Nahes Infrarot (NIR) Licht Erhöht Ausdruck einer Markierung der Funktion der Mitochondrien im Maus Vestibular Sinnesepithel

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die potenzielle neuroprotektive Wirkung von nahinfrarotem Licht auf das vestibuläre Sinnesepithel der Maus zu untersuchen. Dies wird durch eine einfache, kurzfristige transkranielle Anwendung von nahinfrarotem Licht an Mäusen in verschiedenen Entwicklungsstadien erreicht. In einem zweiten Schritt werden die knöchernen Labyrinthe der behandelten Tiere präpariert, um das vestibuläre Sinnesepithel zu isolieren.

Anschließend wird die Expression des antioxidativen Gens der Wahl mittels R-T-P-C-R gemessen, um die Wirkung der Behandlung auf die mitochondriale Leistungsfähigkeit zu beurteilen. Abschließend erfolgt eine Densitometrie, um den Effekt einer kurzen Nahinfrarotlichtbehandlung auf die Expression spezifischer antioxidativer Gene bei Mäusen zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Nahinfrarotbehandlungstechnik liegt darin, dass sie einfach und nichtinvasiv ist und somit weitere nachgeschaltete physiologische, molekulare und verhaltensbezogene Analysen nach der Behandlung ermöglicht.

Die Implikationen dieser Technik reichen von einem möglichen neuroprotektiven Effekt auf das periphere vestibuläre System während des normalen Alterns bis hin zur Verbesserung der Gleichgewichtsleistung nach einer vestibulären Erkrankung oder Schädigung. Zwei bis drei Tage vor Beginn des Experiments sollte das Fell im Kopf- und Nackenbereich jeder Maus so kurz wie möglich abrasiert werden, um ein Nachwachsen der Haare vor Abschluss des Behandlungsprotokolls zu verhindern. Um den keimfreien Status der Tiere aufrechtzuerhalten, müssen die Instrumente zwischen den einzelnen Rasierungen mit 70 %igem Ethanol gereinigt werden.

Dann am Tag der Behandlung für jedes Versuchstier heben Sie die Maus am proximalen Ende des Schwanzes auf und lassen Sie sie sich in der Handfläche einer Hand entspannen, um den Stress für die mit Nahinfrarot behandelten Tiere zu minimieren. Für jedes Tier halten Sie ein 670 Nanometer LED-Gerät ein bis zwei Zentimeter von der rasierten Stelle entfernt und schalten das Gerät 90 Sekunden lang ein. Für die Scheinbehandlungsgruppe wiederholen Sie den Behandlungsablauf auf dieselbe Weise, jedoch mit ausgeschaltetem Gerät. Für die Gruppe mit blockiertem Nahinfrarot behandeln Sie die Tiere genauso wie die mit Nahinfrarot behandelte Gruppe, jedoch mit dem Gerät, das mit Aluminiumfolie abgedeckt ist.

Nachdem die Behandlungen für jede Gruppe an fünf aufeinanderfolgenden Tagen in Abständen von 24 Stunden wiederholt wurden, frisch zubereitete, auf Glycerin basierende künstliche zerebrospinale Flüssigkeit oder A CSF im Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius 45 Minuten lang einfrieren, bis sich ein Eisschlamm bildet. Als Nächstes für jedes Mausexemplar mit einer abgerundeten Rasierklinge Nummer 22 einen Schnitt entlang der sagittalen Haut des Schädels durchführen, wobei die Schädelkalotte, das Gehirn und der darunterliegende Vestibularapparat durch regelmäßige Zugabe eiskalter A CSF über das Gewebe so kühl wie möglich gehalten werden. Danach mit dem spitzen Arm eines Paars Standardschere eine kleine Öffnung im Schädel am Lambda anlegen und entlang der sagittalen Naht schneiden.

