Name: Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Lernen Sie die Stichwundemethode zur Untersuchung von Neurogenese und Regeneration im adulten Zebrafisch-Telencephalon. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse zellulärer Reaktionen durch Immunhistochemie.

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Wir danken N. Borel und ihrem Fischhaus-Team, M. Rastegar für die Hilfe bei der Mikroskopie und T. Dickmeis für die Kommentare zum Manuskript. Wir danken für die Unterstützung durch das EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, das Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine Valley (NSB-Upper Rhine) und das BMBF-geförderte Netzwerk EraSysBio.

Zebrafische wurden in der Fischanlage des Instituts für Toxikologie und Genetik (ITG) am Karlsruher Institut für Technologie (KIT) gehalten. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den deutschen Tierschutzstandards durchgeführt und wurden von der Regierung von Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Deutschland (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 &quot;Adulte Neurogenese&quot;) zugelassen. 1. Generieren eine Stichwunde in der Telen <ol><li> Anästhesie <ol><li> Um eine Stammlösung von Tricaine (3-Amino benzoesäureethylester, auch als Ethyl-3-Aminobenzoesäure) vorzubereiten verwenden 400 mg Tricaine Pulver und löst ihn in 97,9 ml Wasser und 2,1 ml 1 M Tris / HCl-Puffer (pH 9). PH-Wert auf 7. Machen 5 ml Aliquots und speichern sie bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bringen Sie eine entsprechende Anzahl von 0,5-1 Jahre alten Zebrafisch aus ihren Panzern in Kunststoffmäusekäfige. Hinweis: Der Schädel eines erwachsenen Zebrafisch bei etwa 12Monate alt ist noch relativ weich und kann leicht mit einer Nadel perforiert werden (siehe Abschnitt 1.2.3 und Abbildung 1A). </li><li> Um die erwachsenen Zebrafisch zu betäuben, zu kombinieren Tricaine 5 ml (Stammlösung) in einem Kunststoffübergang Käfig mit ~ 100 ml Wasser sauber Aquarium (Endkonzentration Tricaine 0,02% (w / v) Tricaine). </li><li> Inkubieren Sie die Fische in den Anästhetika, bis sie sich nicht mehr bewegen (45-60 s). </li></ol></li><li> Telen Injury <ol><li> Platz betäubt einzelnen Zebrafisch in einen Schlitz in einem Block von Tricaine getränkten Schaumstoff. </li><li> Unter einem Binokular mit Licht von oben halten den Fisch vorsichtig mit einer Hand und orientieren sie in einer Weise, die den Zugriff auf den Kopf von oben ermöglicht. </li><li> Mit der anderen Hand drücken eine 30 G-Spritze (Insulinspritze mit integrierter Nadel) senkrecht durch den Schädel in den medialen Bereich einer telencephalic Hemisphäre (Fig. 1A-1B). Die Hemisphären des Telen einwieder durch den Schädel sichtbar. Stellen Sie sicher, dass die eingebrachte Läsion ist nicht tiefer als 2 mm (Abbildung 1C). Hinweis: Es wird dringend empfohlen, um die Läsion immer in die gleiche Hemisphäre einzuführen, um die Identifikation der Ort der Läsion, wenn das Gehirn sezieren aus dem Schädel zu erleichtern. </li><li> Nach dem Einbringen der telencephalic Verletzungen, legen Sie den Fisch in Fischwasser. Halten Sie bis zu 10 Fische in einem 2 L Mäusekäfig mit Fisch Wasser für die Wiederherstellung gefüllt und schließen Sie die Maus Käfig zu einer Wasserflusssystem. Anmerkung: Die Überlebensrate ist in der Regel ~ 97%, wenn Fisch gesund sind und keine weiteren Versuche wurden mit dem Fisch vor geführt. Zugabe von Antibiotika zum Fisch Wasser ist nicht erforderlich. Nach der Wiederherstellung, Fisch normalerweise verhalten: sie schwimmen, Futtermittel und Kumpel. </li></ol></li></ol> 2. Analyse der Wirkung von telencephalic Injury <ol><li> Gehirn-Dissection und Fixation <ol><li> Re-betäuben die wiederhergestellte Fisch zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Läsion (typically, 1, 3, 5, und 14 Tage nach Läsion (DPL)) mit 0,02% (w / v) Tricaine wie oben beschrieben und sie einschläfern, indem sie in Eiswasser für 5 min. </li><li> Legen Sie den Fisch auf einem Papiertuch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) eingeweicht und trennen den Kopf vom Körper, indem hinter die Kiemen mit einer scharfen Schere. </li><li> Halten Sie die Köpfe in 1x PBS für 5 Minuten, um die Blutung zu ermöglichen. Anmerkung: Diese entwässert Blut aus dem Gewebe, das die weiteren Schritte in dem Protokoll stören kann. </li><li> Beheben die Köpfe über Nacht bei 4 ° C in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS oder 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Zweimal waschen feste Köpfe mit 1x PBS in einer Petrischale. </li><li> Gehirn sezieren vorsichtig in 1x PBS unter einem Binokular 23. Die Läsion ist in der Regel unter dem Binokular sichtbar. Brains ohne sichtbare Läsion muss verworfen werden. </li><li> Übertragen Gehirn in 2 ml Reaktionsgefäße mit 1,5 ml 100% Methanol gefüllt (MeOH) und 5x vor Inkubation invertieren die Rohrebei -20 ° C für mindestens 16 Stunden. Hinweis: Das Gehirn kann mehrere Monate in MeOH bei -20 ° C aufbewahrt, bis sie für die Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung benötigt. </li></ol></li><li> Gewebepräparation für die Immunhistochemie <ol><li> Rehydrate die Gehirne durch einen absteigenden Methanol-Serie in 2-ml-Plastikröhrchen (sequenziell 75% MeOH (1x PBS, 0,1% Tween-20 = PTW);. 