Multi-Elektroden-Array Recordings of Human Epileptische Postoperative Rindengewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnungen von ex vivo, interiktalen und anfallsähnlichen Ereignissen aus menschlichem epileptischem kortikalem Gewebe durchzuführen und so eine Möglichkeit zu bieten, die grundlegenden Mechanismen zu untersuchen, die epileptischen Aktivitäten, der Initiierung, der Ausbreitung und den Wirkungen von Antiepileptika sowohl auf zellulärer als auch auf Netzwerkebene zugrunde liegen. Dies wird erreicht, indem zunächst das menschliche kortikale Gewebe von Patienten mit pharmakoresistenter Epilepsie während der Operation sorgfältig reseziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Blutgerinnsel, Gefäße und Hirnhäute sowie die überschüssige weiße Substanz vor dem Schneiden zu entfernen.

Schneiden Sie anschließend den Gewebeblock in 400-Mikrometer-Scheiben. Der letzte Schritt besteht darin, die Scheiben unter den Grenzflächenbedingungen einer hohen Sauerstoffversorgung und kontrollierten Temperatur mit langsamer Perfusion zu halten. Letztendlich wird die Multi-Elektroden-Array-Technik verwendet, um spontane interiktale Aktivitäten und evozierte iktale Ereignisse aufzuzeichnen.

Unser Labor untersucht die Rolle neuroglialer Interaktionen in der zerebralen Physiopathologie, um zu untersuchen, wie neuronale Zellen pathologische Netzwerkaktivität beim Menschen erzeugen können. In jüngster Zeit haben wir in Zusammenarbeit mit Neck Care und Lap Petri Hospitals Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnungen von humanem epileptischem, postoperativem kortikalem Gewebe etabliert. Heute wird Ihnen Thomas Blo, Neurochirurg am Neck Care Hospital, zusammen mit Feld, Epileptologe und Forscher am Lapis Hospital, und Elena DOI, Postdoc, in meinem Labor zeigen, wie Sie solche Techniken durchführen und gut anwenden können.

Von der Entnahme von humanem epileptischem Gewebe bis hin zu MEA-Aufzeichnungen ex vivo, Die Verwendung von humaner kortikaler Gewebe-EKT zur Heilung von epileptischen Patienten ermöglicht die direkte Erforschung von funktionell erhaltenen menschlichen epileptischen Neuronen und Gliazellen, die in spezifischen Netzwerken miteinander verbunden sind. In-vitro-Untersuchungen ermöglichen den Zugang zu einzelnen Zellen und Netzwerkaktivitäten, ionenbasierten Mechanismen, die in vivo nicht vollständig berücksichtigt werden können. Die MEA-Aufzeichnung von menschlichem kortikalem Gewebe kann helfen, eine Schlüsselfrage im Bereich der Epilepsie zu beantworten, wie z. B. die zellulären Mechanismen, die der Exogenese und der Anfallsausbreitung zugrunde liegen.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die läsionale Epilepsie und ihre Therapie, da sie es ermöglicht, die Mechanismen der Pharmakoresistenz und die Wirkung des Antiepileptikums auf anfallsähnliche Ereignisse zu verstehen, die in den menschlichen kortikalen Schnitten aufgezeichnet wurden. In vitro. Der Hauptvorteil von Multi-Elektro-Arrays gegenüber bestehenden Methoden wie e-, e-, g- oder in vivo-Mikroelektroden besteht darin, dass sie die nicht-invasive, gleichzeitige Stimulation und Aufzeichnung von Feldpotentialen und Multiunit-Aktivität von mehreren Seiten des Gewebes ermöglichen.

Um den Vorgang zu beginnen, bereiten Sie die Grenzflächenkammer vor, indem Sie zuerst den unteren Teil mit destilliertem Wasser füllen. Verbinden Sie dann die Kammer mit einer Carbogen-Quelle. Schneiden Sie als Nächstes ein Stück Linsengewebe so ab, dass es in den flachen Bereich der Schnittkammer passt.

