Name: Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Erfahren Sie eine optimierte HPLC-MS-Methode zur Analyse von Ivacaftor, seinen Metaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten. Diese Technik ermöglicht präzise pharmakokinetische Studien.

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J.l. und t.v. werden durch das National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) von den National Institutes of Health (R01 AI111965) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten oder die National Institutes of Health. MC ist eine australische NHMRC Principal Research Fellow. J. L. ist eine australische National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Research Fellow und t.v. ist eine australische NHMRC Industrie Career Development Level 2 Research Fellow. E.K.S ist eine ausgestattete junge Botschafter 2017 für ASM (American Society for Microbiology) und wird von den australischen Postgraduate Award unterstützt. Teile dieser Arbeit wurde auf 12th Australiasian Konferenz über Mukoviszidose In Melbourne (5-8th August 2017) präsentiert.

Genehmigung für Ethik wurde von Monash Universität menschliche Forschung Ethics Committee (MUHREC).
 1. Anwendung des Tests: Patient Musterkollektion <ol><li>nehmen Sie die Zeit, wann der Patient ihre standard-Dosis von 150 mg Ivacaftor oder Ivacaftor 125 mg /lumacaftor nimmt, 200 mg.</li>
	<li>Hinweis unten die genaue Uhrzeit, wann der Patient Blutprobe erfasst. 
	Hinweis: Wir empfehlen 4-5 Probenahmen über einen 24 h-Zeit-Verlauf. Wenn die Auflistung nur eine Probe möglich ist, ist der angegebene Zeitpunkt 2,5-4 h Post Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor Kombination Dosierung wie C max Konzentrationen im Steady-State nach erreichbar sein werden &#62; 5 Tage in Folge Behandlung.</li>
	<li>4 bis 5 mL Blut in handelsüblichen unbehandelten blauen Röhren sammeln.</li>
	<li>Nach der Entnahme des Vollblutes, das Blut gerinnen lassen es bei Zimmertemperatur ungestört lassen. 
	Hinweis: Dies dauert in der Regel 15-30 min.</li>
	<li>Entfernen das Gerinnsel durch Zentrifugieren bei 1.000-2.000 x g für 10 min bei 4 ° C in einer gekühlten Zentrifuge. Den daraus resultierende Überstand als Plasma zu bezeichnen.</li>
	<li>Nach Zentrifugation, den überstand (Plasma) in ein sauberes Polypropylen Röhrchen mit einer Pasteurpipette sofort übertragen. Label das Plasma Schlauch mit der Patienten-ID (z. B. Patient 1), die verabreichten Arzneimittels (z.B. Ivacaftor-Lumacaftor-Kombination) und Zeit der Patientenprobe war gesammelt (z. B. Post-Dosierung 2,5 h).</li>
	<li>Pflegen Proben bei 2 bis 8 ° C bei der Handhabung. Nach Abschluss der Bearbeitung speichern Proben bei &#8211; 20 ° c</li>
	<li>Bei Bedarf versenden Proben mit einer genehmigten Kurier an die Analyse Institut. 
	Hinweis: Proben auf Trockeneis bis Ankunft geliefert werden sollen und aufbewahrt werden, am &#8211; 80° C bis zur Analyse.</li>
</ol> 2. Vorbereitung und Bearbeitung der anfallenden Proben und Standards Hinweis: Plasma von gesunden Spendern naiv auf Ivacaftor/Lumacaftor-Therapie wurde von dem australischen Roten Kreuz erhalten. Um die Integrität zu gewährleisten, sollten alle Proben/Standards während der Erhebung und Verarbeitung bei 2 bis 8 ° C gehalten werden. Nach Abschluss der Bearbeitung speichern Proben bei &#8211; 20 ° c
<ol><li>, IVA, IVA-Carboxylat, Hydroxymethyl-IVA und LUMA dienen als Referenz für die internen Standards wiegen.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei unabhängige Stammlösungen der einzelnen Analyten (IVA, M1, M6 und LUMA) in LC-MS Grade Methanol 100 µg/ml und 10 µg/ml. 
