Nahes Infrarot (NIR) Licht Erhöht Ausdruck einer Markierung der Funktion der Mitochondrien im Maus Vestibular Sinnesepithel

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die potenzielle neuroprotektive Wirkung von Nahinfrarotlicht auf das vestibuläre sensorische Epithel von Mäusen zu untersuchen. Dies wird durch eine einfache, kurzfristige transkranielle Applikation von Nahinfrarotlicht an die Mäuse in verschiedenen Entwicklungsstadien erreicht. In einem zweiten Schritt werden die knöchernen Labyrinthe der behandelten Tiere präpariert, wodurch das vestibuläre sensorische Epithel isoliert werden kann.

Als nächstes wird die Expression des interessierenden Antioxidativ-Gens mit R-T-P-C-R gemessen, um die Auswirkungen der Behandlung auf die mitochondriale Leistung zu bewerten. Schließlich wird eine Densitometrie durchgeführt, um die Wirkung einer kurzen Behandlung mit Nahinfrarotlicht auf die Expression spezifischer antioxidativer Gene bei Mäusen zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Nahinfrarot-Behandlungstechnik besteht darin, dass sie einfach und nicht-invasiv ist und eine weitere nachgelagerte physiologische, molekulare und Verhaltensanalyse nach der Behandlung ermöglicht.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die potenzielle Neuroprotektion des peripheren vestibulären Systems während des normalen Alterns oder auf die Verbesserung der ausgeglichenen Leistung nach vestibulären Erkrankungen oder Defiziten. Rasieren Sie zwei bis drei Tage vor Beginn des Versuchs das Fell im Kopf- und Halsbereich jeder Maus so genau wie möglich, um ein Nachwachsen der Tierhaare vor Abschluss des Behandlungsschemas zu verhindern. Um den Status der Erregerfreiheit der Tiere zu erhalten, reinigen Sie die Instrumente zwischen jeder Rasur mit 70% Ethanol.

Sie dann am Tag der Behandlung für jeden Praktikanten die Maus am proximalen Ende des Schwanzes auf und lassen Sie sie in einer Handfläche entspannen, um den Stress für die im Nahinfrarot behandelten Tiere zu minimieren. Halten Sie für jedes Tier ein 670-Nanometer-LED-Gerät ein bis zwei Zentimeter von der rasierten Stelle entfernt und schalten Sie das Gerät 90 Sekunden lang ein. Wiederholen Sie den Behandlungsvorgang für die Scheingruppe auf die gleiche Weise, aber behandeln Sie die Tiere bei ausgeschaltetem Gerät für die Nahinfrarot-blockierte Gruppe auf die gleiche Weise wie die mit Nahinfrarot-Behandelte Gruppe, jedoch mit dem Gerät mit Aluminiumfolie abgedeckt.

Nachdem Sie die Behandlungen für jede Gruppe an fünf aufeinanderfolgenden Tagen im Abstand von 24 Stunden wiederholt haben, frieren Sie frisch zubereitete, auf Glycerin basierende künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit oder einen Liquor in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius für 45 Minuten ein, bis sich eine Eisaufschlämmung bildet. Nächster. Verwenden Sie für jede Maus eine abgerundete Rasierklinge mit der Nummer 22, um einen Schnitt entlang der sagittalen Haut des Schädels zu machen, wobei Sie das Gehirn des Schädelgewölbes und den darunter liegenden vestibulären Apparat so kühl wie möglich halten, indem Sie regelmäßig eiskaltes A CSF auf das Gewebe auftragen. Verwenden Sie dann den spitzen Arm einer Schere mit Standardmuster, um einen kleinen Schnitt in den Schädel bei Lambda zu machen und entlang der sagittalen Naht zu schneiden.