Platzieren Sie es neben dem Eingangsschlauch, damit Blasen aus der Eingangsleitung entweichen können, bevor sie die Scheiben erreichen. Schneiden Sie danach zwei Stücke Baumwollfäden mit der gleichen Länge wie das Stück Linsengewebe ab. Platzieren Sie sie an den Seiten des flachen Bereichs der Kammer und stellen Sie die Durchflussmenge der Schlauchpumpe auf einen Milliliter pro Minute ein.

Schalten Sie anschließend die Sauerstoffzufuhr für das Wasser im unteren Teil der Kammer ein. Stellen Sie dann den Temperaturregler auf 37 Grad Celsius ein. Decken Sie den oberen Teil der Grenzflächenkammer mit einem Stück Paraform ab und warten Sie mindestens 30 Minuten, bis die Temperatur ansteigt und sich stabilisiert.

Bereiten Sie nun die Sezierwerkzeuge vor, die zwei feine Pinzetten, einen Spatel, einen kleinen Löffel und eine Klinge, zwei Petrischalen aus Glas, zwei Bürsten und den Cyanacrylatkleber enthalten. Bereiten Sie als Nächstes das Vibrato vor, indem Sie die Parameter für das Slicen einstellen. Bei diesem Verfahren wird das vorbereitete A CSF auf Saccharosebasis aus dem minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank genommen und zu Matsch zerkleinert.

Mit Carbogen mit Sauerstoff versorgen. Füllen Sie dann 250 Milliliter des A-Liquor-Matsches in eine Glasflasche um und bewahren Sie ihn in einer mit Eis gefüllten Macherflasche für die Gewebeentnahme im Operationssaal auf. Unter Standard-Vollnarkose ist ein Neuronavigationssystem zu verwenden, um eine genaue Lokalisierung der Hirnrinde zu ermöglichen.

Machen Sie danach einen Schnitt in der Haut, dann schaffen Sie ein Bohrloch im Knochen, gefolgt von einer Kraniotomie. Als nächstes hebst du den Knochenlappen vorsichtig an und öffnest die Dura mit einer Schere. Führen Sie anschließend eine Blockresektion der epileptischen Rinde durch und vermeiden Sie eine ausgedehnte Gerinnung.

Schneiden Sie einen einen Zentimeter dicken kortikalen Block ab und legen Sie ihn in den gefrorenen sauerstoffhaltigen Saccharose-basierten A CSF. Übertragen Sie anschließend das Gewebe in gefrorenen Saccharose-basierten A-Liquor so schnell wie möglich ins Labor, aber ohne mechanische Stöße. Füllen Sie nun eine Petrischale und die Vibrato-Pufferschale mit dem sauerstoffhaltigen A CSF-Slush auf Saccharosebasis und setzen Sie die Sauerstoffanreicherung des A CSF-Slushs mit Carbogen fort.

Nehmen Sie dann das Taschentuch vorsichtig mit einem Löffel aus der Flasche und legen Sie es in die Petrischale. Entfernen Sie mit der Pinzette vorsichtig die Blutgerinnsel, Gefäße und Hirnhäute, um Resistenzen beim Schneiden zu vermeiden. Schneiden Sie die Seite des Gewebes mit einer Klinge ab, um eine ebene Oberfläche zu erhalten, die so parallel wie möglich zur gegenüberliegenden Seite des Gewebes verläuft.

Kleben Sie dann das Gewebe auf die Vibrato-Probenplatte, um quer verlaufende kortikale Schnitte vorzubereiten. Legen Sie es anschließend in die Pufferschale und schneiden Sie 400 Mikrometer dicke Scheiben bei niedriger Geschwindigkeit. Schneiden Sie anschließend mit einem Spachtel und einer Bürste einige Stücke Linsentuch ab.

Übertragen Sie diese Scheiben Linsengewebe in die Grenzflächenkammer. Inkubieren Sie sie mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie sie aufnehmen. Schließen Sie bei diesem Verfahren das Perfusionssystem an eine Peristaltikpumpe und das MEA-System an einen Computer an.

Platzieren Sie dann einen leeren MEA-Chip in den Verstärker. Stellen Sie anschließend den Temperaturregler für die Erwärmung des Kanülenelements in der MEA-Kammer auf 37 Grad Celsius ein. Beginnen Sie die Perfusion des sauerstoffhaltigen A-Liquors bei fünf bis sechs Millilitern pro Minute.

