließlich kann Super-Resolution-Bilder durch stochastische Foto-Schalt Fluorophore erzeugt werden. Dieser Ansatz wird in photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) und stochastischen optischen Rekonstruktion Mikroskopie (STORM) ausgebeutet. Durch das Scannen von mehreren Kamerarahmen und Lokalisierung von aktivierten Moleküle zufällig &quot;on&quot; und &quot;off&quot;, die im Laufe der Zeit eingeschaltet sind, werden die Bilder mit 20-30 nm Auflösung von angesammelten 30-32 Frames generiert. Die Trade-off für diese Auflösung ist die erforderliche Zeit, um Bilder zu erwerben. Hier zeigen wir im Detail, das Protokoll für die Vorbereitung und Dual Imaging Farbproben in STED. In diesem System ist die Anregung mit einer gepulsten, abstimmbaren, Weißlichtlaser. Aufgrund der Naturder gepulsten Anregungsstrahl wird die Zeit-Gating Nachweis möglich gemacht und ein weiterer Anstieg Auflösung. Darüber hinaus ist das System mit Gadolinium Hybrid (HYD)-Detektoren, die empfindlicher als herkömmliche Photovervielfacherröhren sind ausgestattet, so dass für niedrigere Laserleistungsanforderungen. Die Erschöpfung Strahl zur STED kontinuierlich angelegt und auf 592 nm, die die Wahl von Farbstoffen für die zwei Farb STED verfügbar diktieren abgestimmt. Häufig verwendete Farbstoff-Kombinationen sind in der Regel eine erregbare von 488 nm (wie Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights grün oder Chromeo 488) und eine erregbare von 458 nm (wie Pacific Horizon orange oder V500). Während also Detektion der beiden Farbstoffe wird in einem ähnlichen Bereich (und beide sind durch die Verarmungslaser zugänglich), Erregung mit verschiedenen Wellenlängen liegen. Mit einem abstimmbaren Weißlichtlaser und abstimmbare Detektoren, die Maximierung Signal, während die Beseitigung spektrale Überlappung ist ziemlich leicht gemacht. Als solche haben wir gute Erfolge mit Kombination hatteIonen von kommerziell erhältlichen Farbstoffen, wie Pacific Orange und Alexa Fluor 488 (verwendet). Unser Protokoll ist auf maßgeschneiderte und beschreibt die Bewertung der menschlichen NK-Zellen wie den historischen Schwerpunkt unserer Labor darstellt. Wir sind speziell die Nutzung der NK92-Zelllinie in diesem Beispiel, wie das ist, den wir regelmäßig in unserer experimentellen Arbeit 21,33 aufgebracht.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Deckgläser</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Applikator mit Wattespitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>S450941</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Zentrifugenröhrchen (50 ml)</td><td>VWR</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS) (500 ml)</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11050</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Pacific Orange</td><td>Life Technologies</td><td>P31584</td><td></td></tr><tr><td>Labor-Gewebewischer</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>NK-92 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Verlängerndes Anti-Fade-Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigtes Anti-CD18</td><td>Biolegend</td><td>301202</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigtes Anti-NKp30</td><td>Biolegend</td><td>325202</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigtes Anti-Perforin</td><td>Biolegend</td><td>308102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium ( 500 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Saponin aus Quillaja-Rinde</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>Life Technologies</td><td>008899</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Dekonvolutionssoftware</td><td>SVI</td><td>Kontakt Firma</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED Mikroskop</td><td>Leica Mikrosysteme</td><td>Kontakt Unternehmen</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung der immunologischen synapse von dual color zeitgesteuerte stimulated emission depletion (sted) nanoskopie

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natürliche Killerzellen bilden streng reguliert, fein abgestimmte immunologischen Synapsen (IS), um viral infizierte oder tumorerzeugende Zellen zu lysieren. Dynamische Aktinreorganisation ist entscheidend für die Funktion der NK-Zellen und die Bildung des IS. Imaging von F-Aktin an der Synapse ist traditionell genutzt konfokale Mikroskopie, aber die Beugungsgrenze des Lichts beschränkt Auflösung der Fluoreszenz-Mikroskopie, konfokale darunter, etwa 200 nm auf. Jüngste Fortschritte in der Imaging-Technologie haben die Entwicklung der subdiffraction begrenzten Super-Resolution Imaging aktiviert. Um F-Actin-Architektur an der IS visualisieren rekapitulieren wir die NK-Zell-zytotoxischen Synapse durch Ankleben NK-Zellen zu aktivieren Rezeptor auf Glas. Wir haben dann Bild Proteine ​​von Interesse mit Zwei-Farben-stimulated emission depletion-Mikroskopie (STED). Dies führt zu &lt;80 nm Auflösung an der Synapse. Hier beschreiben wir die Schritte der Probenvorbereitung und der Akquisition von Bildern mit Dual-col beschreibenSTED Nanoskopie oder F-Aktin an der NK visualisieren IST. Wir veranschaulichen auch die Optimierung der Probennahme mit Leica SP8-Software und gated STED-Zeit. Schließlich nutzen wir Huygens-Software für die Nachbearbeitung Entfaltung der Bilder.

