Juxtacellular Überwachung und Lokalisierung von einzelnen Neuronen im Sub-kortikalen Hirnstrukturen der Alarm, Head-zurückhaltende Ratten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aktivität einzelner Neuronen innerhalb der subkortikalen Gehirnstrukturen von Ratten, die mit wachem Kopf gefesselt sind, zu überwachen und zu lokalisieren. Dies wird erreicht, indem die Ratte zunächst an die Fesselung in einer Stoffsocke gewöhnt wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Kopfstützenvorrichtung und eine Aufnahmekammer chirurgisch so zu implantieren, dass die Ratte während mehrerer aufeinanderfolgender Aufnahmesitzungen in der stereotaktischen Ebene gehalten werden kann.

Als nächstes wird die Ratte in eine geeignete Vorrichtung gebracht, um die verhaltens- und elektrophysiologischen Experimente durchzuführen, und es werden nebensächliche zelluläre neuronale Aufzeichnungen durchgeführt. Dieses Verfahren ermöglicht eine eindeutige Isolierung einzelner Einheiten. Der letzte Schritt besteht darin, die anatomische Lage der Aufnahmestelle mit Chicago Sky Blue Farbstoff zu markieren, damit sie in der Post-hoc-Totologie sichtbar gemacht werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber häufig verwendeten Methoden wie der extrazellulären Aufzeichnung mit Metallmikroelektroden besteht darin, dass Spikes von einzelnen Einheiten eindeutig isoliert werden können und dass die Aufnahmestelle in der Post-hoc-Histologie aufgedeckt werden kann. Um dieses Verfahren zu beginnen, betäuben Sie das Tier mit einer Ketamin-Xylazin-Injektion. Überprüfen Sie den Zehenrückzugsreflex, um die Anästhesieebene zu bestimmen und die Anästhesie durch weitere Verabreichung eines Anästhetikums aufrechtzuerhalten.

Falls erforderlich, rasieren Sie den Kopf und desinfizieren Sie die Operationsstelle mit Povidon-Jod. Setzen Sie die Ratte anschließend in einen stereotaktischen Halterahmen und sichern Sie ihren Kopf mit Ohrstangen. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels vom Mittelpunkt zwischen den Augen bis zur Rückseite der Ohren.

Entfernen Sie dann auf beiden Seiten des Schnitts einen zwei bis drei Millimeter großen Hautstreifen. Kratzen Sie das Periost ab, um den Schädel freizulegen, der sich bis zu den Seitenleisten erstreckt. Decken Sie anschließend den freiliegenden Schädel mit einer dünnen Schicht Sekundenkleber ab.

Bohren Sie anschließend ein kleines Loch unmittelbar hinter der Stelle, an der die bgma-Naht in einem Winkel von 30 bis 45 Grad auf den lateralen Kamm trifft, in den Schädel. Schrauben Sie dann eine Null 80 Flachbodenmaschine ein. Schrauben Sie das Loch in einem Winkel von 30 bis 45 Grad an und achten Sie darauf, nicht zu tief einzuschrauben, um das darunter liegende Hirngewebe nicht zu beschädigen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für sechs weitere Schrauben in dieser Konfiguration. Tragen Sie danach Sekundenkleber auf die Basis aller Schrauben auf. Setzt nun die Spritzennadel in den Stereo-Steuermanipulator ein.

Machen Sie mit der Nadel eine Delle in den Schädel, um eine geeignete Referenzstelle zu markieren. Markieren Sie dann die Delle mit einem Permanentmarker. Führen Sie anschließend eine Kraniotomie durch, die auf die gewünschte Koordinate zentriert ist, und lassen Sie die Duramasse intakt.

Decken Sie die Kraniotomie mit modifizierter künstlicher Hirnmarksflüssigkeit ab. Schneiden Sie anschließend ein 0,2 Milliliter Zentrifugenröhrchen in eine Länge von vier bis fünf Millimetern und schneiden Sie den Deckel ab. Legen Sie den Schlauch auf den Schädel und zentrieren Sie ihn über der Kraniotomie.

Tragen Sie dann Zahnzement um den Boden der Tube auf, um die Basis der Tube am Schädel abzudichten. Und achten Sie darauf, dass kein Zement in die freiliegende Kraniotomie gelangt. Bohren Sie nun ein weiteres kleines Loch in die kontralaterale Schädelplatte.

Führen Sie den Referenzdraht, der an einen Stiftstecker gelötet wurde, vorsichtig ein. Tragen Sie danach Sekundenkleber auf das Loch auf, in das der Draht eingeführt wurde, um den Stift und den Draht an Ort und Stelle zu halten. Mischen Sie dann die beiden Teile des Silikongel-Sets zu gleichen Portionen.

Warten Sie zwei Minuten und füllen Sie das Zentrifugenröhrchen mit Gel. Wenn die Kopfplatte etwa zu einem Drittel gefüllt ist, befestigen Sie sie an der Kopfstütze. Hier wurde die Stange an einer rechtwinkligen Pfostenklemme in einem Steigungswinkel von 45 Grad befestigt.

