Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Aktin- und Mikrotubuli-Zytoskelette an der B-Zell-Immunsynapse für die stimulierte Emissionsdepletion (STED-Mikroskopie) zu färben und ihre Struktur und Organisation in räumlichen Beziehungen abzubilden. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Organisation des Zytoskeletts während der B-Zell-Aktivierung zu beantworten, einschließlich der Reorganisation des Aktins und der Mikrotubuli-Zytoskelette während der Bildung von Immunsynapsen. Der Hauptvorteil der mehrfarbigen STED-Mikroskopie besteht darin, dass sie die gleichzeitige Abbildung des Aktin-Zytoskeletts, des Mikrotubuli-Netzwerks und der wichtigsten mit dem Zytoskelett assoziierten Proteine mit einer Auflösung im Nanometerbereich ermöglicht.

Obwohl diese Methode Einblicke in die B-Zell-Aktivierung geben kann, kann sie auch auf die Immunsynapsenbildung anderer Immunzelltypen wie natürlicher Killer- und T-Zellen angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, feststellen, dass die Optimierung der Mikroskopeinstellungen für die gleichzeitige Bildgebung und mehrere Fluorophore mit STED etwas Übung erfordert. Neben Jia und Madison werden Kate Choi und Caitlin Pritchard dieses Verfahren vorführen.

Beginnen Sie mit der Zentrifugation von 2,5 mal 10 bis 6. A20 B-Lymphomzellen pro Transfektion und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Transfektionsreagenz, ergänzt mit einem bis 2,5 Mikrogramm der Plasma-DNA von Interesse. Mischen Sie die Lösungen vorsichtig und überführen Sie jedes Aliquot der Zellen in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte. Stellen Sie das Volumen in jeder Vertiefung auf zwei Milliliter mit 37 Grad Celsius Vollmedium ein und legen Sie die Zellen für 18 Stunden in einen 37 Grad Celsius Inkubator.

Tauchen Sie am nächsten Morgen 1,5 18 Millimeter runde Glasdeckgläser in 100%Methanol und lassen Sie die Deckgläser etwa 10 Minuten lang vollständig trocknen. Legen Sie die getrockneten Deckgläser in einzelne Vertiefungen einer 12-Well-Gewebekulturplatte und geben Sie 400 Mikroliter Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin-G-Antikörper in die Mitte jedes Deckglases, so dass sich in der Mitte eine Blase bildet, die sich zu den Rändern ausbreitet, ohne in die Vertiefung zu tropfen. Inkubieren Sie die Deckgläser 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Spülen Sie dann die Deckgläser dreimal mit einem Milliliter sterilem PBS pro Vertiefung aus, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Lagern Sie nach der letzten Wäsche jedes Deckglas in einem Milliliter frischem, sterilem PBS bis zur Zellaussaat. Wenn die transfizierten Zellen fertig sind, sammeln Sie sie durch Zentrifugation in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und suspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter modifizierter HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, die mit FBS ergänzt wird.

Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von zwei x 10 bis 5 Zellen pro Milliliter und modifizierte HEPES-gepufferte Kochsalzlösung plus FBS und übertragen Sie jedes Deckglas mit einer Pinzette auf ein Stück Paraffinfilm. Geben Sie 250 Mikroliter Zellen auf jedes Deckglas und inkubieren Sie die Deckgläser 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln, damit sich die Zellen auf den mit Anti-Immunglobulin G beschichteten Oberflächen ausbreiten können. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die überschüssige Kochsalzlösung von jedem Objektträger und beschichten Sie jedes Deckglas mit 350 Mikrolitern Fixiermittel, wobei Sie darauf achten müssen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist.

Nach 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur das Fixiermittel vorsichtig mit einer Mikropipette vom Rand jedes Deckglases absaugen und die Deckgläser mit 500 Mikrolitern Permeabilisierungs- und Blockierungspuffer waschen. Dann permeabilisieren und blockieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern frischem Permeabilisierungs- und Blockierungspuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Entfernen Sie anschließend den überschüssigen Puffer und markieren Sie die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit 50 Mikrolitern des primären Antikörpers von Interesse.

Am Ende der Inkubation waschen Sie das Deckglas dreimal mit 500 Mikrolitern Färbepuffer pro Waschgang und geben Sie 50 Mikroliter des entsprechenden Sekundärantikörpers für 30 Minuten bei Raumtemperatur in jedes Deckglas. Nach dem Waschen des Sekundärantikörpers geben Sie 10 Mikroliter Eindeckreagenz auf einen Objektträger und montieren Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach unten auf die einzelnen Objektträger. Lassen Sie die Objektträger dann über Nacht im Dunkeln trocknen, um sie am nächsten Tag zu fotografieren.

