Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern
September 29th, 2017
Dieses Protokoll verwendet dreidimensionale (3D) Bildgebung und Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Die Techniken sind anwendbar auf andere Situationen, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um eine Teilmenge der Daten aus einem anderen Fluoreszenzsignal zu isolieren.
Das übergeordnete Ziel dieser Bildgebungs- und Analysetechnik ist es, bestimmte Informationen aus einem komplexen Signal zu isolieren. Insbesondere beschreibt dieses Protokoll, wie nervenspezifische Mitochondrien mit anderen Mitochondrien innerhalb der Epidermis sichtbar gemacht und quantifiziert werden können. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neurologie zu beantworten, z. B. wie sich die Mitochondrien in den intraepidermalen Nervenfasern gesunder Personen im Vergleich zu den nervenspezifischen Mitochondrien von Patienten mit neurologischen Komplikationen verhalten.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir ein komplexes Signal nehmen und daraus spezifische Informationen extrahieren. Dieses Protokoll hilft uns, ein bestimmtes Signal, wie z. B. das Signal in diesen Strohhalmen, von den Signalen um sie herum zu isolieren. Bereiten Sie sich auf die immunhistochemische Fluoreszenzfärbung von Hautbiopsien vor, indem Sie zunächst eine 96-Well-Platte gemäß diesem Schema markieren.
Pipettieren Sie dann 150 Mikroliter Stammsignalverstärkerlösung, um die unspezifische Bindung von Sekundärantikörpern in jede Vertiefung der oberen Reihe zu reduzieren. Bereiten Sie Spülwells vor, indem Sie 150 Mikroliter 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung in jede Vertiefung in den Reihen zwei und drei der 96-Well-Platte geben. Geben Sie dann 150 Mikroliter 5%ige BSA-Blockierungslösung in die Vertiefungen von Reihe vier.
Die Primärantikörper PGP9,5 und PDH in 1.500 Mikrolitern 1%iger BSA-Spüllösung verdünnen und 150 Mikroliter in jede Vertiefung in Reihe fünf geben. Verwenden Sie eine Impfschleife, um die Abschnitte in die Signalverstärkerlösung in Reihe eins zu übertragen. Sobald sich die Schnitte in der primären Antikörperlösung in Reihe fünf befinden, wickeln Sie die Platte fest mit Laborfolie ein, um eine Verdunstung zu verhindern, und rühren Sie die Proben dann eine Stunde lang auf einer flachen Wippe bei Raumtemperatur um.
Inkubieren Sie mit Schaukeln über Nacht bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie den zweiten Tag des Eingriffs, indem Sie 150 Mikroliter 1%ige BSA-Spüllösung in die Vertiefungen in den Reihen sechs, sieben und acht der 96-Well-Platte pipettieren. Geben Sie die Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper zu 1.500 Mikrolitern 1%BSA.
Pipettieren Sie dann 150 Mikroliter der Sekundärantikörperlösung in jede Vertiefung der neunten Reihe. Spülen Sie die Abschnitte, indem Sie durch die Vertiefungen sechs, sieben und acht gehen. Sobald sich die Abschnitte in der sekundären Antikörperlösung in Reihe neun befinden, wickeln Sie die Platte in Parafilm ein und decken Sie sie mit Aluminiumfolie ab, um die Fluoreszenzsignale zu schützen.
Inkubieren Sie wie bisher mit Schaukeln. Pipettieren Sie am dritten Tag 150 Mikroliter steril filtriertes 1x PBS in die Reihen 10, 11 und 12. Übertragen Sie die Proben in Reihe 10 und decken Sie die Platte mit Alufolie ab.
Eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schaukeln spülen. Bereiten Sie als Nächstes einen Objektträger für die Montage der Schnitte vor, indem Sie 50 Mikroliter gefiltertes 1x PBS auf den Objektträger pipettieren. Sobald die Spülungen abgeschlossen sind, übertragen Sie einen Abschnitt aus Reihe 12 auf den Objektträger und fügen Sie dann ein bis zwei Tropfen DAPI-haltiges Einbettreagenz direkt auf den Schnitt hinzu.
Legen Sie vorsichtig ein 50 Millimeter x 24 Millimeter großes 1,5-Zoll-Mikroskopglasdeckglas über den Schnitt. Legen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln, um das Einbettmedium auszuhärten, bevor Sie die Objektträger lagern oder abbilden. Wählen Sie das 40X-Öl-Immersionsobjektiv an einem konfokalen inversen Laser-Scanning-Mikroskop.
Wählen Sie die geeigneten Laser und Detektoren aus, um die Zellkerne, Nervenfasern und Mitochondrien abzubilden. Geben Sie die folgenden Scanparameter in die Mikroskopsoftware ein: 12-Bit-Intensitätsauflösung, Scanrate von 500 Hertz mit Zwei-Frame-Mittelung und Zoom von 2,2. Stellen Sie die Mikroskopsoftware auf eine optimierte laterale Auflösung ein, indem Sie eine Scanauflösung von 1024 x 1024 auswählen.
