Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

Dies ist die Anleitung zur Probenvorbereitung für den Plasma-Assay. Bitte beachten Sie, dass alle Proben und Standards zur Sicherstellung ihrer Integrität während der Sammlung und Verarbeitung bei zwei bis acht Grad Celsius aufbewahrt werden sollten. Nach Abschluss der Handhabung sollten alle Proben bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Für die Standardpräparation bereiten Sie zwei unabhängige Stammlösungen jedes Anilids, Ivacaftor, M1-Metaboliten, M6-Metaboliten und Lumacaftor in Methanol bei 100 Mikrogramm pro Milliliter und 10 Mikrogramm pro Milliliter vor. Beachten Sie, dass die Verbindungen nach 10 Tagen bei Raumtemperatur ablaufen. Für die Standards geben Sie 100 Mikroliter humanes Plasma in 1,5-Milliliter-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen.

Verfahren Sie auf die gleiche Weise mit all Ihren anderen Proben. Geben Sie danach den internen Standard in jedes Reagenzglas. Beispielsweise wählen wir 0,01 Mikrogramm pro Milliliter aus dem hergestellten Standard.

Jetzt enthält dieses Röhrchen Plasma, das mit dem internen Standard versetzt wurde. Gehen Sie auf dieselbe Weise mit allen anderen Standards vor. Nehmen Sie Ihre Standards und zentrifugieren Sie sie kurz, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens befindet.

Wiederholen Sie dies für alle 40 Standards. Für die Patientenproben überführen Sie 100 Mikroliter aus dem Patientenprobenröhrchen in das Mikrozentrifugenröhrchen. Die eigentliche Patientenprobe ist nicht mit internem Standard versetzt.

Zentrifugieren Sie die Patientenprobe einige Sekunden lang, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit am Boden des Gefäßes befindet. Die nächsten Schritte gelten sowohl für die Proben als auch für die Standards. Geben Sie 200 µL 0,1 %iger Ameisensäure in Acetonitril in jedes Probenröhrchen, um Plasma-Proteine auszufällen.

Fahren Sie damit mit allen Standards und Patientenproben fort. Vortexen Sie jede Probe etwa 15 Sekunden lang kräftig. Fahren Sie damit mit allen Standards und inkurrierten Proben fort.

Belassen Sie die Probe 10 Minuten im Kühlschrank, um die Fällung zu unterstützen. Zu Demonstrationszwecken werde ich nur eine Probe und einen Standard zentrifugieren. Die Zentrifugation erfolgt bei 10.000 U/min für 10 Minuten in einem Eppendorf-Zentrifugenmodell 5430 bei vier Grad.

Wir werden nun das Überstand in die Phenomenex-Vials filtrieren. Dazu verwenden wir einen 13-Millimeter-Spritzenfilter mit 0,45-Mikrometer-Nylon-Grace-Filtern, die aus den USA bezogen wurden, und filtrieren in die HPLC-Vials, die 1,5 Milliliter fassen können. Nach der Filtration übertragen wir 100 Mikroliter des Überstands in die LC/MS-Vials zur LC/MS-Analyse.

Diese Probe ist nun bereit zur Analyse. Stellen Sie nun einfach alle Ihre Proben in das Vial-Regal. Wir verwenden ein Shimadzu 8030 LC/MS-System, gekoppelt mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer.

Lassen Sie das System vor der Analyse equilibrieren. Sobald das System equilibriert ist, was etwa 15 Minuten dauert, drücken Sie einfach die Schaltfläche „Start“. Erstellen Sie für jeden Metaboliten eine Kalibrierkurve, indem Sie die Peakflächenverhältnisse der Anilide gegen die nominelle Konzentration der Kalibrierstandards auftragen.

Verwenden Sie die Regressionsgleichung der Kalibrierkurve, um die Konzentrationen von Aniliden in der untersuchten Probe zu berechnen. Ein typisches Chromatogramm ist in dieser Abbildung dargestellt. Eine optimierte chromatographische Trennung wurde mit einer mobilen Phase aus 100 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure in Wasser unter Gradienten-Elution an einer Phenomenex Kinetex C8-Säule erzielt.

Die LC-Retentionszeiten waren wie folgt: Für M6 eine Minute, für M1 1,3 Minuten.

Für Ivacaftor 1,55 Minuten, für Lumacaftor 2,3 Minuten. Bei allen Leerplasmaproben wurde keine Interferenz mit der Retentionszeit der beiden Anilide beobachtet, ebenso wenig wie eine Interferenz durch die Kombination von Ivacaftor mit Lumacaftor nachgewiesen wurde.

Durch die Hochdurchsatzanalyse einer großen Menge an Patientenproben haben wir unsere berichtete Methode optimiert, indem wir eine umgekehrte Phasenchromatographiesäule mit kleinerer Porengröße, die Phenomenex C8-Säule, und ein Gradienten-Lösungsmittelsystem anstelle der derzeitigen isokratischen Elution verwenden. Dadurch reduziert sich die Laufzeit auf sechs Minuten pro Probe, einschließlich der Waschphase. Diese zuverlässige und neuartige Methode bietet einen einfachen, empfindlichen und schnellen Ansatz für das therapeutische Drug-Monitoring von Ivacaftor und der Kombination aus Ivacaftor und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten.

Angesichts der Notwendigkeit, Expositions-Wirkungs-Beziehungen zu entwickeln, um die Wirksamkeit von Arzneimitteln zu maximieren und gleichzeitig die Kosten im Gesundheitswesen zu begrenzen, müssen empfindlichere Methoden entwickelt und validiert werden, die Kliniker bei der Anwendung evidenzbasierter Therapien und hochdurchsatzfähiger analytischer Verfahren für Patienten mit Mukoviszidose unterstützen. Durch die Anwendung des vorgeschlagenen analytischen Verfahrens auf klinische pharmakokinetische und pharmakodynamische Studien ergibt sich die Möglichkeit, die pharmakokinetischen Parameter von Ivacaftor oder der Kombination aus Ivacaftor und Lumacaftor an einem größeren Patientenkollektiv weiter zu untersuchen.