50% MeOH, 25% MeOH inkubieren die Gehirne (15 Gehirne / 2 ml Reaktionsgefäße ) für 5 Minuten in jeder Lösung. </li><li> Waschen Sie die Gehirne in PTW für 5 min. Wiederholen 4x mit frischen PTW. </li></ol></li><li> Die Einbettung der Gehirne für Sectioning <ol><li> Zur Einbettung, übertragen Sie die Gehirne von 2 ml Reaktionsgefäß in PTW in die Hohlräume eines Polyethylen-Formtassenablage mit einer Transferpipette (5 mm Durchmesser). </li><li> Bereiten Sie 2% igen (DNA grade) in 1x PBS in einem Erlenmeyerkolben. Wärme in der Mikrowelle bei 600 W bis die Agarose vollständig gelöst ist. Bereiten Sie 50 ml für 10 Gehirne. Lassen thE Agarose abkühlen für 3 min bei Raumtemperatur vor Gebrauch. Halten der Agarose auf einem vorgewärmten Wärmeblock (60 ° C), während die Einbettung der Köpfe, um die Verfestigung zu verhindern. </li><li> Entfernen des 1x PBS aus der Form, die ein Gehirn unter Verwendung einer Pasteur-Pipette (1 mm Durchmesser). Achten Sie darauf, um das Gehirn zu schädigen. </li><li> Gießen Agarose in die Form und füllen Sie es vollständig. Dann mit einem Dissektion Nadel, um das Gehirn in der Agarose wirbeln zu waschen den PTW macht es einfacher, das Gehirn zu verankern. </li><li> Orient das Gehirn in der Form Bauchseite nach unten, Rückenseite und legen Sie sie gerade. </li><li> Lassen Sie die Agarose abkühlen. Für schnellere Abkühlung, legen Sie die Form auf dem Eis. Wiederholen Sie die Schritte. </li><li> Wiederholen 2.3.3-2.3.6 für alle Gehirne. </li></ol></li><li> Trimmen der Agarose-Block <ol><li> Mit einer Dissektion Nadel, Pop aus der Agarose-Block. </li><li> Mit einer scharfen Rasierklinge, schneiden Sie die Agarose am hinteren Ende des Gehirns. Stellen Sie sicher, dass diese Ebene parallel zu der te istlencephalon. </li><li> Schneiden die Agarose am vorderen Ende des Gehirns. Dann drehen Sie den Block, so dass er auf der hinteren Ebene. </li><li> Entfernen Sie den Überschuss der Agarose durch Schneiden parallel zu Rücken des Gehirns und ventralen Seiten. Dann drehen Sie das Gehirn zurück, so dass es auf seiner Bauchseite liegt. </li><li> Schneiden des Blocks an einer abgeschnittenen Dreiecks, in dem das Telencephalon ist am kleineren Ebene (Fig. 2). </li></ol></li><li> Vorbereiten des Vibratom zum Schneiden <ol><li> Vorbereitung der Vibratom nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie eine neue Rasierklinge und ersetzen Sie es nach 10 Gehirne. </li><li> Auffüllen des Puffer Bad mit 1x PBS auf ein Niveau, das gerade den Boden der Schaufel erreicht. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Punkt Sekundenkleber auf der Oberseite des Probenteller des Vibratom. </li><li> Legen Sie das Flugzeug, das hinter dem Gehirn auf der Sekundenkleber befindet. Der Klebstoff wird so schnell härten, wie es in Kontakt mit dem in 1x PBS istdie Vibratom Puffer-Bad. </li><li> Legen Sie die Objektplatte mit der Probe in die Pufferwanne mit dem Manipulator des Mikrotoms. </li><li> Verwenden des Manipulators um die Objektplatte in die gewünschte Position zu drehen. Richten Sie den Block in der Puffer Bad in einer Weise, die das Telen knapp unter der Oberfläche lokalisiert, mit dem dorsalen Teil des Gehirns, mit Blick auf die Klinge. Ziehen Sie dann die scrw mit einem 3-mm-Inbusschlüssel und entfernen Sie den Manipulator. Hinweis: Die Klemmschraube oder eines der Klemmeinrichtungen nicht über die Lücke in der Probenscheibe befinden; in diesen Positionen die Spannobjektplatte ist nicht möglich. </li></ol></li><li> Schneiden des Gehirns <ol><li> Bereiten Sie eine 24-Well-Platte, um die Abschnitte zu sammeln. Pro Gehirn zu zerschneiden, zu füllen und einen mit 1 ml Blockierungspuffer (0,1% (v / v) 10% Tween-20, 0,2% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA), 1% (v / v) Dimethylsulfoxid (DMSO) in PBS). </li><li> Zu Beginn mit 50 &amp;mgr; m Dicke, 1 mm / sec Geschwindigkeit und Frequenz 70 Hzmit einem Schwing Mikrotom. </li><li> Verwenden Sie ein Synthetikpinsel (1 mm), holen die dünnen Scheiben aus Agarose, wie sie kommen aus der Klinge und sammeln sie in der 24-Well-Platte. </li></ol></li><li> Immunhistochemie auf Vibratom Abschnitte <ol><li> Blockieren nicht-spezifischer Bindungsstellen für 1 h bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer (0,1% (v / v), 10% Tween 20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO in PBS). </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 250 ul Antikörper in Blocking-Puffer über Nacht bei 4 ° C verdünnt Alternativ den primären Antikörper inkubiert für 2 h bei RT. Dann waschen 3x für 10 min in PTW. Hinweis: Für die PCNA-Färbung verwenden eine 1:400 Verdünnung (Maus-Anti-PCNA Details siehe Tabelle der Werkstoffe.). Mehrere primäre Antikörper gleichzeitig inkubiert werden. </li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte in sekundären Antikörpers für 2 h bei RT waschen dann 3x für 10 min in PTW. Hinweis: 1:1000 Verdünnung in PTW, für Details siehe Tabelle der Materialien. Mehrere sekundäre Antikörper gleichzeitig inkubiert werden. </li><li&gt; Optional: Die besten Ergebnisse werden beobachtet, wenn Abschnitte sind in PTW Nacht bei 4 ° C, um das Auswaschen von nicht-spezifisch gebundene Sekundärantikörper ermöglichen gehalten. In diesem Fall ersetzen Sie die PTW wieder einmal vor der Montage. </li></ol></li><li> Erwachsenen Gehirn-RNA in situ Hybridisierung (alternativ Immunhistochemie) <ol><li> Gehirn-Dissection und Fixation (gleiche Verfahren wie für die Immunhistochemie): <ol><li> Die Hybridisierung der Sonde. </li><li> Rehydrate Gehirne in 2 ml Reaktionsgefäße für die Immunhistochemie beschrieben. </li><li> Gehirne in Proteinase K (. ProtK; 10 ug / ml Endkonzentration) inkubiert in PTW für 30 min. Nach der Inkubationszeit entfernen ProtK / PTW und fixieren die Gehirne wieder für 20 min im BT-Fix (4% PFA, 4% Saccharose, 0,12 mM CaCl 2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4). </li><li> 5x waschen Gehirne für 5 min in PTW (0,1% (v / v) Tween-20 in PBS). </li><li> PTW entfernen und spülen Sie die Gehirne in 500 ulHYB-Puffer (50% (V / V) entionisiertes Formamid, 5 × SSC, 500 ug / ml Hefe-tRNA, 50 ug / ml Heparin, 0,1% Tween-20, 9 mM Citronensäure). Warten Sie, bis Gehirn sinken auf den Boden des Röhrchens dann den Überstand verwerfen und fügen Sie 500 ul von sauberen HYB-Puffer und Inkubation bei 65-70 ° C für 3-4 Stunden. </li><li> Verdünnt das RNA-Sonde bis 1:200 oder 1:400 (je nach Probe) in 400 &amp;mgr; l Endvolumen von HYB-Puffer. Erhitzen Sie das verdünnte RNA-Sonde bei 70 ° C für 5 min. </li><li> Überstand entfernen aus dem Gehirn und fügen Sie die RNA-Sonde, Inkubation bei 65-70 ° C (O / N). Sollten alle Waschpufferlösungen vorgewärmt und bei 70 ° C gehalten werden </li></ol></li><li> Labeling <ol><li> 30 min waschen die Gehirne bei 65-70 ° C (bei allen 4 Waschschritte) mit 500 &amp;mgr; l Waschpuffer 1 (50% Formamid, 1 × SSC, 0,05% Tween 20) zweimal. Puffer 1 ersetzen durch Puffer 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20), und die Proben für 15 min. Entfernen Puffer 2 und waschen Gehirne in Puffer 3 (0,2 x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 Minuten, zweimal wiederholen Sie diesen Schritt zwei. Puffer 3 ersetzen durch Puffer 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 in PTW), Inkubation für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und waschen für 5 min in 500 ul PTW bei RT. </li><li> Embed Gehirn in 2% Agarose (in 1x PBS) und schneiden Vibratom Abschnitte (50-100 um) als für die Immunhistochemie beschrieben. </li><li> Wasch 1x 5 min in 500 &amp;mgr; l Blockierungspuffer (1 × PBS, 0,1% Tween-20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO). </li><li> Überstand entfernen und fügen 500 ul Blockierungspuffer für 2 h bei RT. </li><li> Überstand entfernen und 300 ul Anti-Dig AP-gekoppelten Antikörper verdünnt 1:4000 in Blockierungspuffer. </li><li> Inkubation o / n bei 4 ° C </li></ol></li><li> NBT / BCIP Färbung <ol><li> Für 15 min mit Puffer bei RT PTW 5x waschen. </li><li> Spülen Sie 1x in Färbepuffer. Zweimal 5 min Färbung Puffer (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) gewaschen. </li><li> Überstand entfernen und Fleck mit 500 μl Färbelösung (3,5 &amp;mgr; l 4-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) pro 1 ml Färbepuffer). </li><li> Stoppen Färbung durch Spülen 3x mit PTW 5x. </li></ol></li></ol></li><li> Montage der § § <ol><li> Montieren Sie die Abschnitte auf Objektträger mit einem wasserlöslichen, nicht-fluoreszierenden Montagemedium (siehe Materialien Tabelle). </li><li> Folien bleiben im Kühlschrank bei 4 ° C Hinweis: Die Färbung ist für mehrere Wochen oder sogar Monate stabil. </li><li> Analysieren Sie die Folien unter einer Verbindung oder konfokalen Mikroskop. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben hier eine Methode, um eine telencephalic Verletzungen, indem eine Nadel durch den Schädel des erwachsenen Zebrafisch zu induzieren, und die zellulären und molekularen Reaktion auf diese Verletzung durch Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung zu analysieren. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber anderen existierenden Ansätzen ist seine Einfachheit, Geschwindigkeit und Wirtschaftlichkeit. Daher kann diese Technik, die Produktion von vielen verletzten Gehirn in kurzer Zeit ermöglicht, leicht mit einem großen Maßstab in-situ-Hybridisierung Bildschirm, um Gene, die mit einer Rolle in der Regeneration und Neurogenese zu identifizieren kombiniert werden. Das Alter des erwachsenen Zebrafisch an dem die Schädigung durchgeführt wird, von entscheidender Bedeutung. Wenn der Fisch älter als 1,5 Jahre, der Schädel zu hart und es ist möglich, daß der Schädel nach unten gedrückt oder gebrochen anstatt sauber perforiert. Im Gegensatz dazu ist bei jüngeren Fisch (jünger als 4 Monate), gibt es noch eine Menge von Neurogenese im Gange, die zu gegebener lead, um falsch-positive Ergebnisse in Bezug auf reaktive Neurogenese. Ein weiterer entscheidender Schritt in diesem Ansatz ist es, die Effizienz der Stichwunde Akkreditierung und auszuschließen, dass die beiden Halbkugeln verwundet. Dies kann durch Färbung der Schnitte mit Anti-PCNA-Antikörper überwacht werden. In einem korrekt eingeführt Läsion sollte deutlich sein PCNA in nur einer der Halbkugeln hochreguliert. Es ist wichtig zu beachten, dass die induzierte mechanische Verletzung zahlreiche Nebenwirkungen wie unspezifische Zell Ablation, erhöhten Zelltod aufgrund von sekundärer Degeneration, Entzündung und Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke, und Beschädigung der ventrikulären Zone und so haben eine mögliche Folge Strömung der Zerebrospinalflüssigkeit in das Hirnparenchym. Allerdings scheinen die verletzten Fische aus der Verletzung leiden sehr wenig. Innerhalb von 2 min sind sie frei schwimmen und wieder normalen Fressverhalten innerhalb von etwa 4 Stunden wieder hergestellt. Nach 3 Wochen ist der injury ist morphologisch nicht mehr sichtbar. In unseren Händen, aus mehreren hundert Operationen haben wir nicht einen einzigen Fisch zu verlieren, trotz der Tatsache, dass wir eine 100% Verletzungsrate als durch Histologie bei 5 Tage nach der Läsion beurteilt. In den letzten Jahren andere Techniken wie transgene Ansätze haben im Zebrafisch entwickelt, um Gewebe-oder Zelltyp-spezifische Ablation 2 zu erzeugen. Obwohl diese Techniken sind sehr elegant und minimal invasive sie auf die Erzeugung von komplexen DNA-Konstrukte und die Einrichtung mehrere stabile transgene Zebrafisch-Linien, die sehr mühsam und zeitaufwendig sein kann, basiert. Daher einfache mechanische Ansätze wie die in diesem Protokoll beschriebenen Test vor ein wichtiges Werkzeug, um erwachsenen Gehirn Neurogenese und Regeneration zu studieren.

