Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

Dies ist das Protokoll für die Probenvorbereitung für den Plasma-Assay. Bitte beachten Sie, dass alle Proben und Standards während der Entnahme und Verarbeitung bei zwei bis acht Grad Celsius aufbewahrt werden sollten, um ihre Unversehrtheit zu gewährleisten. Sobald die Handhabung abgeschlossen ist, lagern Sie alle Proben bei minus 20 Grad.

Für die Standardzubereitung werden von jedem Anilid, Ivacaftor, M1-Metabolit, M6-Metabolit und Lumacaftor zwei unabhängige Stammlösungen in Methanol in einer Menge von 100 Mikrogramm pro Milliliter und 10 Mikrogramm pro Milliliter hergestellt. Bitte beachten Sie, dass die Verbindungen nach 10 Tagen auf dem Labortisch ablaufen. Für die Standards werden 100 Mikroliter menschliches Plasma in die 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen überführt.

Setzen Sie dies für alle anderen Proben fort. Fügen Sie dann jedem Rohr den internen Standard hinzu. Zum Beispiel wählen wir 0,01 Mikrogramm pro Milliliter aus dem vorbereiteten Standard.

Diese Röhre enthält nun Plasma, das mit dem internen Standard versetzt ist. Gehen Sie auch bei allen anderen Normen so vor. Nehmen Sie Ihre Standards und drehen Sie sie einige Sekunden lang nach unten, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens befindet.

Tun Sie dies weiterhin für alle Ihre 40 Normen. Für die Patientenproben werden 100 Mikroliter aus dem Patientenprobenröhrchen in das Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die reale Patientenprobe wird nicht mit internem Standard aufgespießt.

Drehen Sie die Patientenprobe einige Sekunden lang nach unten, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens befindet. Die nächsten Schritte sind sowohl für die Muster als auch für die Standards ausgelegt. Geben Sie 200 Mikroliter 0,1 %ige Ameisensäure in Acetonitril in jedes Probenröhrchen, um Plasmaproteine auszufällen.

Tun Sie dies weiterhin für alle Standards und Patientenproben. Jede Probe etwa 15 Sekunden lang kräftig vortexen. Setzen Sie dies für alle Standards und angefallenen Proben fort.

10 Minuten im Kühlschrank ziehen lassen, um die Ausfällung zu erleichtern. Zu Demonstrationszwecken werde ich nur eine Probe und einen Standard zentrifugieren. Wir zentrifugieren bei 10.000 U/min für 10 Minuten auf einer Eppendorf Zentrifuge 5430 bei vier Grad.

Wir werden nun den Überstand in die Phenomenex-Fläschchen filtrieren. Dafür verwenden wir einen 13-Millimeter-Spritzenvorsatzfilter mit 0,45-Mikrometer-Nylon-Grace-Filtern, die wir in den USA gekauft haben, und wir filtern in die HPLC-Fläschchen, die 1,5 Milliliter fassen können. Nach der Filtration werden 100 Mikroliter Überstand für die LC/MS-Analyse in die LC/MS-Fläschchen überführt.

Diese Probe ist nun bereit für die Analyse. Legen Sie nun einfach alle Ihre Proben in das Fläschchengestell. Wir verwenden ein Shimadzu 8030 LC/MS-System, gekoppelt mit einer Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie.

Lassen Sie das System vor der Analyse äquilibrieren. Nach dem Gleichgewicht, was etwa 15 Minuten dauert, drücken Sie einfach die Start-Taste. Erstellen Sie für jeden Metaboliten eine Kalibrierungskurve, indem Sie die Peakflächenverhältnisse von Aniliden gegenüber der nominalen Konzentration von Kalibrierstandards darstellen.

Verwenden Sie die Regressionsgleichung für die Kalibrierkurve, um die Konzentrationen von Aniliden in der anfallenden Probe zu berechnen. In dieser Abbildung ist ein typisches Chromatogramm dargestellt. Eine optimierte chromatographische Auflösung wurde unter Verwendung einer mobilen Phase von 100 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure in Wasser mit einer Gradientenelution auf einer Phenomenex Kinetex C8-Säule erzielt.

Die LC-Retentionszeiten waren wie folgt. Für M6 eine Minute. Für M1 1,3 Minuten.

Für Ivacaftor 1,55 Minuten. Für Lumacaftor, 2,3 Minuten. In allen blinden Plasmaproben wurde weder eine Interferenz mit der Retentionszeit eines der Anilide noch eine Interferenz durch die Kombination von Ivacaftor mit Lumacaftor festgestellt.

Durch die Hochdurchsatzanalyse einer großen Anzahl von Patientenproben haben wir unsere beschriebene Methode durch die Verwendung einer Phenomenex C8-Säule mit Umkehrphasenchromatographie mit kleinerer Porengröße und eines Gradientenlösungsmittelsystems anstelle der derzeitigen isokratischen Elution optimiert. Dadurch reduziert sich die Laufzeit auf sechs Minuten pro Probe, einschließlich der Waschphase. Diese zuverlässige und neuartige Methode bietet einen einfachen, sensitiven und schnellen Ansatz für das therapeutische Drug Monitoring von Ivacaftor und Ivacaftor-Lumacaftor-Kombination und biologischen Flüssigkeiten.

Angesichts der Notwendigkeit, Expositions-Wirkungs-Beziehungen zu entwickeln, um die Wirksamkeit des Arzneimittels zu maximieren und die Gesundheitskosten einzudämmen, müssen empfindlichere Instrumente entwickelt und validiert werden, um Kliniker bei der Anwendung evidenzbasierter Therapien und Hochdurchsatz-Analysetechniken für Patienten zu unterstützen, die an CF.By Anwendung der vorgeschlagenen Analysemethode auf klinische pharmakokinetische und pharmakodynamische Studien die Möglichkeit bieten, die pharmakokinetischen Parameter von Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor-Kombination an einem größeren Patientenkollektiv.