	Hinweis: Verbindungen endet nach 10 Tagen auf die Benchtop.</li>
	<li>Frisch zubereiten LC-MS Kalibrierstandards vor jedem analytischen Lauf durch Verdünnung der Kalibrierstandards Stammlösungen in menschlichem Plasma nach Konzentrationen zu erreichen: 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 und 10,0 µg/mL. Diese Proben werden als Standard bezeichnet.</li>
	<li>Proteine ausgefällt, 0,1 % Ameisensäure (FA) in Acetonitril (ACN, LC-MS-Grade) Vorbereitung und lassen im Kühlschrank bis benötigt.</li>
</ol> 3. Vorbehandlung der entstandenen Muster und Normen <ol><li>erlauben beide Patienten und leere Plasma-Proben auf Raumtemperatur equilibrate.</li>
	<li>Vortex mischen jede Plasma-Probe für 15 s pro Probe.</li>
	<li>Einer 100 µL Aliquot entweder leer Plasma für Standards oder Proben für die Analyse in einem 1,5 mL Polypropylen Microcentrifuge Schlauch übertragen.</li>
	<li>Fügen Sie den internen standard IVA in jedes standard Rohre (z.B. 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 und 10,0 µg/mL potenzielle Konzentrationsbereich abdecken), schließen Sie den Deckel und Vortex für 2-3 S. Hinweis, dass interne Standard ist nur Hinzu kommt die leere Plasma und keine internen Standards wird hinzugefügt, um die Patientenproben.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.4. für die anderen internen Standards M1, M6 und LUMA.</li>
	<li>Spin-down jedes Rohr kurz um sicherzustellen, dass auf dem Deckel gibt es keine Tröpfchen.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL einer Mischung aus 0,1 % FA ACN in jedes Rohr, Plasmaproteine auszufällen.</li>
	<li>Vortex die Mischung kräftig für ca. 15 s.</li>
	<li>Röhrchen 10 min. im Kühlschrank ruhen lassen.</li>
	<li>Wenn möglich bei 10.000 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert.</li>
	<li>Filtern eine aliquote 200 µL des Überstands durch ein 13 mm-Spritze-Filter in einem 1,5 mL HPLC Vials.</li>
	<li>Transfer 100 µL des Überstands in der LC-MS-Fläschchen für die HPLC-MS-Analyse.</li>
</ol> 4. HPLC-MS-Analyse Hinweis: der HPLC-MS-Analyse erfolgte auf einem LC-MS-System gekoppelt mit dem triple Quadrupol-Massenspektrometer (Tabelle 1).
<ol><li>Biegen Sie auf dem LC-MS-System, das Tablett mit den Proben in der Auto-Sampler.</li>
	<li>Legen Sie die Spalte auf eine Vorsäule und verbinden mit der LC-MS-System.</li>
	<li>Fügen Sie beide Flaschen der mobilen Phasen (Flasche A: 100 % ACN; Flasche B: 0,1 % Ameisensäure im Wasser) und das LC-MS-System equilibrate.</li>
	<li>Die folgenden Parameter in der LC-MS-Protokoll integrieren.
	<ol><li>Teilen den Fluss der mobilen Phase vor dem Eintritt in das Massenspektrometer im Verhältnis 2:1 (verschwenden: MS Einlass).</li>
		<li>Führen Sie einen Gradienten Elution mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min mit einer mobilen Phase, bestehend aus 100 % ACN und 0,1 % Ameisensäure im Wasser (Ausgangspunkt bei 40: 60, V/V). Beachten Sie, dass die Volumenprozent der mobilen Phase während Analyse.</li>
		<li>Das Massenspektrometer in einem positiven Elektrospray-Ionisation-Modus zu betreiben.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die LC-MS-Einstellungen wie folgt sind: Ionen-Spray Spannung 4,5 kV, Aufprallenergie 295.9 V, Vernebelung Gas: Stickstoff bei 3 L/min; Kollision Gas: Argon; Trocknungsgas flow 20 L/min, Spannung Q3-Objektiv:-22 V, zugeführten Temperatur 250 ° C mit einem Heizblock Temperatur von 400 ° c</li>