Schieben Sie dann vorsichtig einen Arm eines flachen URS unter den Scheitelknochen und sichern und ziehen Sie dann den Scheitelknochen seitlich und den Hinterhauptknochen nach hinten, bis das Gehirn freigelegt ist. Verwenden Sie dann einen kleinen Spatel aus rostfreiem Stahl, um das Gehirn von der vorderen und mittleren Schädelgrube wegzuheben. Um den vestibulären Cochlea-Nerv freizulegen, durchtrennen Sie den Nerv, um unnötige Spannungen auf die primären afferenten Axone zu vermeiden, die die vestibulären Haarzellen direkt innervieren.

Entfernen Sie dann das Gehirn in toto und beobachten Sie das knöcherne Labyrinth, in dem sich die Cochlea und die peripheren vestibulären Organe in der mittleren Schädelgrube befinden. Machen Sie nun zwei kleine Schnitte neben jedem knöchernen Labyrinth und halten und ziehen Sie den vorderen halbkreisförmigen Kanal seitlich, um die gesamte Struktur herauszuschneiden. Tauchen Sie dann das ausgeschnittene Labyrinth sofort in eine Präparierschale, in der sich die eiskalte A CSF-Lösung befindet, während Sie kontinuierlich mit Carbogen durchbluten.

Der schwierigste Teil dieses Verfahrens besteht darin, für jedes Tier gleichbleibende Mengen an lebensfähigem Gewebe zu erhalten. Wir empfehlen, das Gewebe sorgfältig zu beobachten und spezifisch zu beleuchten. Halten Sie dann unter einem Stereomikroskop das Labyrinth an der Cochlea fest und befestigen Sie das Gewebe mit einer Pinzette mit einer geraden feinen Pinzette am Boden der Schale. Kratzen Sie eine kleine Öffnung in den Knochen über der vorderen halbkreisförmigen Ula.

Greifen Sie dann direkt unter den Knochen und schnippen Sie vom ULA weg nach außen, um die Öffnung vorsichtig zu vergrößern. Fahren Sie auf diese Weise fort, bis der Utriculus und der vordere und laterale Pulus freigelegt sind. Heben Sie dann mit einer feinen Pinzette den Utriculus und den Pule vorsichtig vom knöchernen Labyrinth weg, bis sie sich vollständig gelöst haben.

Fassen Sie zum Schluss die vestibulären Organe sicher zwischen der Pinzettenspitze und legen Sie sie in die frisch vorbereitete Lyse. Puffer in ein Mikroröhrchen mit Schraubverschluss geben und die Pinzette vorsichtig im Puffer schwenken, um die vestibulären Organe zu lösen. Nachdem Sie unter dem Stereomikroskop bestätigt haben, dass die Pinzette frei von Gewebe ist, schrauben Sie den Mikrotubuli-Deckel auf und frieren Sie die Probe sofort in flüssigem Stickstoff ein, um die Auswirkungen der Nahinfrarotbehandlung zwischen jungen und älteren Mäusen zu vergleichen.

Boten-RNA wurde umgekehrt in komplementäre DNA transkribiert, dann wurde die Expression von antioxidativer Superoxiddismutase eins oder SOD eins analysiert, gemessen durch Densitometrie. Es wurde ein signifikanter Anstieg der Beta-Aktin-normalisierten SOD-Eins-Expression von mehr als dem Doppelten bei jungen, im Nahinfrarot-behandelten Tieren im Vergleich zu jungen, scheinbehandelten Tieren und jungen nahinfrarotblockierten Tieren beobachtet. Ältere Tiere, die im Nahinfrarotbereich behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu älteren Tieren, die im Nahinfrarotbereich blockiert waren, auch eine mehr als zweifache Hochregulierung der Grasnarbe. Im Anschluss an dieses Verfahren können verhaltensbezogene, molekulare oder physiologische Experimente durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. ob Nahinfrarotlicht die Expression anderer Gene oder Proteine im vestibulären sensorischen Epithel erhöht.

Oder verbessert Nahinfrarotlicht die Gesamtgleichgewichtsleistung der behandelten Mäuse?