Heterotope Mucosal-Transplantationsverfahren für Direkt Drug Delivery zum Gehirn bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine heterotrophe Schleimhauttransplantation erfolgreich durchzuführen, um Verbindungen in das Gehirn zu bringen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Nasenscheidewandtransplantat von einer Spendermaus isoliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Schleimhaut aus dem Septum auf einen Schädeldefekt einer Empfängermaus zu transplantieren.

Als nächstes wird das Gehirn für einen gewünschten Zeitraum durch das Transplantat dosiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Folgen des Dosierungsverfahrens im Gehirn zu analysieren, indem Fluoreszenz, Mikroskopie oder Immunhistochemie verwendet werden, um die Diffusion der abgegebenen Verbindungen in das Gehirn zu zeigen. Parenchym. Die Verwendung von Neurop-Arzneimitteln ist aufgrund des Vorhandenseins der Blut-Hirn-Schranke stark eingeschränkt.

Wir haben eine Technik entwickelt, die auf der endoskopischen transnasalen Chirurgie des Menschen basiert, bei der wir die Schleimhaut in ein Loch in der Blut-Hirn-Schranke einordnen und dies als Kanal für die direkte Verabreichung von Medikamenten an das Gehirn verwenden können. Hier wird Richie Komen, Postdoktorand in Han's Lab an der Boston University, diese Technik in einem Mausmodell demonstrieren. Beginnen Sie diesen Eingriff, indem Sie die Haut um die Nasenregion einer eingeschläferten Maus entfernen, um den Schädel freizulegen.

Markieren Sie dann drei Linien mit dem Druckluftbohrer. Zwei der Linien flankieren seitlich die Nasenregion, und die dritte befindet sich in einer Linie mit den Augen, die die beiden Linien senkrecht verbindet. Führen Sie als Nächstes einen Drilldown ventral durch.

Um die Nasenscheidewand vom umgebenden Gewebe zu trennen, schneiden Sie die Nasenscheidewand von jeglichem anhaftenden Gewebe frei. Bewahren Sie es dann in einer sterilen Kochsalzlösung unter dem Mikroskop auf, reinigen Sie das Transplantat und entfernen Sie verbundenes Gewebe. Im Idealfall gelingt es, das gesamte Bindegewebe zu entfernen, ohne die auf beiden Seiten des Knorpelseptums vorhandenen Schleimhäute zu schädigen.

Nach der Betäubung einer Maus mit standardmäßigen aseptischen Spiegelungsoperationen, die in einem theologischen Rahmen montiert sind, tragen Sie Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Legen Sie als Nächstes den Schädel frei und richten Sie den Kopf aus. Schneiden Sie dann mit einem Druckluftbohrer ein kreisrundes Loch mit einem Durchmesser von 1,25 Millimetern in den Schädel.

Wenn du auf den Atu zielst, befeuchte die gebohrte Stelle mit steriler Kochsalzlösung und verwende eine Rasierklinge, um den Schädel zu entfernen. Entfernen Sie danach die Dura manuell mit der Spitze einer 30-Gauge-Nadel. Platzieren Sie anschließend die Schleimhaut über der Gehirnoberfläche und achten Sie dabei äußerst darauf, dass die Epithelseite von der Wunde weg zeigt.

Halten Sie die Membran mit der Spitze einer chirurgischen Schere vom Knorpel auf die Schädel- und Gehirnoberfläche, um alle knöchernen Ränder der Kraniotomiestelle großzügig zu überlappen. Decken Sie als Nächstes das Transplantat mit einem sterilen Stück Nitril ab. Dies verhindert, dass die Haut während der Heilung an das Transplantat anhaftet.

Schneiden Sie bei Bedarf die überschüssige Membran ab und vermeiden Sie jede Bewegung des Nitrils, sobald es mit dem Transplantat in Kontakt gekommen ist. Schließen Sie dann die Haut mit einer Naht und lassen Sie die Maus drei bis sieben Tage lang erholen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Stellen Sie sicher, dass geeignete postoperative Behandlungen durchgeführt und regelmäßige Analgetika verabreicht werden, um das Tier zu dosieren.

Nachdem Sie die anästhesierte Maus im stereotaktischen Rahmen gesichert haben, schneiden Sie die Naht mit einer Schere ab und entfernen Sie überschüssige Haut um den Schädel. Entfernen Sie die Nitrilbarriere und reinigen Sie die Oberfläche des Schädels. Verwenden Sie sterile Kochsalzlösung und Wattestäbchen, um den Bereich zu reinigen, bis das Transplantat sichtbar ist.

Es kann notwendig sein, das Transplantat mit dem Rasiermesser zu schneiden, wenn es größer als die gewünschte Oberfläche geworden ist. Platzieren Sie dann die Vertiefung über dem Transplantat, so dass die Ränder mit dem Schädel in Kontakt kommen. Tragen Sie dann Cyanacrylatkleber an der Verbindungsstelle zwischen der Vertiefung und dem Schädel auf.

Füllen Sie die Vertiefung mit steriler Kochsalzlösung und prüfen Sie, ob keine Lecks vorhanden sind. Tragen Sie anschließend Zement auf den Schädel auf, um die Vertiefung an Ort und Stelle zu sichern. Entfernen Sie anschließend die Kochsalzlösung mit einer Pipette aus der Vertiefung.

Waschen Sie die Vertiefung mehrmals, um sicherzustellen, dass kein Klebstoff eingedrungen ist. Fügen Sie dann 50 Mikroliter fluoreszierendes Dextran hinzu. Verschließen Sie die Oberseite der Vertiefung, indem Sie ein kreisförmiges Stück Nitril verwenden, das oben mit Cyanacrylatkleber befestigt ist, und stellen Sie sicher, dass der Klebstoff nicht mit dem Inhalt der Vertiefung in Berührung kommt.

Nachdem die gewünschte Zeit abgelaufen ist, euthanasieren Sie das Tier und entfernen Sie das Implantat und das Gehirn. Achte darauf, dass das Transplantat an Ort und Stelle bleibt. Nach der Entnahme das Gehirn mit einem Blitz einfrieren In einer in einem Trockeneisbad abgekühlten Isobutanlösung das Gehirn in eine OCT-Lösung einbetten und in 50 Mikrometer schneiden.

Legen Sie die gewünschten Scheiben direkt auf einen Objektträger. Anschließend wird die Scheibe mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet, sobald die OCT-Lösung getrocknet ist. Dies ist ein fluoreszierendes Mikroskopbild eines Maushirnschnitts nach transmuköser Dosierung.

Mit 40 Kilodalton Tetraethylrumin konjugiertem Dextran für 24 Stunden ist das Schleimhauttransplantat auf der Oberfläche des Gehirns sichtbar. Sobald diese Technik gemeistert ist, sollte sie insgesamt vier Stunden Operationszeit in Anspruch nehmen, um richtig zu funktionieren. Nach dem Ansehen dieses Videos sollte man in der Lage sein, eine Nasenscheidewand zu isolieren und die Schleimhaut über eine Kraniotomiestelle zu übertragen, um das Medikament an das Gehirn zu verabreichen.