		<li>Injizieren 10 µL Volumen pro Probe.</li>
		<li>Detect Analyten mit mehreren Reaktion monitoring (MRM). Überwachen Sie die Ionen-Übergänge von m/Z 392.49 &#8594; 393, m/Z 408.49 &#8594; 409, m/Z 422.47 &#8594; 423 und m/Z 452.40 &#8594; 453 für IVA, IVA-M1, IVA-M6 und LUMA, bzw.. 
		Hinweis: Die neu optimierte Methode noch nicht vollständig gemäß FDA-Standards validiert werden.</li>
	</ol></li></ol> 5. Kalibrierkurven <ol><li>Konstrukt der LC-MS Kalibrierkurven vor jedem analytischen Lauf unter Zugrundelegung der Beziehung zwischen die Flächenverhältnisse der Höhepunkt eines jeden der vier Analyten zu internen Standard und die Kalibrierung standard geringe Konzentrationen von Ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 oder LUMA) Einstellungen programmintern LC-MS. 
	Hinweis: Die genauen Schritte für den Bau der Eichkurve richtet sich nach dem Vorbild der LC-MS-Ausrüstungen. Diese Informationen möglicherweise in das Gerätehandbuch verfügbar.</li>
	<li>Kleinste-Quadrate-lineare Regressionsanalyse durch Gewichtung 1/C 2 nach der Kehrwert der Konzentrationen führen.</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li>
<li>Solomon, M., Leatte, P. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolomon%2C+M+%22Treatments+for+Cystic+fibrosis%22">Treatments for Cystic fibrosis</a>. , (2009).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+N-%282%2C4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl%29-4-oxo-1%2C4-dihydroquinoline-3-carboxamide+%28VX-770%2C+ivacaftor%29%2C+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li>
<li>FDA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22FDA+Advisory+Commitee+Briefing+Material+VERTEX-FDA+Pulmonary-Allergy+drugs+advisory+commitee%22">FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee</a>. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).</li>
<li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+dawn+for+cystic+fibrosis+disease+modifiers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+gating+potentiators%2C+including+VX-770%2C+diminish+DeltaF508-CFTR+functional+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/003954/human_med_001935.jsp&mid=WC0b01ac058001d124">Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency</a>. , (2015).</li>
<li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vertex+prescribing+infomation%22">Vertex prescribing infomation</a>. , (2015).</li>
<li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li>
<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HPLC+and+LC-MS%2FMS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor%2C+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chrom+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li>
<li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LC-MS%2FMS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma%3A+application+to+a+pharmacokinetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wie bereits berichtet hat unsere Gruppe für das erste Mal entwickelt und validiert eine HPLC und LC-MS Methode zur schnellen Erkennung und Quantifizierung von Ivacaftor und seiner wichtigsten Metaboliten Hydroxymethyl-IVA M1 (aktiv) und IVA-Carboxylat M6 (inaktiv); und Lumacaftor im Plasma und Auswurf von CF Patienten14. Der Test unserer Gruppe zuvor berichtet wurde erfolgreich eingesetzt, um die Konzentration von LUMA, IVA, IVA-M1 und IVA-M6 im Plasma und Auswurf von CF-Patienten, die eine statio...

