Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Zebrafischgehirnen von Larven zu isolieren und hochwertige RNA zu extrahieren, um nachgelagerte Analysen wie qPCR und Transkriptomik durchzuführen. Transgene Zebrafischlarven sind ein leistungsfähiges Werkzeug für die Live-Bildgebung und geben uns die Möglichkeit, einzelne Zellen wie Mikroglia in ihrer Lebensumgebung über die Zeit zu beobachten. Um jedoch ein detailliertes Verständnis ihrer Funktionen zu erlangen, müssen wir ihr Genexpressionsprofil verstehen, und unser Isolations- und Sortierprotokoll ist für diesen Zweck konzipiert.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verschiedene Zelltypen aus dem Zentralnervensystem mit minimaler Modifikation ihres Genexpressionsprofils isolieren kann, so dass Zellfunktionen und -eigenschaften charakterisiert werden können. Die Effizienz dieses Protokolls spiegelt sich in seiner Wirksamkeit wider. Mit diesem Protokoll können innerhalb kurzer Zeit ausreichende Mengen an RNA für verschiedene Downstream-Anwendungen hergestellt werden.

Nach der Aufzucht von Zebrafischembryonen in E3-Medium, das PTU enthält, gemäß dem Textprotokoll ist ein fluoreszierendes Stereomikroskop zu verwenden, um Larven bei zwei dpf auf GFP-positive Makrophagen und Mikroglia in DsRED-positiven Neuronen zu untersuchen. Um die Embryonen zu homogenisieren, werden an einem Punkt fünf ml 15 millimolares Tricain pro 50 ml Medium auf 50 Larven zur Vorbereitung der Anästhesie verwendet. Verwenden Sie dann eine Drei-ml-Pasteur-Pipette, um jeweils 10 Larven in eine 55-ml-Petrischale zu übertragen, die mit eiskaltem E3-Medium mit Tricain gefüllt ist, um sie endgültig zu betäuben.

Richten Sie unter einem Stenomikroskop 10 Larven in der Mitte der Petrischale aus und durchschneiden Sie dann mit einer chirurgischen Mikroschere die Larvenköpfe über dem Dottersack. Nehmen Sie mit einer Drei-ml-Pasteurpipette alle Köpfe auf und geben Sie sie mit so wenig Flüssigkeit wie möglich in einen Glashomogenisator auf Eis, der einen ml eiskaltes Medium A enthält. Ersetzen Sie jede kleine Petrischale, die eiskaltes E3 plus Tricain enthält, alle 30 Minuten durch eine neue, um sicherzustellen, dass die Durchtrennung in kaltem E3 plus Tricainmedium durchgeführt wird. Setzen Sie das eiskalte Medium A wieder in den Glashomogenisator ein, wenn die Farbe zu verblassen beginnt.

Sobald die gesamte Gruppe von Köpfen gesammelt wurde, entfernen Sie alle Medien A aus dem Glashomogenisator und ersetzen Sie sie durch einen ml frisches, eiskaltes Medium A. Während der Homogenisator noch auf Eis ist, verwenden Sie einen dicht schließenden Stößel, um das Hirngewebe zu zerkleinern, indem Sie 40 Runden Zerkleinern und Umdrehungen für drei bis fünf dpf-Larven und 50 Runden für sieben und acht dpf-Larven durchführen. Geben Sie dann zwei ml Medium A in die Zellsuspension, um die Zellen zu verdünnen und ihre Agglomeration mit Myelin zu reduzieren. Beseitigen Sie die Zellagglomeration, indem Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein kaltes 50-ml-Falcon-Röhrchen auf Eis laufen lassen.

Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Übertragen Sie einen ml Aliquote der Zellsuspension in kalte Ein-Komma-Fünf-ml-Röhrchen und drehen Sie sie 10 Minuten lang bei 300 g und vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann mit einer 10-ml-Spritze und einer 23-Gauge-1-Zoll-Nadel den Überstand.

Mit einem ml eiskaltem Medium mit einem Dichtegradienten von 22 Prozent, das sanft von fünf ml eiskalten 1X dbps mit null Komma überlagert wird, wird das Zellenpellet vorsichtig wieder suspendiert. Drehen Sie die Röhren mit 950 g ohne Pause in langsamer Beschleunigung bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Nach dem Spin wird das dbps-Dichtegradientenmedium im Myelin verworfen, das an ihrer Interphase gefangen ist.

Verwenden Sie dann Nullkomma fünf ml Medium A mit zwei Prozent NGS, um die Zellen zu waschen, und drehen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 300 mal g bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich und ziehen Sie dann die Zellpellets aus dem gleichen Versuchszustand zusammen in einem ml Medium A mit zwei Prozent NGS. Wenn die interessierenden Zellen ein fluoreszierendes Protein exprimieren, lassen Sie die Zellsuspension durch eine 35-Mikron-Zellsiebkappe laufen und überführen Sie sie in kalte 5-ml-FACS-Röhrchen auf lichtgeschütztem Eis.

