Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Osteoklasten in großer Zahl aus dem Knochenmark der Maus zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Knochen von euthanasierten Mäusen entnommen werden. Anschließend werden die Zellen aus dem Knochenmark befreit, indem die Knochen mit einem Mörser und Stößel in Faktenpuffer zerkleinert werden.

Dann wird die Knochenmarklösung auf das Zelltrennmedium mit Dichtegradient geschichtet und eine Zelltrennung mit Dichtegradient durchgeführt. Schließlich wird die Schicht, die die interessierenden Zellen enthält, aspiriert und die Zellen werden in ein Knochenmark-Mikrophagen-Induktionsmedium gelegt. Letztendlich wird die Fallenfärbung verwendet, um das Vorhandensein einer großen Anzahl von Osteoklasten nachzuweisen.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf Krankheiten, die mit einer veränderten Osteoklastenfunktion verbunden sind, deren Schweregrad von tödlichen Neugeborenenerkrankungen aufgrund des Versagens der Bildung eines Knochenmarkraums für die Hämatopoese bis hin zu häufigeren Pathologien wie Osteoporose reichen kann, da sie eine zuverlässige Methode zur Isolierung einer großen Anzahl von Osteoklasten aus dem Knochenmark von Mäusen darstellt. Bringen Sie zunächst 10 Milliliter handelsübliche Zelltrennung mit Dichtegradiententrennung bei mittlerer bis Raumtemperatur in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Platzieren Sie ein Aliquot von 50 Millilitern Faxpuffer bei Raumtemperatur, um es mit dem Zelltrennmedium mit Dichtegradient zu verwenden.

Nach der Vorbereitung des zusätzlichen Mediums und der Einschläferung einer C 57 black six Maus gemäß dem Textprotokoll positionieren Sie die Maus auf ein Sezierbrett und verwenden Sie 70% Ethanol. Um es zu besprühen, ernten Sie die Fera Tibia, Brummauge und Wirbelsäule. Legen Sie dann die Knochen in Faktenpuffer auf Eis.

Entfernen Sie anschließend mit sauberem Seidenpapier die Muskeln und das Weichgewebe von den Knochen. Legen Sie die Knochen in einen Mörser und stoßen Sie sie mit drei Millilitern Faktenpuffer auf und zerkleinern Sie sie vorsichtig. Saugen Sie dann die blutbefleckte Flüssigkeit ab und leiten Sie sie durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie weitere fünf Milliliter Effektpuffer in den zerkleinerten Knochen und zerkleinern Sie ihn weiter, bevor Sie die Flüssigkeit durch das Sieb in das 50-Milliliter-Röhrchen überführen. Fahren Sie mit diesem Vorgang fort, bis die Flüssigkeit nicht mehr rot färbt, bevor Sie das Knochenmark fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 200 g pelletieren. Um eine Gradiententrennung durchzuführen, saugen Sie die Überstände aus dem Zellpellet an und verwenden Sie 10 Milliliter Faxpuffer zur Wiederbelebung.

Hängen Sie das Pellet auf, kippen Sie das konische Röhrchen mit dem Zelltrennmedium mit Dichtegradienten bei Raumtemperatur auf etwa 30 Grad und halten Sie mit einer elektrischen Pipette die Spitze der Pipette gegen die innere obere Oberfläche des Röhrchens. Schichten Sie die Knochenmarklösung langsam mit einer Zentrifuge bei Raumtemperatur ohne Beschleunigung oder Verzögerung auf das Medium. Drehen Sie den Farbverlauf 15 Minuten lang bei 200 gs.

Aspirieren Sie dann die trübe mittlere Schicht, die die interessierenden Zellen enthält, und übertragen Sie sie in eine neue konische Röhre. Fügen Sie 20 Milliliter eiskalten Faxpuffer hinzu, um die Zellen zu waschen. Verwenden Sie dann einen Milliliter Knochenmark-Mikrophagen-Stimulationsmedium, um das endgültige Zellpellet nach der Zellzählung zu resuspendieren.

Geben Sie zwei Milliliter Mikrophagen-stimulierendes Medium in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Fügen Sie dann 200.000 Zellen zu jeder Vertiefung hinzu, eine Zelldichte, die eine angemessene In-vitro-Osteoklastenkultivierung gewährleistet. Rühren Sie die Platte vorsichtig und inkubieren Sie sie drei Tage lang bei 37 Grad Celsius, ohne das Medium zu wechseln.

Wechseln Sie nach dem dritten Tag das Medium auf das Knochenmark-Osteoklasten-Induktionsmedium und beginnen Sie, es fünf bis sieben Tage lang täglich zu wechseln. Zu diesem Zeitpunkt sollten große mehrkernige Osteoklasten sichtbar sein. Siehe das Textprotokoll für die Färbung und den Resorptionsassay, wie hier zu sehen.

Eine hohe Anzahl von Osteoklasten kann mit dem Tartrat-resistenten Assay bestätigt werden. Phosphotate, die Osteoklasten färben, werden unter Verwendung des in diesem Video gezeigten Protokolls als große violette Zellen mit mehreren Kernen visualisiert. Es ist üblich, Osteoklasten mit bis zu 30 Kernen pro Zelle zu isolieren.

Die Verwendung einer mineralisierten Oberfläche gilt als Goldstandardmethode zur Beurteilung der resorptiven Aktivität von Osteoklasten in vitro. In dieser Abbildung zeigt die Hellfeldmikroskopie bei 10-facher Vergrößerung einen Prozentsatz der mineralisierten Oberflächen- oder Resorptionsgruben, die wie schwarz umrandet gebildet sind, was die Bestimmung der Resorptionskapazität von Osteoklasten ermöglicht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine große Anzahl von Osteoklasten zuverlässig aus dem Knochenmark der Maus isolieren können.