Cystische Fibrose (CF) ist eine gemeinsame genetische Krankheit unter Einbeziehung der exokrinen Schleim Drüsen von Lunge, Leber, Bauchspeicheldrüse und Darm verursacht progressive Multi-Organversagen, wie einen Rückgang der Lungenfunktion und Pankreasinsuffizienz1, 2,3. Ivacaftor (IVA) ist der erste Food and Drug Administration (FDA, USA) und European Medicines Agency (EMA) genehmigt Mukoviszidose Trans-Membran Leitwert Regulator (CFTR) Potentiator Droge, mit nachgewiesenen klinischen Wirksamkeit produziert eine erhebliche Verbesserung der Lungenfunktion gegenüber Placebo in eine kleine Teilmenge der CF-Patienten mit G551D-CFTR [Glycin (G) in Stellung 551 wird ersetzt durch Asparaginsäure (D)] Missense-Mutation (~ 4-5 % der Bevölkerung CF)4,5. Oral verabreicht das Medikament erhöht die CFTR-Kanal öffnen, wodurch die Chlorid-Ionen-Fluss und Beeinflussung der primären Defekts, der die die klinischen Manifestationen von CF4,6führt. IVA-Monotherapie ist leider nicht wirksam bei Patienten mit häufiger homozygoten F508del-Mutation [in Frame Löschen des CFTR-Gens führt zu Verlust von Phenylalanin (F) an Position 508] wodurch fehlgefaltete CFTR, die in ~ 50 % der zu sehen ist die CF Bevölkerung7,8.
Vor kurzem hat die FDA Zulassung für die Kombination von IVA mit der CFTR-Korrektor Medikament Lumacaftor gewährt. Die clevere Strategie verbinden CFTR-Korrektor (Lumacaftor, LUMA), der F508del-CFTR an der Zelloberfläche mit einem Modulator (IVA) birgt die CFTR-Kanal Aktivität, potenziert, erweitert effektiv das Behandlungsfenster zu einem Großteil der CF Bevölkerung5 . Es bleiben Fragen über ob diese Medikamente ihre Versprechen zu erfüllen wie eine Reihe von widersprüchlichen berichten, dass Zweifel auf ihre klinische Wirksamkeit9,10entstanden sind. Außerdem wurden Verbesserungen der Lungenfunktion nur bescheiden (2,6-4 % für Ivacaftor-Lumacaftor Kombination) im Vergleich zu dem Erfolg mit IVA-Monotherapie bei Patienten mit einem G551D Mutation (10,6-12,5 %)8. Potenzielle antagonistische Wechselwirkungen zwischen IVA und LUMA, die potenziell die klinische Wirksamkeit der Ivacaftor-Lumacaftor Kombination einschränken stammen aus seiner weniger als ideal pharmakokinetischen Eigenschaften7,11. IVA ist umfassend durch Cytochrom P450 Enzyme (CYP), in erster Linie auf einen aktiven Metaboliten Hydroxymethyl-IVA (IVA-M1, M1) und eine inaktive Form IVA-Carboxylat (IVA-M6, M6)7,12metabolisiert. CYP3A4-Induktor LUMA, auf der anderen Seite ist nicht extensiv metabolisiert und ist weitgehend unverändert in den Kot11ausgeschieden. Wie CYP3A4 Induktoren Cytochrom Stoffwechsel induzieren, konnte Ivacaftor (CYP3A4-Substrat) Konzentrationen reduziert werden. Darüber hinaus IVA und LUMA sind sehr hydrophobe Moleküle und sind ~ 99 % gebunden an Plasmaproteine, welche Grenzen deutlich frei (Wirkstoff) Konzentration1,13.
Gemeinsam können diese Faktoren zusammen kommen, die klinische Wirksamkeit der Ivacaftor-Lumacaftor Kombination zu begrenzen. Es ist nicht bekannt, ob optimale Plasmakonzentrationen unter dem aktuellen Dosierungsplan für Ivacaftor-Lumacaftor Kombination erreicht werden oder wenn die therapeutische Schwelle8beibehalten wird. Derzeit gibt es einen Mangel an Informationen hinsichtlich der pharmakokinetischen Parameter wie die Peak und Steady-State Plasmakonzentrationen von Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor. Angesichts den notierten Metabolismus von Ivacaftor und Lumacaftor, ist Überwachung der Exposition-Wirkungs-Beziehungen Voraussetzung für optimale Dosierung Therapien für Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor Therapie zu erreichen. Unsere Gruppe hat kürzlich die erste HPLC/LC-MS-Methode zur Überwachung der Exposition-Wirkungs-Beziehungen von IVA und LUMA14veröffentlicht. Bisher wurden keine alternativen Verfahren zur Messung der Konzentrationen von Ivacaftor, seiner Metaboliten und Lumacaftor beschrieben. Hochdurchsatz-Analyse eines größeren Patienten Kollektivs ermöglichen und Analysezeit drastisch verringern, unsere Gruppe wurde optimiert, die gemeldeten Methode durch den Einsatz einer kleineren Poren Größe Reverse-Phase-Chromatographie Spalte und ein gradient Lösungsmittelsystem, reduziert Kosten und Laufzeiten.