Klar ist, dass ein Hauptziel der Super-Resolution Imaging eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. Allerdings gibt es einige Fallstricke, die zu suboptimalen Auflösung führen kann. Diese verlangen, dass jedes Experiment individuell optimiert werden. In unserer repräsentativen Experiment, wir sind die Abbildung der F-Actin-Netzwerk in einem NK-Zellen durch Antikörper gebunden an Glas aktiviert. Häufige Ursachen von (und für Korrekturen) einen Mangel der verbesserten Auflösung der STED über konfokalen sind wie folgt: <ol><li> Unter-Abtastung (Abbildung 1a). Dies kann zu Körnigkeit und Verlust von Pixelinformationen führen, wie durch schlechte Auflösung von F-Aktin-Filamenten gezeigt. Erhöhte Linie oder Bildmittelung kann oft korrigieren. </li><li> Bleich-und / oder Überabtastung (Abbildung 1b). Dies kann durch langwierige Pixelverweilzeit infolge übermäßigen Mittellinie hervorgerufen werden. Alternativ kann es aufgrund der Überabtastung des Bildes vor der Übernahme, einschließlich Übernutzung seindie Verarmungs Laser. Dies führt häufig in trübe oder unscharfe Bilder. Dies kann durch das Scannen des Interessengebiet nur minimal vor dem Erwerb oder, wenn möglich, die Erhöhung Laserscangeschwindigkeit korrigiert werden. Wenn das Problem weiterhin besteht, können die Erschöpfung Laserleistung reduziert werden. </li></ol> Mit dem Erreichen der richtigen Balance von Pixelverweilzeit, Erregung Laserleistung und Erschöpfung Laserleistung, ein Bild mit verbesserter Auflösung und ausreichende Informationen generiert werden können (Abbildung 1c). Auflösung kann durch die Verwendung der Entfaltungs (1d) verbessert werden. Beim Erwerb optimiert ist, wird Entfaltung Auflösung qualitativ und quantitativ zu verbessern und sub-100 nm Auflösung sollte routinemäßig erreichbar sein. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> Abbildung 1. Optimierung der Erwerb und die Fallstricke des STED-Bildgebung. NK92-Zellen wurden auf Anti-CD18 und NKp30-beschichtetes Glas für 20 min aktiviert, dann fixiert, permeabilisiert und für die F-Aktin mit Phalloidin Alexa Fluor 488 gefärbt. A) Ein Beispiel für Verlust von Bildinformationen durch Unterabtastung. b) Ein Beispiel für Verlust der Auflösung durch Bleichen / Oversampling c) Bedingungen optimiert d) optimierten Bedingungen führen zu einer größeren Verbesserung der Auflösung mit Entfaltung. Maßstabsbalken = 5 um.

Hier veranschaulichen wir das Protokoll für die Bildgebung durch Zwei-Farben-STED Nanoskopie die zytotoxische Immunsynapse von NK-Zellen auf Glas rekapituliert. Mit dieser Methode erhalten wir sub-100 nm Auflösung von Synapsen-Proteine ​​und des Zytoskeletts.

