Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die zelluläre Reaktion und die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die an der adulten Neurogenese und der Regeneration und Reparatur des Zentralnervensystems beteiligt sind. Beim Zebrafisch wird dies zunächst durch manuelles Erzeugen einer Verletzung durch Punktion der rechten Kopfhälfte eines erwachsenen Zebrafisches erreicht. Fünf Tage nach der Verletzung wird der Fisch dann geopfert und sein Gehirn wird präpariert und in Aros eingebettet, um ihn in ein Ome zu schneiden.

Anschließend werden die Hirnschnitte immunhistochemisch oder in C zwei Hybridisierungen mit entsprechenden Markern gefärbt. Um die Zellproliferation zu beobachten, werden Glio-, Agenesie- und Neurogenese-Ergebnisse erhalten, die eine Hochregulation des Proliferationsmarkers PCNA, des Radiogliamarkers S 100 beta und von zwei EGFP-markierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zeigen, die nach einer Stichverletzung in der ventrikulären Zone markiert wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der bestehenden Methode, die den transgenen Ansatz zur Herstellung einer gewebe- oder zelltypspezifischen Ablation berührt, ist ihre Einfachheit, Geschwindigkeit und Ursacheneffizienz, die die Produktion vieler verletzter Gehirne in kurzer Zeit ermöglicht.

Nach der Betäubung erwachsener Zebrafische werden einzelne Fische gemäß dem Textprotokoll unter einem Präpariermikroskop mit Licht von oben in einen Schlitz in einem Block aus mit Trica-getränktem Seidenpapier gelegt. Halten Sie den Fisch vorsichtig mit einer Hand fest und richten Sie ihn so aus, dass er mit einer Spritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist, von oben auf den Kopf zugreifen kann. Schieben Sie die Nadel in der anderen Hand senkrecht durch den Schädel, nicht tiefer als zwei Millimeter in den medialen Bereich einer Kopfhälfte

Nachdem Sie die Kopfverletzung eingeführt haben, setzen Sie den Fisch in frisches Fischwasser. Wenn Sie fertig sind, bringen Sie den Fisch zurück in das Wasserdurchflusssystem. Nachdem Sie die Fische für die gewünschte Zeit erholen und sie gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert haben, opfern Sie sie auf Eis und schneiden Sie mit einer scharfen Schere hinter die Kiemen, um den Kopf vom Körper zu trennen.

Inkubieren Sie die Köpfe fünf Minuten lang in einem XPBS, um Blutungen zu ermöglichen. Dann die Köpfe in 4%para Formaldehyd in PBS überführen und über Nacht bei vier Grad Celsius oder vier Stunden bei Raumtemperatur nach der Fixierung inkubieren. Verwenden Sie ein XPBS in einer Petrischale, um die Köpfe zweimal zu waschen.

Sezieren Sie dann unter einem Präpariermikroskop vorsichtig die Gehirne in PBS. Entsorgen Sie alle Gehirne ohne sichtbare Läsionen. Übertragen Sie das Gehirn in zwei Milliliter-Reaktionsröhrchen, die mit 1,5 Millilitern 100%igem Methanol gefüllt sind, und invertieren Sie die Röhrchen fünfmal, bevor Sie sie mindestens 16 Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius inkubieren.

Um das Gewebe für die Immunhistochemie zu rehydrieren, inkubieren Sie die Gehirne jeweils fünf Minuten lang in einer absteigenden Methanolreihe, bevor Sie PBS Tween 20 oder PTW verwenden, um das Gehirn fünfmal zu waschen. Jeweils fünf Minuten lang. Um das Gehirn einzubetten, verwenden Sie eine Transferpipette, um es in die Hohlräume einer Polyethylen-Formbecherschale zu legen. Lösen Sie 2%Agros in einem XPBS auf, indem Sie es in einer Mikrowelle bei 600 Watt erhitzen.

Lassen Sie das Agros vor der Verwendung drei Minuten abkühlen. Entfernen Sie dann vorsichtig das PTW von einem Gehirn, bevor Sie aros verwenden, um die Form vollständig zu füllen. Verwenden Sie die Präpariernadel, um das Gehirn im Aros zu wirbeln, um das PTW wegzuspülen und das Gehirn mit der Bauchseite nach unten, der Rückenseite nach oben und der Position gerade auszurichten, bevor Sie das Agros abkühlen lassen.