Säugetiere haben eine sehr begrenzte Fähigkeit, neue Neuronen im Erwachsenenalter zu erzeugen, und adulte Neurogenese im Gehirn ist vor allem auf zwei Bereiche an der telencephalic Subventrikularzone (SVZ) der lateralen Ventrikel gelegen eingeschränkt, und die Subgranularzone (SGZ) des Gyrus Gyrus im Hippocampus ein. Säugetiere können auch nicht für Schäden des Gehirns durch neurodegenerative Erkrankungen, Schlaganfall oder Verletzungen zu reparieren, effizient. Verloren Neuronen nicht ersetzt und statt Proliferation von verschiedenen Arten von Gliazellen, einschließlich Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten, beobachtet. Als Folge dieser proliferativen Prozess namens reaktive Gliose ist die verletzten Gehirngewebe durch die Bildung einer glialen Narbe, die neuronale und axonale Regeneration 2-4 hemmt abgedichtet. Im Gegensatz zu Säugetieren, Knochenfischen wie dem Zebrafisch reichlich bilden neue Nervenzellen im adulten Stadien und haben eine hohe regenerative und proliferative Potenzial, Läsionen des Zentralnervensystems 2,5-7 reparieren. Der Zebrafisch erwachsene Gehirn enthält 16 verschiedene neuronale Stammzellnischen, die eine große Anzahl von neuen Nervenzellen während der gesamten Lebensdauer 8-11 generieren. Neuronen in diesen spezifischen Proliferationszonen des erwachsenen Zebrafischgehirn geboren migrieren, um ihre Zielgebiete, wo sie reifen und in die bestehenden neuronalen Netzwerken 8,10,12-15 integrieren. Unter den in erwachsenen Zebrafisch identifiziert Vorläuferzonen ist die telencephalic ventrikulären Zone eine der am besten untersuchten neuronalen Stammzellnischen. Die Zellen in dieser Vorläufer Nische kann in drei verschiedene Arten in Bezug auf ihre Morphologie, Teilungsrate und die Expression von verschiedenen Gliazellen oder neuronalen Marker klassifiziert werden. Typ I und Typ II-Zellen sind radiale Gliazellen, wie Zellen, die lange Prozesse haben. Sie drücken Stammzellen Marker einschließlich GFAP, Nestin und S100β. Typ-I-Zellen nicht vermehren, während Typ II-Zellen proliferate langsam, wie durch die Expression des Proliferationsmarker wie proliferierenden Zellkernantigen (PCNA) und den Einbau von Desoxythymidin Analoga nachgewiesen. Die Typ-III-Zellen sind schnell teilenden Zellen, die sich verpflichtet haben, neuralen Vorläuferzellen zu werden und Express neuronalen Marker-Gene, wie PSA-NCAM 5,16. Obwohl die Regenerationsfähigkeit von Knochenfischen gut dokumentiert sind, sind nur wenige Veröffentlichungen ausführlich beschrieben und untersucht die zellulären und molekularen Mechanismen der neuronalen Regeneration in der erwachsenen Telen in Reaktion auf eine Verletzung beteiligt 15,17-22. Um die Mechanismen im Zebrafisch erwachsenen Zentralnervensystem die Regeneration und Reparatur gebracht entschlüsseln und die Gemeinsamkeiten und die Unterschiede zwischen konstitutiven und regenerative Neurogenese zu verstehen, entwickelten wir eine Zebrafisch-Modell der Erwachsenen telencephalic Verletzung. Hier werden wir visuell zu beschreiben, wie man eine Verletzung in einem der telencephalic hemisph erzeugeneRest mit Hilfe einer Spritze und Nadel, während die unverletzten kontralateralen Seite als interne Kontrolle. Wir werden auch zeigen, wie Änderungen bei der Verletzung bei der Zellproliferation und die Genexpression durch Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierungstests überwachen.