Um die Zellen mit der STED-Mikroskopie abzubilden, schalten Sie zunächst das STED-Mikroskop ein. Aktivieren Sie die Laser in der Epifluoreszenzbeleuchtungslampe und öffnen Sie die Mikroskopsoftware. Stellen Sie die Parameter für die STED-Verarmungslaser ein und laden Sie die erste Probe auf das Mikroskop.

Fokussieren Sie mit dem Okular manuell auf die Probe, um eine Zelle mit einer moderaten GFP-Expression auszuwählen. Vergrößern Sie die ausgewählte Zelle, und wählen Sie den interessierenden Bereich aus, der abgebildet werden soll. Stellen Sie den Fokus so ein, dass die XY-Ebene der Zelle, die dem Deckglas am nächsten liegt, scharf ist.

Aktivieren Sie dann auf der Registerkarte "Erfassen" der Software die Option "Zwischen Frames" im Bedienfeld "Sequenzieller Scan", um die Bildaufnahme auf sequenzielle Frame-Erfassung einzustellen. Stellen Sie die STED-Laserleistung für jedes Fluorophor ein und verwenden Sie den Schieberegler, um die Laserleistungen entsprechend den im Experiment verwendeten Fluorophoren anzupassen. Um die Auflösung zu erhöhen und das Hintergrundsignal zu reduzieren, öffnen Sie die Aufnahmeeinstellungen und verwenden Sie das Dropdown-Menü, um einen Wert größer als eins auszuwählen, um die Zeilen- und/oder Frame-Mittelung zu erhöhen.

Überprüfen Sie die Verstärkungsoption für jedes Fluorophor und die spezifischen Werte für die Zeitgewinnung, um das geeignete Fluoreszenzsignal für zeitgesteuertes STED zu erfassen, und erhöhen Sie die STED-Laserleistung, um die Auflösung zu verbessern. Es ist von entscheidender Bedeutung, die Erfassungszeit für die Mikroskopprobe und die verwendeten Fluorophore zu optimieren, um die Auflösung zu verbessern, ohne zu viel vom Fluoreszenzsignal zu verlieren. Erfassen Sie dann manuell mehrere Bilder, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, und entfalten Sie die Bilder mit einem Dekonvolutionssoftwarepaket gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Für A20-B-Lymphomzellen auf immobilisierte NT-Immunglobulin-Antikörper verteilen. Die STED-Mikroskopie, die in Verbindung mit einer Dekonvolutionssoftware verwendet wird, liefert Bilder von Zytoskelettstrukturen mit höherer Auflösung als die konfokale Mikroskopie allein. Obwohl die Entfaltung konfokaler Bilder zu einer erheblichen Verbesserung der Bildauflösung führt, liefern entfaltete STED-Bilder detailliertere strukturelle Informationen als entfaltete konfokale Bilder.

Einfarbige STED kann auch verwendet werden, um dreidimensionale hochauflösende Bilder des gesamten B-Zell-Zytoskelettnetzwerks aufzunehmen. In diesen mehrfarbigen STED-Bildern kann die Färbung des peripheren Rings des dendritischen Aktins in Verbindung mit der Mikrotubuli-Färbung beobachtet werden. Bei der Verwendung von Zellen, die mit fluoreszierenden Fusionsproteinen transfiziert wurden, sind das Erreichen optimaler Expressionsniveaus und die Vermeidung von Artefakten aufgrund von Überexpression wichtige Überlegungen, während eine zu geringe Expression des fluoreszierenden Fusionsproteins ebenfalls zu einer schlechten Bildqualität führt.

Eine sorgfältige Fokussierung, um den gesamten interessierenden Bereich einzubeziehen, ist ebenfalls unerlässlich. In diesem Bild befanden sich beispielsweise nur Teile des Mikrotubuli-Netzwerks innerhalb der Brennebene, die dem Deckglas am nächsten lag, was eine vollständige Analyse der Probe verhinderte. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen abgeschlossen werden.

Ein Tag für die Probenvorbereitung und Färbung und ein Tag für die STED-Bildgebung. Es ist wichtig, daran zu denken, die Menge an Plasma, die zur Transfizierung der Zellen verwendet werden soll, zu titrieren, damit Sie eine ausreichende Expression des fluoreszierenden Proteins für den Nachweis während der Bildgebung erhalten und gleichzeitig Artefakte durch Überexpression vermeiden. Nach diesem Verfahren kann die Expression verschiedener fluoreszierender Fusionsproteine induziert werden, um die Lokalisierung anderer Proteine zu erleichtern, die die Dynamik und Organisation des Zytoskeletts regulieren, oder um die subzelluläre Verteilung von Proteinen zu visualisieren, die an anderen zellulären Prozessen beteiligt sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die STED-Mikroskopie für die Bildgebung von Zytoskelettstrukturen und Proteinen einsetzen können, die an der Bildung von Immunsynapsen beteiligt sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Fixiermitteln wie Glutaraldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Verwendung dieser Art von Reagenzien immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem chemischen Abzug getroffen werden sollten.