<table><tbody><tr><td>IVA (Kat#S114)&nbsp;</td><td>SelleckChem (USA).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUMA (Kat#S1565)&nbsp;</td><td>SelleckChem (USA).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVA-Carboxylat (Kat# 510242247CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Kanada).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxymethyl-IVA (Kat# 510240849CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Kanada).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol (MeOH, LC-MS-Qualität),&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril (ACN, LC-MS-Qualität) &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich-Ameisensäure</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(FA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triple-Quadrupol Shimadzu 8030 LC-MS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex (2,6 & Mikro; m C8 100 &Aring;; 50 & mal; 2.1mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Tiefenfilter x 0.004inID).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen (VWR).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5430</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13-mm-Spritzenvorsatzfilter (0,45 &Mikro; m Nylon, GRACE, USA)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 & Mikro; L, PTFE/Silikon-Septen].&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimierte lc-ms/ms-methode für die hochdurchsatz-analyse der klinischen proben von ivacaftor, seinen hauptmetaboliten und lumacaftor in biologischen flüssigkeiten von mukoviszidose-patienten

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Mängel in der Mukoviszidose-Trans-Membran Leitwert Regulator (CFTR) sind die Ursache für Cystische Fibrose (CF), eine Krankheit mit lebensbedrohlichen pulmonale Manifestationen. Ivacaftor (IVA) und Ivacaftor-Lumacaftor (LUMA) Kombination sind zwei neue Durchbruch CF-Medikamente, die direkt die Aktivität und des Handels des defekten CFTR-Proteins modulieren. Allerdings gibt es noch einen Mangel an Verständnis auf Pharmakokinetische/pharmakodynamische Parameter und der Pharmakologie des Ivacaftor und Lumacaftor. Die HPLC-MS-Technik für die gleichzeitige Analyse der Konzentrationen von Ivacaftor, Hydroxymethyl-Ivacaftor, Ivacaftor-Carboxylat und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten bei Patienten, die Standardkombination Ivacaftor oder Ivacaftor-lumacaftor Therapie wurde bisher von unserer Gruppe entwickelt und teilweise validiert, um FDA-Standards. Jedoch um die Hochdurchsatz-Analyse einer größeren Anzahl von Proben zu ermöglichen, unsere Gruppe wurde optimiert, die gemeldeten Methode durch den Einsatz einer kleineren Poren Größe Reverse-Phase-Chromatographie Spalte (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2,1 mm) und ein gradient Lösungsmittelsystem ( 0-1 min.: 40 % B; 1-2 min: 40-70 % B; 2-2,7 min: hielt bei 70 % B; 2,7-2,8 min: 70-90 % B; 2,8-4,0 min: 90 % B waschen; 4.0-4,1 min: 90-40 % B; 4,1-6,0 min: hielt bei 40 % B) anstelle einer isokratischen Elution. Ziel dieser Studie war es, HPLC-MS Analyse pro Probe dramatisch von ~ 15 min, nur 6 Minuten pro Probe, verkürzen die für die Analyse einer großen Menge von Patientenproben unerlässlich ist. Diese sinnvolle Methode werden erhebliche Dienstprogramm für Studien in der Exposition-Wirkungs-Beziehungen dieser Durchbruch CF Medikamente.

Eine Methode, teilweise validiert, um FDA-Standards auf einem Triple-Quadrupol-LC-MS und einer HPLC-Detektor-System haben wir vor kurzem berichtet über eine Spalte C8 (5 µm, 3,9 x 50 mm i.d.) mit der mobilen Phase, bestehend aus 100 % ACN und 0,1 % Ameisensäure in Wasser (40: 60 V/V) bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min. Eine lineare Korrelation der Gipfel wurde über einen Konzentrationsbereich von 0,01 bis 10 µg/mL im menschlichen Plasma für alle Metaboliten, Ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6 und Lumacaftor1...

Kombination aus Ivacaftor und Ivacaftor-Lumacaftor sind zwei neue CF-Medikamente. Allerdings gibt es noch ein Mangel an Verständnis über ihre PK/PD und Pharmakologie. Wir präsentieren Ihnen eine optimierte HPLC-MS-Technik für die simultane Analyse von Ivacaftor und seine Hauptmetaboliten und Lumacaftor.

Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Dies ist die Anleitung zur Probenvorbereitung für den Plasma-Assay. Bitte beachten Sie, dass alle Proben und Standards zur Sicherstellung ihrer Integrität während der Sammlung und Verarbeitung bei zwei bis acht Grad Celsius aufbewahrt werden sollten. Nach Abschluss der Handhabung sollten alle Proben bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.Für die Standardpräparation bereiten Sie zwei unabhängige Stammlösungen jedes Anilids, Ivacaftor, M1-Metaboliten, M6-Metaboliten und Lumacaftor in Methanol bei 100 Mikrogramm pro Milliliter und 10 Mikrogramm pro Milliliter vor. Beachten Sie, dass die Verbindungen nach 10 Tagen bei Raumtemperatur ablaufen. Für die Standards geben Sie 100 Mikroliter humanes Plasma in 1,5-Milliliter-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen.Verfahren Sie auf die gleiche Weise mit all Ihren anderen Proben. Geben Sie danach den internen Standard in jedes Reagenzglas. Beispielsweise wählen wir 0,01 Mikrogramm pro Milliliter aus dem hergestellten Standard.Jetzt enthält dieses Röhrchen Plasma, das mit dem internen Standard versetzt wurde. Gehen Sie auf dieselbe Weise mit allen anderen Standards vor. Nehmen Sie Ihre Standards und zentrifugieren Sie sie kurz, um sicherzustell

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Die nicht-gezielte Erstellung von Metabolitenprofilen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Stoffwechsels.  In diesem Artikel wird ein typischer Arbeitsablauf für die Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen von Serum beschrieben, einschließlich Probenorganisation und -vorbereitung, Datenerfassung, Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Metabolitenidentifizierung.