<table><tbody><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS (-/-)</td><td>Life technologies</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>30 G Spritze (Omnican 40)</td><td>B.Braun Melsungen</td><td>916162</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylen Formbecherschale&nbsp;</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>PeqGOLD Universal Agarose&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Biochrom</td><td>W 2835919108</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>Präpariernadel</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Carl Roth</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 414</td><td>Sch&ouml; ffler und W&ouml; rner</td><td><a href="http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx? ItemID=06%201362%200020">06 1362 0020</a></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Labonord</td><td>5305103</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 24 x 60 mm</td><td>Labonord</td><td>5305060</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, 94 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen, 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100 (1:500)</td><td>Dako</td><td>Z031101-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PCNA (1:400)</td><td>Dako</td><td>M087901</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (1:1.000)</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dig AP-gekoppelter Antikörper&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383221</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Formbecher aus Polyethylen&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop Sp5 DM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop Nikon SMZ 645</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatten mit flachem Boden&nbsp;</td><td>Falcon Katalog&nbsp;</td><td></td><td></td>353226</tr><tr><td>Student Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio Tg(olig2:EGFP)</td><td>Shin et al.24</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio WT-Stämme (z.B. , AB2O2)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stichwunde verletzung des zebrafisch erwachsene telen: eine methode, um wirbel gehirn neurogenese und regeneration untersuchen