Befestigen Sie anschließend die Haltestange mit der Pfostenklemme am Stereo-Steuermanipulatorarm, so dass die Stange parallel zu den Ohrstangen ist, senken Sie die Stange und die Platte so ab, dass sich die Platte hinter der Lambda-Naht und vor der Kotsch-Mos-Schraube befindet. Fassen Sie dann die vordere Kopfschraube in einem Winkel von ca. 45 Grad mit einer Klemme an, so dass der Kopf der Schraube nach unten und in Richtung des Schwanzes des Tieres zeigt. Senken Sie danach die Schraube ab, um den Schädel zu berühren.

Befestigen Sie anschließend die Schraube und die Platte mit Dentalacryl. Tragen Sie eine Schicht Zahnzement um die Ränder des Zahnkunststoffs auf, um die Haut auf dem Implantat zu zementieren. Nachdem der Zement getrocknet ist, stechen Sie mehrere Löcher in die Kappe des Zentrifugenröhrchens und setzen Sie die Kappe auf das Röhrchen.

Entferne nun die Klemme. Entfernen Sie vorsichtig die Kopfhaltestange vom Stereo-Tac. Entfernen Sie dann die Kopfplatte von der Stange.

Entfernen Sie am Ende das Tier aus den Stereo-Attacken und führen Sie die postoperative Pflege und Überwachung durch. Bei diesem Verfahren wird eine Polopipette mit Quarzkapillarschlauch auf einer Kohlendioxid-Laser-Mikropipette polar pipettiert. Befestigen Sie dann die Pipette unter einem Differenzialinterferenzkontrastmikroskop, das mit einem Objektiv mit großem Arbeitsabstand ausgestattet ist.

Schieben Sie einen Glasblock mit einer Pipettenspitze langsam in das Sichtfeld. Brechen Sie mit dem Tischmikromanipulator die Spitze der Pipette, indem Sie sie vorsichtig mit dem Glas berühren. Wiederholen Sie den Vorgang bis zur Pipettenspitze.

Der Außendurchmesser liegt zwischen einem und drei Mikrometern. Bereiten Sie als nächstes die extrazelluläre Kochsalzlösung vor und fügen Sie 2% Chicago Sky Blue hinzu. Füllen Sie mit einer Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel das hintere Ende der Pipette mit einer Lösung.

Dann setzen Sie die Ratte in die Stoffsocke und übertragen Sie die Stoffsocke in ein starres Rohr auf eine geeignete Versuchsvorrichtung. Befestigen Sie die Kopfhalteplatte an der Ratte an dem entsprechenden Stück an der Vorrichtung. Platzieren Sie als Nächstes eine Mutter 8 32 auf der Kopfhalterungsschraube, die an der Ratte implantiert ist.

Anschließend schrauben Sie eine Gewindestange aus Edelstahl in die Kopfschraube. Öffnen Sie danach die Aufnahmekammer und entfernen Sie das Silikongel. Reinigen Sie die Kraniotomie mit einer feinen Pinzette.

Wenn bei der Kraniotomie wieder Gewebe nachgewachsen ist, wenden Sie während dieses Prozesses gegebenenfalls eine Iso-Fluor-Anästhesie an. Befestigen Sie anschließend die Pipette an dem motorisierten Mikromanipulator. Bewegen Sie die Pipette an die gewünschte Aufnahmeposition in der vorderen, hinteren und medialen lateralen Achse.

Schieben Sie dann die Pipette ventral durch die Dura, bis sie sich etwa 500 Mikrometer dorsal zum vorgesehenen Aufnahmeort befindet. Schieben Sie die Pipette langsam vor, während Sie auf einem Audiomonitor auf Spike-Ereignisse der aufgezeichneten verstärkten Spannung achten. Sobald Spike-Ereignisse identifiziert wurden, bewegen Sie die Pipette weiter um etwa null bis 100 Mikrometer, bis die positiven Spannungsablenkungen größer als etwa 500 Mikrovolt sind.

Um die Aufnahmestelle zu beschriften, stellen Sie die Stromquelle auf minus vier Mikroampere mit zwei zweiten Impulsen bei 50 % Einschaltdauer ein und leiten Sie den Strom vier Minuten lang an das Ionophor weiter, injizieren Sie Chicago Sky Blue durch die Pipette. Nach dem Versuch wird das Tier gemäß der üblichen Praxis durchblutet. Schneiden Sie dann das Gehirn und färben Sie es bei Bedarf gegen, um die anatomische Lage der gezeigten Aufnahmestelle zu identifizieren.

Hier ist die Beispiel-Spike-Aktivität einer VPM-Thalamus-Einheit, während eine Ratte aktiv quirlt. Hier ist ein Histogramm der Spike-Zeiten, ausgerichtet auf die momentane Phase der Vibra-Bewegung. Während der Rückzugsphase des Quirlens gibt es mehr Stacheln.

Nach der Aufnahme wurde der Standort dieser Einheit durch Aphorese mit Chicago Sky Blue Farbstoff beschriftet. Wie hier gezeigt, ist das Gewebe auf Cytochromoxidase-Aktivität gegengefärbt, um die neuroanatomischen Grenzen des VPM thalamus us freizulegen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie chirurgische und elektrophysiologische Techniken durchgeführt werden, die den Kopf des Tieres in der stereotaktischen Ebene halten und die Spike-Aktivität einzelner Neuronen eindeutig isolieren.