Öffnen Sie danach die Aufnahmesoftware. Stellen Sie sicher, dass alle MEA-Elektroden gut angeschlossen sind und dass durch die Perfusion keine Geräusche entstehen. Gießen Sie nun etwas erwärmtes Aufnahme-A CSF in eine gläserne Petrischale.

Übertragen Sie eine Scheibe aus der Grenzflächenkammer in die Petrischale, indem Sie das Linsengewebe greifen. Löse dann die Scheibe vorsichtig vom Gewebe, indem du sie in die Lösung tauchst, oder verwende eine kleine Bürste, um das Ablösen zu erleichtern. Füllen Sie als Nächstes den MEA-Chip mit etwas A CSF.

Übertragen Sie die Scheibe mit einem Spatel und einer Kunststoffpipette auf den MEA-Chip. Entfernen Sie die Lösung vorsichtig, damit die Scheibe an der Elektrodenfläche haftet, und halten Sie sie mit einem Platinanker an Ort und Stelle. Geben Sie danach einen Milliliter Liquor auf den MEA-Chip und legen Sie ihn in den Verstärker.

Starten Sie dann die Perfusion bei fünf bis sechs Millilitern pro Minute. Überprüfen Sie als Nächstes die Slice-Position im MEA-Aufnahmebereich. Passen Sie die MEA-Monitorsoftware bei Bedarf an.

Um von den kortikalen Schichten aufzunehmen und ein Bild aufzunehmen, starten Sie die Aufnahme. Dies ist eine repräsentative Spur der menschlichen kortikalen Schnittaktivität, die von einer MEA-Elektrode aufgezeichnet wird. Bei normalem A-Liquor ist es möglich, 15 Minuten nach der Perfusion mit magnesiumfreiem sechs millimolaren Kalium-A-Liquor eine interiktale Spontanaktivität zu beobachten.

Der erste Anfall tritt auf, gefolgt von weiteren Ereignissen im Abstand von zwei bis drei Minuten. Die blaue Spur zeigt die vergrößerte Aktivität. Dieses Panel zeigt den Hochpass der Daten, gefiltert bei 250 Hertz, was beim Heranzoomen eine Multi-Unit-Aktivität zeigt. Hier ist eine repräsentative Aufzeichnung eines Anfalls von allen MEA-Elektroden in magnesiumfrei.

Sechs millimolare Kalium A CSF. Jedes Quadrat repräsentiert eine Elektrode von 12 x 12 MEA-Arrays und zeigt ein 82. Zeitfenster. Die gepunktete Linie zeigt die Position der kortikalen Oberfläche relativ zum MEA-Array an.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie menschliches kortikales Gewebe sicher transportieren, lebensfähige Cortico-Psoriasis vorbereiten und lagern und MEA-Aufzeichnungen von spontanen und induzierten epileptischen Aktivitäten durchführen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine enge Zusammenarbeit zwischen dem klinischen Team im Krankenhaus und den Forschern im Labor zu haben. Vergessen Sie nie, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe gefährlich sein kann, und es sollten immer Schutzmaßnahmen ergriffen werden, z. B. das Tragen von Handschuhen, um mögliche Infektionskrankheiten zu vermeiden. Andere Techniken wie Fluoreszenzbildgebung, Patch-Lampe, Aufzeichnung, Spike-Sortierung und histologische Analyse können mit EM-EA-Aufzeichnungen gekoppelt werden, um synaptische Eigenschaften, Einzelzellverhalten, Ionendynamik sowie zelluläre und molekulare Anomalien mit Populationsaktivitäten zu korrelieren.

Die Durchführung von MEA-Aufzeichnungen von humanem epileptischem Gewebe kann Forschern den Weg zur Erforschung läsionaler Epilepsien ebnen, um die Mechanismen zu klären, die der Exogenese und Pharmakoresistenz zugrunde liegen, sowie die Rolle der neuroglialen Interaktion bei diesem Phänomen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.