Visualisierung der immunologischen Synapse von Dual Color Zeitgesteuerte Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Strukturen wie F-Aktin in der lytischen Synapse von NK-Zellen mittels TED-Mikroskopie sichtbar zu machen. Dies wird zunächst erreicht, indem die Synapse auf Glas mithilfe eines aktivierenden Antikörpers nachgebildet wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen zu fixieren, zu permeabilisieren und für die Strukturen von Interesse zu färben.Anschließend werden die Objektträger mittels Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie abgebildet, gefolgt von der Anwendung einer STED-Abschirmung zur Erhöhung der Bildauflösung. Der letzte Schritt besteht in der Bildverarbeitung unter Verwendung eines Entfaltungs-Algorithmus. Letztendlich können Ergebnisse eine Auflösung unter 100 Nanometern zellulärer Strukturen dank dualer Farb-STED und Endoskopie zeigen.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie beantworten, beispielsweise der Zusammenhang zwischen dem Cytoskelett und der Exocytose. In unserem Fall interessiert uns die Sekretion spezialisierter Lysosomen, sogenannter lytischer Granula, durch natürliche Killerzellen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da mehrere Variablen bei der Anwendung des TED-Depletionslasers angepasst werden können.Eine unsachgemäße Anwendung des Depletionsstrahls führt zu einer Verschlechterung statt einer Verbesserung der Auflösung. Zum Vorbereiten erwärmen Sie 30 Milliliter RPMI-Medien mit 10 % FCS sowie separat ein Milliliter BD CY effects cyop perm auf 37 Grad Celsius. Beginnen Sie anschließend mit dem Beschichten der Deckgläser mit Antikörpern.Nehmen Sie Deckgläser der Größe 1,5 und verwenden Sie einen PAP-Stift, um münzgroße Quadrate auf den Deckgläsern zu zeichnen. Bereiten Sie ein Quadrat für jede getestete Bedingung vor.Beladen Sie jeden Kreis mit 200 Mikrolitern Antikörper in einer Konzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter in PBS. Verwenden Sie für die Aktivierung von NK-92-Zellen Anti-CD-18- und Anti-NKp30-Antikörper. Inkubieren Sie die beladenen Deckgläser eine halbe Stunde bei 37 Grad Celsius und waschen Sie sie anschließend durch Eintauchen in PBS bei Raumtemperatur ab. Fahren Sie unmittelbar mit dem Hinzufügen der Zellen für jede getestete Bedingung fort; 500.000 Zellen müssen einsatzbereit sein.Waschen Sie die Zellen in 10 Milliliter vorgewärmtem Medium und resuspendieren Sie sie anschließend in dem gleichen erwärmten Medium. Bei einer Dichte von 2,5 Millionen Zellen pro Milliliter mit vollständig suspendierten Zellen, pipettieren Sie 200 Mikroliter in jedes Antikörper-Feld auf den Deckgläsern. Inkubieren Sie die Deckgläser mit den Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2. In diesem Fall sind 20 Minuten ausreichend, um die Granula in den NK-Zellen zu polarisieren. Nach der Inkubation waschen Sie die Deckgläser vorsichtig mit PBS bei Raumtemperatur.Beginnen Sie damit, einen Mikroliter TRITTON X 100 zu einem Milliliter warmer BD CY Effects Cyto Perm-Lösung hinzuzufügen. Anschließend wirbeln Sie die Lösung kurz im Vortex. Geben Sie 200 Mikroliter dieser Lösung auf jedes Bedingungsquadrat auf den Deckgläsern.Bringen Sie die Zellen dann im Dunkeln bei Raumtemperatur an und warten Sie 10 Minuten. Nach Beendigung der Inkubation waschen Sie die Deckgläser vorsichtig in Puffer für die Färbung. Danach trocknen Sie die Ränder der umgebenen Bereiche mit einem Wattestäbchen ab.Fügen Sie anschließend 200 Mikroliter des primären Antikörpers in Färbe-Puffer zu den umrandeten Bereichen hinzu und lassen Sie die Deckgläser eine halbe Stunde im Dunkeln inkubieren. Zu den geeigneten sekundären Antikörpern für stabile Abbildungen gehören Alexa Fluor 488, Pacific Orange und Horizon V500. Jeder dieser Antikörper wirkt gut bei einer Verdünnung von 1 zu 200.Nach der Inkubationswäsche die Deckgläser in der Färbepufferlösung waschen und sie vorsichtig trocken tupfen. Wie zuvor 200 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung auf jedes Probefeld auftragen. Anschließend 30 Minuten im Dunkeln ruhen lassen.An diesem Punkt können nach weiteren Waschschritten zusätzliche Antikörper hinzugefügt werden. Beispielsweise kann Phin im Verdünnungsverhältnis 1:200 zur Detektion von f-Aktin verwendet werden. Als Eindeckmedium sollte