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Erwachsene Zebrafisch haben eine erstaunliche Fähigkeit, ihre zentralen Nervensystems nach Verletzungen zu regenerieren. Um die zelluläre Antwort und die molekularen Mechanismen im Zebrafisch erwachsenen Zentralnervensystem (ZNS), Regeneration und Reparatur zu erforschen, entwickelten wir eine Zebrafisch-Modell der Erwachsenen telencephalic Verletzung. In diesem Ansatz haben wir eine Verletzung manuell durch Drücken eines Insulin-Spritzennadel in die erwachsenen Zebrafisch Telen generieren. An verschiedenen Tagen nach der Verletzung werden die Fische getötet, ihre Gehirne werden herausgeschnitten und durch Immunhistochemie und / oder in-situ-Hybridisierung (ISH) mit entsprechenden Markierungen, um die Zellproliferation, Gliogenese und Neurogenese zu beobachten gefärbt. Die unverletzten kontralateralen Hemisphäre dient als interne Kontrolle. Diese Methode kombiniert zum Beispiel mit RNA-Sequenzierung kann tief Bildschirm für neue Gene, die mit einer Rolle in Zebrafisch-Neurogenese Telen Erwachsenen, Regeneration und Reparatur zu helfen.

Unter Verwendung des in diesem Artikel beschriebenen Arbeitsablauf wurde eine Läsion in der rechten Hemisphäre eines erwachsenen Zebrafisch Telencephalon (Fig. 1A-1B) eingeführt. Eine korrekte Verwundung führt zu einer Läsion Kanal von Rücken erstreckt sich durch die ganze Pallium des Telen (3C) ventralen. Die Läsion sollte einer der Halbkugeln beschränkt werden und sollte nicht das mediale Herzkammer zu überqueren. Die Läsion Kanal ist mit Hellfeld-Mikroskopie (Abbildung 3C) sichtbar und wird nach ca. 35 Tage 15 geheilt werden. Es wurde zuvor gezeigt, dass nach der Verwundung eine Hochregulierung von proliferierenden Zellkernantigen (PCNA, Fig. 3A) und S100β (3B) bei 3 bis 7 DPL 15 ist durch Immunhistochemie nachgewiesen werden. Die Färbung von PCNA und S100β Überschneidungen, was die Proliferation von radialen Gliazellen. FFisch 24: angemeldete Marke, um Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) sichtbar zu machen, eine Stichwunde Assay wurde auf der Tg (EGFP Olig2) durchgeführt. Nach Färbung mit einem anti-GFP-Antikörper, ist die Anreicherung von OPCs in der Nähe der Läsion Kanal nachweisbar (Fig. 3D). Diese Anreicherung ist vergänglich, und OPC-Cluster werden nicht mehr bei 35 dpl 15 beobachtet. Wenn die Läsion nicht richtig eingeführt, wird die Läsion Kanal nicht sichtbar sein, und die Hochregulierung von PCNA und S100β oder Ansammlung von OPCs nicht nachweisbar sein. PCNA ist der empfindlichste Marker für Hirnverletzung. Um die Effizienz der Stichwunde Akkreditierung und auszuschließen, dass die beiden Halbkugeln verwundet werden, wird dringend empfohlen, immer färben die Abschnitte mit einem Anti-PCNA-Antikörper. In einem korrekt eingeführt Läsion sollte deutlich sein PCNA hochreguliert (bis zu 4-fach 15) nur in einer der Halbkugeln. Obwohl in den meisten Fällen ist esausreichend, um als interne Kontrolle, um Veränderungen in der Genexpression überwachen verwenden nur die unverletzten kontralateralen Seite, ist es sehr empfehlenswert, die Genexpression in der Steuer Hemisphäre mit dem Ausdruck in telencephalic Hemisphären des Wildtyp-Gehirne zu vergleichen. Auf diese Weise können jegliche systemische Wirkungen der Läsion auf die Genexpression, die beide Hemisphären beeinflussen würde detektiert werden. Die Stichwunde Assay in Kombination mit einem systematischen Ausdruck Bildschirm Transkriptionsregulatoren (TRS) (25 und Schmidt et al., Unveröffentlicht) kann auch verwendet werden, um Gene TR mit einer möglichen Rolle bei der Neurogenese und Regeneration (Fig. 4A-4C) zu identifizieren. Dieser Ansatz hat eine Reihe von Faktoren, die in der Telen exprimiert werden und deren Expression spezifisch in Reaktion auf eine Verletzung (4A-C) hochreguliert identifiziert. <imgalt = &quot;Abbildung 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung des erwachsenen Zebrafisch telencephalic stab Verwundung. A) Insulin-Spritzennadel durch den Schädel eines erwachsenen Zebrafisch eingeschoben, um eine telencephalic Verletzungen erzeugen. Die weiße gestrichelte Linie die Grenze zwischen den beiden Hemisphären telencephalic und das grüne Kreuz zeigt die Position der Stichwunde. B) Rückenansicht eines erwachsenen Zebrafisch Gehirn. Die Hauptgehirnbereiche sind angegeben. Das grüne Kreuz zeigt die Position der induzierten Verletzung. C) Die Spitze der Nadel, die auf die Verletzung herbei telencephalic dient, misst 2 mm. Riechkolben (ob), Telen (tel) und Tectum opticum (ot). <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> 2. SChematic Darstellung eines erwachsenen Zebrafischgehirn in einem ausgeschnittenen Agarose-Block kurz vor Vibratoms Schneiden. Anterior ist oben. Riechkolben (ob), Telen (tel), Tectum opticum (ot), Kleinhirn (cb) und Mark (m). Maßstabsbalken: 500 um. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Regenerative Reaktionen auf Verletzungen Wunde stechen. AD) Adult Zebrafisch-Gehirns bei 5 Tage nach der Läsion (DPL). AB) Die proliferative Marker PCNA (A) und die radiale Gliazellen Marker S100β (B) sind in der ventrikulären Zone (Pfeile) auf Stich Verwundung hochreguliert. (C) Die Läsion Kanal ist unter Hellfeldbeleuchtung (Pfeile) sichtbar. Die ventrikuläre Zone wird durch die grüne Linie dargestellt. (D) Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (Olig2: EGFP +) sammeln sich an der Stelle der Läsion (Pfeile). Maßstabsbalken: 200 um. In allen Panels, ist die rechte Hemisphäre die lädierten Hemisphäre. Dorsal ist oben. Die gestrichelte Linie in A bis D bezeichnet die Grenze zwischen dem Pallium und der subpallium. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> 4. Ein Beispiel von Genen als Reaktion hochreguliert, um Verletzungen zu stechen. Beachte die starke Hochregulierung (Pfeile) eomesa (A, B) und sox4a (C)-mRNA-Expression in der rechten Hemisphäre telencephalic (gestochen Hemisphäre) als überwachte durch in situ-Hybridisierung bei 5 DPL. Die linke Hemisphäre ist unverletzt und dient als Kontrolle. (B) zeigt eine stärkere Vergrößerung des dorsalen telencephalic Region A. Rücken oben ist. Maßstabsbalken: 200 um für A und C und 55 um für B. Diegestrichelten Linie in A und C gibt den Abstand zwischen dem Pallium und der subpallium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table><tbody><tr><td colspan="2"> ABKÜRZUNGEN </td></tr><tr><td> AP </td><td> Alkalische Phosphatase </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> 5-Brom-4-Chlor-3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Rinderserumalbumin </td></tr><tr><td> CNS </td><td> Zentrales Nervensystem </td></tr><tr><td> Dig </td><td> Digoxygenin </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Dimethylsulfoxid </td></tr><tr><td> dpl </td><td> Tage nach der Läsion </td></tr><tr><td> eomesa </td><td> Eomesodermin Homolog ein </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Saures Gliafaserprotein </td></tr><tr><td> hr </td><td> Stunde </td></tr><tr><td> HYBPuffer </td><td> Hybridisierungspuffer </td></tr><tr><td> ISH </td><td> in-situ-Hybridisierung </td></tr><tr><td> MeOH </td><td> Methanol </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Nitro-Blau-Tetrazolium </td></tr><tr><td> OPCs </td><td> Oligodendrozyten-Vorläuferzellen </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung </td></tr><tr><td> PCNA </td><td> Proliferierende cell nuclear antigen </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Para </td></tr><tr><td> ProtK </td><td> Proteinase K </td></tr><tr><td> PSA-NCAM </td><td> Polysialyliert neuronales Zelladhäsionsmolekül </td></tr><tr><td> PTW </td><td> PBS, 0,1% Tween-20 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> Ribonukleinsäure </td></tr><tr><td> RT </td><td> Zimmertemperatur </td></tr><tr><td> SGZ </td><td> Subgranularzone </td></tr><tr><td> sox4a </td><td> SRY-Box mit Gen 4a</td></tr><tr><td> SSC </td><td> Saline-Natriumcitrat </td></tr><tr><td> SVZ </td><td> Subventrikularzone </td></tr><tr><td> TRs </td><td> Transkriptionsregulatoren </td></tr></tbody></table>