Um Mikroglia immunzu färben, verwenden Sie null Komma drei ml Medium A plus zwei Prozent NGS, um das Zellpellet wieder zu suspendieren, und teilen Sie dann die Zellen auf drei Ein-Komma-Fünf-ml-Röhrchen auf, eines für ungefärbte Zellen zur Messung der Autofluoreszenz, eines zur Messung der unspezifischen Bindung eines Sekundärantikörpers an Mikroglia und ein drittes als Test. Fügen Sie allen Röhrchen ein Prozent Endotoxin azidfrei oder ein Blatt hinzu, um CD16, CD32-Wechselwirkungen mit der FC-Domäne von Immunglobulinen zu blockieren. Inkubieren Sie die Zellen dann 10 Minuten lang unter leichtem Rühren alle fünf Minuten.

Geben Sie dann den 4C4-Antikörper in das dritte Röhrchen und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang unter leichtem Rühren alle 10 Minuten. Dann die Röhrchen bei 300 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten drehen. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, waschen Sie das Pellet einmal mit null Komma fünf ml Medium A plus zwei Prozent NGS, bevor Sie die Röhrchen erneut drehen.

Suspendieren Sie das Zellpellet erneut mit null Komma fünf ml Medium A plus zwei Prozent NGS, fügen Sie dann ein Prozent Blatt hinzu und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang unter sanftem Rühren alle fünf Minuten. Zu den Röhrchen zwei und drei fügen Sie Sekundärantikörper hinzu und legen Sie die Röhrchen in die Dunkelheit. Nachdem Sie die Röhrchen gedreht und den Überstand verworfen haben, verwenden Sie null Komma fünf ml Medium A plus zwei Prozent NGS, um die Proben zweimal zu waschen, und suspendieren Sie dann die Zellpellets wieder mit einem ml Medium A plus zwei Prozent NGS.

Lassen Sie die Zellsuspension durch eine 35-Mikron-Zellsiebkappe laufen und überführen Sie sie in kalte fünf ml FACS-Röhrchen auf lichtgeschütztem Eis. Führen Sie abschließend die FACS-Sortierung und RNA-Extraktion gemäß dem Textprotokoll durch. In dieser Studie wurden Neuronen und Makrophagen sowie Mikroglia aus acht dpf mpeg1 EGFP-positiven NBT dsRED-positiven Larven isoliert.

FACS wurde verwendet, um die Zellen nach Funktion ihrer Größe und Körnung von Ablagerungen zu trennen. Anschließend wurden einzelne Zellen von Dubletten oder Zellagglomeraten getrennt. Aus der Einzelzellpopulation wurde ein Tor gezogen, um tote Zellen zu eliminieren.

Das entsprechende Dot Plot zeigte, dass dieses experimentelle Protokoll die Integrität der Zellplasmamembran bewahrt, da die Rate toter Zellen nur 26,7 Prozent beträgt. Wie hier gezeigt, konnten Neuronen und Makrophagen sowie Mikroglia leicht von den Gates der lebenden Zellpopulationen getrennt werden. Innerhalb des Gehirns schien die Neuronenpopulation stärker ausgeprägt zu sein als die Makrophagen- und Mikroglia-Population.

In einer zweiten Studie wurde die FACS-Sortierung verwendet, um lebende Mikroglia aus Larvengehirnen mit 4C4 zu isolieren, einem Antikörper, der Mikroglia spezifisch markiert. Wie in dieser Tabelle der Mikroglia-Isolierung und RNA-Extraktionsdaten zusammengefasst, variiert die Anzahl der Mikroglia in den Larvengehirnen von Zebrafischen und ist mit drei dpf sehr gering. Schließlich werden RNA-Extraktionsergebnisse, die mit einem Experiment aus Mikroglia von fünf dpf-Larven von Zebrafischgehirnen erhalten wurden, in dieser Elektrophoresespur mit einer klaren Visualisierung der ribosomalen RNA gezeigt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 12 Stunden durchgeführt werden, je nachdem, wie viele Köpfe pro Bedingung benötigt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, alles kalt und die Oberflächen sauber zu halten, um einen RNA-Abbau zu vermeiden. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Neurowissenschaften, die den Zebrafisch als Modell verwenden, um Genexpressionsprofile verschiedener Zellen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Zebrafischlarvengehirnen isoliert und wie man hochwertige RNA extrahiert, um nachgelagerte Analysen wie qPCR und Transkriptomik durchzuführen.