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Hier beschreiben wir einen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) Assay zur Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus in getrockneten Blutflecken mit einem einfachen manuellen Proteinfällungsschritt und Online-Säulenextraktion.

Die Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus auf Getrocknetes Blut mittels LC-MS / MS

Dieses Protokoll beschreibt einen Assay zur Messung der CFTR-Funktion und der CFTR-Modulatorreaktionen in kultiviertem Gewebe von Probanden mit Mukoviszidose (CF). Aus Biopsien gewonnene Darmorganoide schwellen cAMP-getrieben an, eine Reaktion, die bei CF-Organoiden defekt (oder stark reduziert) ist und durch Exposition gegenüber CFTR-Modulatoren wiederhergestellt werden kann.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Metabolic Kompetenz von in vitro - Systemen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Biotransformation und Disposition von Drogen und Giften. In diesem Protokoll beschreiben wir die Anwendung von Referenzstoffwechselsonden Phase I in Zellkulturen des Stoffwechsel zu bewerten.

Massenspektrometrie und luminogenes-basierte Ansätze zur Charakterisierung von Phase I Metabolic Competency von<em&gt; In Vitro</em&gt; Zellkulturen

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Verfahren zur umfassenden Droge-Überwachung, die für die verbesserte Auflösung und Erkennung von großen Platten von Medikamenten, Missbrauch und deren Metabolite mit Qualitätskontrolle auf multisegment-Injektion-Kapillare ermöglicht Elektrophorese-Massenspektrometrie.

High-Throughput und umfassende Droge-Überwachung mittels Massenspektrometrie Multisegment-Injektion-Kapillar-Elektrophorese

Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll zur Quantifizierung von 40 Verbindungen, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in zellfreien Proteinsynthesereaktionen beteiligt sind. Das zellfreie Synthesegemisch wird mit Anilin zur effektiven Trennung mittels umgekehrter Flüssigchromatographie abgeführt und dann durch Massenspektrometrie unter isotopisch gekennzeichneten internen Standards quantifiziert.

Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Aktuelle Methoden zur Analyse der Patientenbindung an komplexe medikamentenresistente Tuberkulose-Therapien (DR-TB) können ungenau und ressourcenintensiv sein. Unsere Methode analysiert Das Haar, eine leicht zu sammelnde und gelagerte Matrix, auf Konzentrationen von 11 DR-TB-Medikamenten. Mit LC-MS/MS können wir Sub-Nanogramm-Medikamentenspiegel bestimmen, die verwendet werden können, um die Arzneimittelhaftung besser zu verstehen.

Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben

Beschrieben wird hier ein Protokoll zur Bestimmung von vier verschiedenen Tryptophan-Metaboliten, die im Kynurenin-Signalweg (Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, Xanthurensäure, 3-Hydroxyanthranilsäure) in dem Medium erzeugt werden, das aus Krebszellkulturen gesammelt wird, die durch flüssige Chromatographie in Verbindung mit einer einzigen Quadrupol-Massenspektrometrie analysiert werden.

Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Die Protokolle beschreiben Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Methoden, gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Untersuchung von Stoffwechselreaktionen in komplexen lysatbasierten zellfreien Systemen.

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien Systemen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Verfolgung der Evolution von mesialen Netzwerkmaßen bei Patienten mit Temporallappenepilepsie (TLE). Es basiert auf der Kombination von intrakraniellen Aufzeichnungen mit einer neuartigen numerischen Technik zur Datenanalyse. Konkret stellen wir ein Protokoll zur Netzwerkanalyse von Foramen ovale-Aufzeichnungen vor.

Netzwerkanalyse von Foramen Ovale Elektrode Recordings in Resistente Temporallappen Epilepsie-Patienten

Erfahren Sie eine optimierte HPLC-MS-Methode zur Analyse von Ivacaftor, seinen Metaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten. Diese Technik ermöglicht präzise pharmakokinetische Studien.

Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten (Video) | JoVE Journal

Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

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