Prolong gegenüber Vector Shield gewählt werden, da letzteres nicht mit STEAD kompatibel ist.Wenn die Phin-Färbung verwendet wird, vermeiden Sie die Verwendung von zwei zwei Thioethanol, während jedoch in Ordnung ist. Geben Sie nun 10 bis 20 Mikroliter Eindeckmedium auf einen Objektträger. Senken Sie die Deckglasabdeckung unter Umkehrung vorsichtig in das Medium ein, wobei Luftblasen vermieden werden sollen. Inkubieren Sie anschließend den Objektträger 24 Stunden lang.Mit der Abdeckung am nächsten Tag vorsichtig schieben, den Deckglaser mit Nagellack versiegeln und mit der Bildaufnahme fortfahren. Starten Sie die Laser und die Software. Der STED-Laser sollte mit 100 % Leistung aufgewärmt und justiert werden.Das Probengebiet mit dem Okular fokussieren, dann zur Software wechseln. Den ersten Kanal scannen, also den mit der längsten Wellenlänge. Etage vier, die Laserleistung, die Position des Anregungsstrahls und den Detektorbereich optimieren.Vermeiden Sie Einstellungen über 100. Erfassen Sie als Nächstes ein konfokales Bild und prüfen Sie es auf Pixel. Sättigung, Zeilen- und Bildmittelung verbessern beide die Pixelauflösung. Das Ziel ist, unter 30 Nanometern pro Pixel zu liegen. Eine gewisse Sättigung ist für STED akzeptabel. Anschließend wird der STED-Auslöschstrahl bei 50 % Leistung angewendet und ein Bild aufgenommen.Wenn sich die Auflösung verbessert, kann mehr Leistung angewendet werden. Außerdem könnte die Auflösung durch Anpassen der Anregungslaserleistung, der Zeilenmittelung oder des Verstärkungsfaktors verbessert werden. Um die Hintergrundstrahlung zu verringern, wenden Sie 0,3 Nanosekunden Zeitgating an und erhöhen Sie diesen Wert schrittweise.Die neue Auflösung sollte mithilfe einer Berechnung der vollen Halbwertsbreite geschätzt werden. Sobald zufriedenstellende Ergebnisse erzielt sind, wiederholen Sie diese Schritte mit dem zweiten Kanal, nachdem alle Kanäle angepasst wurden. Überprüfen Sie mithilfe von Einzelfärbekontrollen unter Verwendung aller Scansequenzen auf spektrale Überlappung.Eine geringe Überlappung kann mithilfe der Software durch spektrale Entmischung korrigiert werden, sollte jedoch am besten vermieden oder auf ein Minimum beschränkt werden. Erstellen Sie nun Bilder für die quantitative Bildgebung. Nehmen Sie je nach experimentellen Bedingungen mindestens 20 Bilder pro Bedingung auf.Um die gespeicherten Bilder zu entfalten, öffnen Sie die Dateien in der entsprechenden Software. Überprüfen Sie die Parameter jedes Kanals, insbesondere die Anregungs- und Emissionsspektren, die stetige Depletionsemission sowie die Bildaufnahmerichtung. Wenden Sie anschließend die Entfaltungsberechnungen der Software an.Die Standardeinstellungen sind in der Regel ausreichend, aber das Signal-Rausch-Verhältnis variiert je nach Bodenkraft, sodass dieser Parameter für das Experiment manuell festgelegt werden muss. Es gibt einige häufige Fehlerquellen, die zu einer suboptimalen Auflösung mit stead führen können. Eine davon ist die Untersampling. Dies führt zu einer Körnigkeit und einem Verlust von Pixelinformationen, wie beispielsweise bei diesen F-Aktin-Filamenten. Eine Erhöhung der Zeilen- oder Bildmittelung behebt dieses Problem häufig. Ein weiteres Problem ist die Ausbleichung oder Übersampling, verursacht durch eine zu lange Pixelbelichtung.Die Verweilzeit, die normalerweise auf übermäßiges Zeilenmitteln während des Scannens vor der Bildaufnahme zurückzuführen ist, kann ebenfalls die Ursache sein und lässt sich durch ein kleineres Scan vor der Bildaufnahme oder durch eine höhere Scan-Geschwindigkeit korrigieren. Eine Verringerung der Laserleistung kann ebenfalls zur Verbesserung beitragen. Das Bild wird sich deutlich verbessern.Durch die Dekonvolution wird das Bild weiter verbessert, sowohl quantitativ als auch qualitativ. Bei Durchführung dieses Verfahrens sollte routinemäßig eine Auflösung unter 100 Nanometer erzielt werden.Es ist wichtig, daran zu denken, vor jedem Experiment und danach etwa einmal pro Stunde gemäß diesem Verfahren eine stabile Strahlausrichtung durchzuführen. Andere Methoden wie die quantitative Analyse können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Kolokalisation, der subzellulären Lokalisation und molekularer Wechselwirkungen zu beantworten.

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