Entfernen Sie mit einer Präpariernadel den Agros-Block aus der Form. Schneiden Sie dann mit der scharfen Rasierklinge das Agros parallel zum Krallen-Cephalon am hinteren Ende des Gehirns. Schneiden Sie nun den Agros am vorderen Ende des Gehirns, bevor Sie den Block so umdrehen, dass er auf der hinteren Ebene steht.

Entfernen Sie den überschüssigen Agros, indem Sie Schnitte parallel zu den dorsalen und ventralen Seiten des Gehirns machen. Drehen Sie dann das Gehirn zurück, so dass es auf der Bauchseite liegt. Zum Schluss schneidest du den Block zu einem abgeschnittenen Dreieck ab, in dem sich das Cephalon in der kleineren Ebene befindet.

Nachdem Sie das Viom gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet haben, verwenden Sie ein XPBS, um das Pufferbad so zu füllen, dass es gerade die Unterseite der Klinge erreicht. Lege dann einen kleinen Punkt Sekundenkleber auf die Oberseite der Probenscheibe des Vibrators. Lege dann vorsichtig die Ebene des Blocks, die sich hinter dem Gehirn befindet, auf den Sekundenkleber.

Verwenden Sie den Mikrotommanipulator, um die Probenscheibe in die Pufferschale einzuführen und drehen Sie die Probenscheibe in die gewünschte Position. Ziehen Sie dann mit einem drei Millimeter Inbusschlüssel die Schraube fest und entfernen Sie den Manipulator. Positionieren Sie den Block so im Pufferbad, dass das Cephalon knapp unter der Oberfläche liegt und die dorsale Seite des Gehirns der Klinge zugewandt ist, um das Gehirn zu durchtrennen.

Bereiten Sie eine 24-Well-Platte für die Entnahme der Schnitte vor, indem Sie einen Milliliter Blockierungspuffer pro Gehirn in die Vertiefungen der Platte mit dem vibrierenden Mikrotom geben. Beginnen Sie mit dem Schneiden bei einer Dicke von 50 Mikrometern, einer Geschwindigkeit von einem Millimeter pro Sekunde und einer Frequenz von 70 Hertz. Nehmen Sie mit einer synthetischen Bürste die dünnen Aros-Scheiben auf, wenn sie sich von der Klinge lösen, und sammeln Sie sie in der 24-Well-Platte.

Zur Durchführung der Immunhistochemie blockieren Sie unspezifische Stellen für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation entfernen Sie den Puffer und fügen Sie 250 Mikroliter Antikörper hinzu, die in Blockpuffer verdünnt sind, inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius oder zwei Stunden bei Raumtemperatur, bevor Sie die Proben mit PTW dreimal für jeweils eine Minute waschen. Nach der Inkubation und Sekundärantikörpern für zwei Stunden bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Abschnitte dreimal. Verwenden Sie ein wasserlösliches, nicht fluoreszierendes Einbettmedium, um die Abschnitte zu montieren. Analysieren Sie dann die Proben unter einem Verbund- oder Konfokalmikroskop.

Bei richtiger Ausführung führt eine Wunde zu einem Läsionskanal, der sich von dorsal nach ventral durch das Palam des Tale Cephalon erstreckt und nach 35 Tagen abheilt. Es wurde zuvor mit Hilfe der Immunhistochemie gezeigt. Diese Verletzung löst eine Hochregulation von PCNA und S 100 beta und ein überlappendes Muster drei bis sieben Tage nach der Läsion aus, was auf eine Proliferation der radialen Gliazellen hinweist.

Diese Abbildung zeigt eine vorübergehende Akkumulation von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder OPCs in unmittelbarer Nähe einer Stichwunde, die bei transgenen OLIG-2-EEG-FP-Fischen induziert wurde und am Tag 35 nach der Läsion nicht mehr beobachtet wird. Wenn die Läsion nicht richtig eingeführt wird, ist der Läsionskanal nicht sichtbar. Eine Hochregulierung von PCNA und S 100 beta oder eine Akkumulation von OPCs ist nicht nachweisbar.

Wie hier vorgestellt, hat ein systemisches Expressionsscreen, das Transkriptionsregulatoren in den Gehirnen von Fischen mit Läsionen mit Wildtyp-Gehirnen vergleicht, eine Reihe von Faktoren identifiziert, die im Tele-Cephalon exprimiert werden und die als Reaktion auf Verletzungen hochreguliert werden. Die Stufenwundmethode in Kombination mit der RNA-Tiefensequenzierung und/oder der In-situ-Hybridisierung kann dazu beitragen, neue Gene zu identifizieren, die an der Neurogenese, Regeneration und Reparatur von adulten Zebrafischen beteiligt sind.