Um die zellulären und molekularen Mechanismen der Neurogenese und Regeneration adulter Zebrafische zu beleuchten, haben wir ein Protokoll für invasive Operationen entwickelt, die mechanische Verletzungen im adulten Telencephalon des Zebrafisches verursachen, und die anschließende Überwachung von Veränderungen in der gestochenen Hemisphäre durch Immunhistochemie oder in situ Hybridisierung.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die zelluläre Antwort sowie die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die an der adulten Neurogenese und der Regeneration sowie Reparatur des zentralen Nervensystems beteiligt sind. Bei Zebrafischen wird dies zunächst erreicht, indem manuell eine Verletzung durch Einstich in die rechte zephalische Hemisphäre eines adulten Zebrafisches erzeugt wird. Danach wird der Fisch fünf Tage nach der Verletzung getötet, sein Gehirn wird präpariert, in Aros eingebettet und zum Schneiden in einem Ome aufbereitet.Anschließend werden die Gehirnschnitte mittels Immunhistochemie oder *in situ*-Hybridisierung mit geeigneten Markern gefärbt. Um die Zellproliferation, Gliogenese und Neurogenese zu beobachten, werden Ergebnisse erhalten, die eine Hochregulation des Proliferationsmarkers PCNA, des radialen Glia-Markers S100β sowie oligodendrozytäre Vorläuferzellen zeigen, die mit EGFP markiert und in der ventrikulären Zone nach einer Stichverletzung nachweisbar sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, insbesondere dem transgenen Ansatz zur Erzeugung gewebe- oder zelltypspezifischen Ablationen, liegt in ihrer Einfachheit, Schnelligkeit und Effizienz, wodurch innerhalb kurzer Zeit eine große Anzahl verletzter Gehirne erzeugt werden kann.Nach der Anästhesie erwachsener Zebrafische gemäß dem Textprotokoll wird jeder Fisch einzeln in einen Schlitz eines Blockes aus mit Trica getränktem Filterpapier unter einem Auflicht-Durchlichtmikroskop platziert. Der Fisch wird mit einer Hand vorsichtig gehalten und so ausgerichtet, dass mit einer Spritze, die mit einer Nadel der Stärke 30 ausgestattet ist, von oben Zugang zum Kopf besteht. Mit der anderen Hand wird die Nadel senkrecht durch den Schädel bis zu einer Tiefe von maximal zwei Millimetern in den medialen Bereich einer zephalen Hemisphäre eingeführt.Nach der Einbringung der zephalischen Verletzung das Fisch in frisches Fischwasser geben. Anschließend den Fisch in das Wasserdurchflusssystem zurückbringen. Nach der Erholungsphase über den gewünschten Zeitraum hinweg und nach erfolgter Euthanasie gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll die Tiere auf Eis opfern und mit einer scharfen Schere hinter den Kiemen schneiden, um den Kopf vom Körper zu trennen.Inkubieren Sie die Köpfe fünf Minuten lang in 1× PBS, um das Ausbluten zu ermöglichen. Danach überführen Sie die Köpfe in 4 % Paraformaldehyd in PBS und inkubieren sie über Nacht bei vier Grad Celsius oder vier Stunden bei Raumtemperatur. Nach der Fixierung waschen Sie die Köpfe zweimal mit 1× PBS in einer Petrischale. Danach vorsichtig unter einem Stereomikroskop die Gehirne in PBS sezieren. Verwerfen Sie alle Gehirne ohne sichtbare Läsion. Überführen Sie die Gehirne in 2-Milliliter-Reaktionsgefäße, die mit 1,5 Millilitern 100 % Methanol gefüllt sind, und invertieren Sie die Gefäße fünfmal, bevor sie mindestens 16 Stunden bei minus 20 Grad Celsius inkubiert werden.Um das Gewebe für die Immunhistochemie zu rehydrieren, inkubieren Sie die Gehirne jeweils fünf Minuten in einer absteigenden Methanolreihe, bevor Sie die Gehirne fünfmal mit PBS-Tween 20 oder PTW waschen, jeweils fünf Minuten lang. Verwenden Sie als Nächstes eine Transferpipette, um die Gehirne in die Hohlräume einer Polyethylen-Gießform zu geben, und lösen Sie 2 % Agaros in 1x PBS auf, indem Sie es in einer Mikrowelle bei 600 Watt erhitzen.Lassen Sie das Agros drei Minuten lang abkühlen, bevor Sie es verwenden. Entfernen Sie dann vorsichtig das PTW von einem Gehirn, bevor Sie das Formstück vollständig mit Aros füllen. Benutzen Sie die Präpariernadel, um das Gehirn in dem Aros zu drehen, um das PTW wegzuspülen, und richten Sie das Gehirn mit der ventralen Seite nach unten und der dorsalen Seite nach oben aus, und positionieren Sie es gerade, bevor Sie das Agros abkühlen lassen.Entfernen Sie mit einer Dissektionsnadel den Agaroseblock aus der Form. Schneiden Sie dann mit der scharfen Rasierklinge die Agarose parallel zum Talon Cephalon am hinteren Ende des Gehirns. Schneiden Sie nun die Agarose am vorderen Ende des Gehirns durch, bevor Sie den Block umdrehen, sodass er auf der hinteren Fläche steht.Entfernen Sie das überschüssige Agarose, indem Sie Schnitte parallel zur dorsalen und ventralen Seite des Gehirns ausführen. Drehen Sie dann das Gehirn um, sodass es auf seiner ventralen Seite liegt. Schneiden Sie den Block schließlich zu einem abgestumpften Dreieck, bei dem sich das Cephalon an der kleineren Fläche befindet.Nach der Vorbereitung des Vioms gemäß den Herstelleranweisungen verwenden Sie ein XPBS, um das Pufferbad so zu füllen, dass es gerade die Unterseite der Klinge erreicht. Bringen Sie anschließend einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf die Oberseite der Probenscheibe des Vibratoms an. Platzieren Sie dann vorsichtig die Ebene des Blockes, die hinter dem Gehirn liegt, auf den Sekundenkleber.Verwenden Sie den Mikrotom-Manipulator, um die Probenscheibe in das Pufferfach einzuführen, und drehen Sie die Probenscheibe in die gewünschte Position. Anschließend ziehen Sie die Schraube mit einem Drei-Millimeter-Inbusschlüssel fest und entfernen den Manipulator. Positionieren Sie den Block im Pufferbad so, dass sich das Cephalon knapp unter der Oberfläche befindet und die dorsale Seite des Gehirns zur Klinge zeigt, um die Gehirne zu schneiden.Bereiten Sie eine 24-Loch-Platte zur Sammlung der Schnitte vor, indem Sie je Gehirn ein Milliliter Blockierpuffer in die Vertiefungen der Platte am vibrierenden Mikrotom geben. Beginnen Sie das Schneiden mit einer Dicke von 50 Mikrometer, einer Geschwindigkeit von einem Millimeter pro Sekunde und einer Frequenz von 70 Hertz. Nehmen Sie die dünnen Schnitte von aros, sobald sie von der Klinge abfallen, mit einem synthetischen Pinsel auf und sammeln Sie sie in der 24-Loch-Platte.Führen Sie die Immunhistochemie durch, indem Sie nicht-spezifische Bindungsstellen eine Stunde bei Raumtemperatur blockieren. Entfernen Sie nach der Inkubation den Puffer und geben Sie 250 µL Antikörper in Blockierpuffer verdünnt hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius oder zwei Stunden bei Raumtemperatur, bevor Sie die Proben dreimal für jeweils eine Minute mit PTW waschen. Inkubieren Sie anschließend mit sekundären Antikörpern für zwei Stunden bei Raumtemperatur.Spülen Sie die Schnitte dreimal. Verwenden Sie ein wasserlösliches, nicht fluoreszierendes Einbettmedium, um die Schnitte zu präparieren. Analysieren Sie anschließend die Proben unter einem Auflichtmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop.Wenn die Verletzung korrekt durchgeführt wird, entsteht ein Läsionskanal, der sich vom dorsalen zum ventralen Bereich des Paläums des Tastkephalons erstreckt und sich nach 35 Tagen schließt. Mittels Immunhistochemie wurde bereits früher gezeigt, dass die Verletzung eine Hochregulierung von PCNA, S100-beta und ein überlappendes Muster drei bis sieben Tage nach der Läsion hervorruft, was auf eine Proliferation radialer glialer Zellen hinweist.Diese Abbildung zeigt eine vorübergehende Anhäufung von Vorläuferzellen der Oligodendrozyten oder OPCs in unmittelbarer Nähe einer Stichverletzung, die in transgenen olig two EEG FP-Fischen hervorgerufen wurde und am 35. Tag nach der Läsion nicht mehr nachweisbar ist. Wird die Läsion nicht korrekt angelegt, ist der Läsionskanal nicht sichtbar. Eine Hochregulation von PCNA und S100 beta bzw. eine Anhäufung von OPCs ist nicht nachweisbar.Wie hier dargestellt, hat ein systematischer Expressions-Screen, der Transkriptionsregulatoren in den Gehirnen von Fischen mit Läsionen im Vergleich zu Wildtyp-Gehirnen untersucht, eine Reihe von Faktoren identifiziert, die im Telencephalon exprimiert werden und nach Verletzung hochreguliert sind. Die Kombination der Schnittverletzungsmethode beispielsweise mit RNA-Tiefensequenzierung und/oder In-situ-Hybridisierung kann dazu beitragen, neue Gene zu identifizieren, die an der adulten Neurogenese, Regeneration und Reparatur beim Zebrafisch beteiligt sind.