Danach schieben Sie vorsichtig einen Arm eines flachen URS unter den Scheitelbein und fixieren Sie das Scheitelbein, ziehen es seitlich und das Hinterhauptbein nach posterior, bis das Gehirn freigelegt ist. Verwenden Sie anschließend einen kleinen Spatel aus rostfreiem Stahl, um das Gehirn von der vorderen und mittleren Schädelgrube abzuheben. Um den Nervus vestibulocochlearis freizulegen, durchtrennen Sie den Nerv, um unnötige Zugspannung auf die primären afferenten Axone zu vermeiden, die direkt die Haarzellen des Vestibularorgans innervieren.

Entfernen Sie dann das Gehirn vollständig und betrachten Sie das knöcherne Labyrinth, das die Cochlea und die peripheren vestibulären Organe in der Schädelgrube enthält. Führen Sie nun zwei kleine Einschnitte neben jedem knöchernen Labyrinth durch und halten und ziehen Sie den vorderen Bogengang lateral, um die gesamte Struktur zu entfernen. Tauchen Sie das entfernte Labyrinth anschließend unverzüglich in eine Petrischale mit eiskalter A-CSF-Lösung ein, während es kontinuierlich mit Carbogen perfundiert wird.

Der schwierigste Teil dieses Verfahrens besteht darin, für jedes Tier konsistente Mengen an lebensfähigem Gewebe zu gewinnen; wir empfehlen daher sorgfältige Beobachtung und eine gezielte Beleuchtung des Gewebes. Halten Sie danach unter einem Stereomikroskop das Labyrinth am Schnecke fest und befestigen Sie das Gewebe mit einer geraden feinen Pinzette am Boden der Schale. Kratzen Sie eine kleine Öffnung in den Knochen oberhalb des vorderen Bogengangs.

Danach sofort unterhalb des Knochens greifen und vorsichtig nach außen schnipsen, weg von der ULA, um die Öffnung sanft zu vergrößern. Auf diese Weise fortfahren, bis das Utrikel sowie der vordere und seitliche Pule vollständig freigelegt sind. Anschließend feine Pinzette verwenden, um Utrikel und Pule vorsichtig vom knöchernen Labyrinth anzuheben, bis sie vollständig gelöst sind.

Schließlich die Vestibularorgane sicher mit der Spitze der Pinzette greifen und sie in frisch zubereitete Lysepufferlösung in einem verschraubbaren Mikroröhrchen platzieren; die Pinzette vorsichtig in dem Puffer bewegen, um die Vestibularorgane zu lösen. Danach unter dem Stereomikroskop bestätigen, dass keine Gewebestücke mehr an der Pinzette haften, das Mikroröhrchen verschließen und die Probe unverzüglich in flüssigem Stickstoff einfrieren, um die Wirkung der Nahinfrarotbehandlung zwischen jungen und älteren Mäusen vergleichen zu können.

Messenger-RNA wurde in komplementäre DNA revers transkribiert, anschließend wurde die Expression der antioxidativen Superoxiddismutase 1 (SOD 1) mittels Densitometrie analysiert. Im Vergleich zu jungen Placebo-behandelten Tieren und jungen Tieren mit blockiertem Nahinfrarotlicht zeigte sich bei jungen, mit Nahinfrarotlicht behandelten Tieren eine signifikante, um mehr als das Zweifache erhöhte, auf Beta-Aktin normalisierte SOD-1-Expression. Auch ältere, mit Nahinfrarotlicht behandelte Tiere wiesen im Vergleich zu älteren Tieren mit blockiertem Nahinfrarotlicht eine mehr als zweifache Hochregulierung von SOD 1 auf. Nach diesem Verfahren können Verhaltens-, molekulare oder physiologische Experimente durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob Nahinfrarotlicht die Expression weiterer Gene oder Proteine im vestibulären Sinnesepithel erhöht.

Oder verbessert nahinfrarotes Licht die allgemeine Gleichgewichtsleistung der behandelten Mäuse?