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Dieses Video beschreibt die Technik der Mikrodissektion des Gehirns eines erwachsenen Zebrafisches. Diese Methode hilft dabei, aus dem gesamten Gehirn gewonnene Neuorosphären zu erhalten, die weiter untersucht werden können.

Zebrafisch-Hirndissektion: Eine Technik der Fisch-Neurobiologie

In diesem Artikel zeigen wir ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression in den Zellen des ventrikulären erwachsenen Zebrafisch telencephalon Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide. Wir präsentieren diese Methode als eine effiziente und schnelle Protokoll, das für funktionelle Studien in der erwachsenen Gehirn von Wirbeltieren eingesetzt werden können.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Obwohl die peripheren Nervensystem (PNS) in der Lage ist signifikant Reparatur nach Verletzung, ist wenig über die zellulären und molekularen Mechanismen, die dieses Phänomen regeln bekannt. Mit Live-transgene Zebrafisch und einer reproduzierbaren Nervendurchtrennung Assay können wir dynamische Gliazellen Verhalten während Nerv Degeneration und Regeneration zu studieren.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese, Charakterisierung und Injektion von Monomeren Amyloid-β42 Peptide zur Erzeugung von Amyloid Toxizität in Erwachsenen Zebrafisch, eine Alzheimer-Krankheitsmodell, gefolgt von histologische Analyse und Erkennung von Aggregationen.

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Präsentiert wird hier eine Elektroporationsmethode für die Plasmid-DNA-Abgabe und ependymogliale Zellbeschriftung im erwachsenen Zebrafischtelencephalon. Dieses Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Visualisierung und Verfolgung einzelner ependymoglialer Zellen und eröffnet neue Möglichkeiten, Elektroporation auf eine breite Palette genetischer Manipulationen anzuwenden.

Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon

Hier stellen wir eine Methode vor, um das embryonale Gehirn des Zebrafischs in vivo bis hin zu Larven- und Juvenilenstadien abbilden zu können. Dieses mikroinvasive Verfahren, das von elektrophysiologischen Ansätzen adaptiert wurde, bietet Zugang zu zellulären und subzellulären Details reifer Neuronen und kann mit optogenetischen und neuropharmakologischen Studien zur Charakterisierung der Gehirnfunktion und der medikamentösen Intervention kombiniert werden.

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Wir modifizierten das Marmarou-Gewichtsabfallmodell für erwachsene Zebrafische, um eine Breite von Pathologien nach stumpfer traumatischer Hirnverletzung (TBI) und die Mechanismen, die der nachfolgenden neuronalen Regeneration zugrunde liegen, zu untersuchen. Dieses stumpfe TBI-Modell ist skalierbar, induziert ein leichtes, mittelschweres oder schweres SHT und rekapituliert die bei menschlichen TBI beobachtete Verletzungsheterogenität.

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Ein mechanisches Hirnverletzungsmodell im erwachsenen Zebrafisch wird beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die ihre hohe Regenerationsfähigkeit regulieren. Die Methode erklärt, wie eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum mehrerer Arten kleiner Fische erzeugt wird, um die regenerativen Reaktionen mittels fluoreszierender Immunfärbung zu bewerten.

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

Der erwachsene Zebrafisch ist in der Lage, sich nach einer Rückenmarksverletzung funktionell zu erholen und ist ein erstklassiges Modellsystem zur Aufklärung der angeborenen Mechanismen der neuronalen Regeneration. Hier beschreiben wir Schwimmausdauer- und Schwimmverhaltensassays als funktionelle Auslesungen der Rückenmarksregeneration.

Beurteilung der Schwimmausdauer und des Schwimmverhaltens bei erwachsenen Zebrafischen

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Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Lernen Sie die Stichwundemethode zur Untersuchung von Neurogenese und Regeneration im adulten Zebrafisch-Telencephalon. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse zellulärer Reaktionen durch Immunhistochemie.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

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