Optimieren Sie die axiale Auflösung und die optische Schnittbildung, indem Sie eine konfokale Apertur von einer Lufteinheit mit einer Z-Schrittgröße von 210 Nanometern auswählen. Scannen Sie jedes Signal separat und passen Sie die Detektorspannung und den Offset an, um über- und untersättigte Pixel zu entfernen. Aktivieren Sie einen Live-Scan für das Nervensignal und passen Sie den Z-Fokusregler an, um die obere und untere Fokusebene in der Mikroskopsoftware zu finden und einzustellen, die das Nervensignal innerhalb des Gewebeschnitts umfasst.
Scannen Sie die endgültige Z-Serie mit sequenziellem Scannen, um das Übersprechen von Fluoreszenzsignalen zu vermeiden. Isolieren Sie die Epidermis vom Stratum corneum und der Dermis, indem Sie mit einem Auswahlwerkzeug einen Bereich um die Epidermis auf ein dupliziertes Bild des Originalbildes zeichnen. Schneiden Sie dann das Bild auf die Auswahl zu.
Berechnen Sie die Punktspreizungsfunktionen für die konfokalen grünen und roten Fluoreszenzsignale mit der Funktion zur Berechnung der Streuungsfunktion. Stellen Sie dann die Parameter für den mittleren Brechungsindex für Öl auf 1,515 und die numerische Apertur für das 40-fache Ölobjektiv auf 1,25 ein. Stellen Sie die Lochblende des Detektors auf eine Lufteinheit ein und wählen Sie eine Wellenlänge der Laseranregung.
Verwenden Sie eine iterative Wiederherstellung mit einem Konfidenzwert von 100 %, einem Iterationslimit von 10 Zyklen und den grünen und roten PSFs für die Dekonvulation der grünen und roten Fluoreszenzsignale. Verwenden Sie das Werkzeug Oberfläche erstellen, um eine Oberfläche um die entfalteten Nervensignale zu erstellen, indem Sie die Option "Glattes Merkmal deaktivieren", "Absolute Intensität für den Schwellenwert", einen unteren Schwellenwert von 3.000 und einen oberen Schwellenwert von 65.535 auswählen. Halten Sie die Oberflächen über 10 Voxel.
Entfernen Sie die Nicht-Nerven-Oberflächen, indem Sie die Registerkarte Bearbeiten in der Nervenoberfläche verwenden, um einzelne Nicht-Nerven-Oberflächen auszuwählen, oder halten Sie die Strg-Taste gedrückt, um mehrere Nicht-Nerven-Oberflächen auszuwählen. Löschen Sie die ausgewählten nichtnervengebundenen Oberflächen, indem Sie die Entf-Taste drücken. Verwenden Sie die Registerkarte "Bearbeiten" in der Nervenoberfläche und drücken Sie die Schaltfläche "Alle maskieren" in den Maskeneigenschaften.
Wählen Sie im neuen Fenster Kanal fünf entfaltete Mitochondrien unter der Kanalauswahl aus und aktivieren Sie dann den doppelten Kanal, bevor Sie die Maske anwenden. Drücken Sie das Optionsfeld für konstantes Innen/Außen und überprüfen Sie die eingestellte Voxel-Außenfläche auf 0,0 und drücken Sie die OK-Taste. Erstellen Sie abschließend mitochondrienspezifische Oberflächen mit dem Werkzeug Oberfläche erstellen, um eine Oberfläche um die maskierten entfalteten mitochondrialen Signale zu erstellen, indem Sie die Option "Glatte Funktion deaktivieren" auswählen und die Hintergrundsubtraktion für die Schwellenwertbestimmung verwenden.
Stellen Sie den Durchmesser der größten Kugel auf 1,50 Mikrometer, den unteren Schwellenwert auf 2.000 und den oberen Schwellenwert auf maximal 65.535 ein. Achten Sie darauf, die Oberflächen über 1,0 Voxel zu halten. Dieses repräsentative konfokale 3D-Mikroskopiebild veranschaulicht das nervenspezifische grüne Fluoreszenzsignal.
Für das Nervensignal wird eine in Cyan dargestellte 3D-Oberfläche erstellt. Dann wird das nervenspezifische mitochondriale Signal von den restlichen epidermalen mitochondrialen Signalen isoliert, indem die Nervenoberfläche als Maskierungswerkzeug verwendet wird. Das resultierende nervenspezifische mitochondriale rote Fluoreszenzsignal wird verwendet, um magenta dargestellte Oberflächen um die Mitochondrien innerhalb der Nervenoberfläche zu erzeugen, die in Cyan dargestellt ist.
Dadurch können die Mitochondrien in den Nervenfasern im Detail gesehen werden. Hier werden die Daten der mitochondrialen Oberfläche als Größenfrequenz-Histogramm dargestellt, um den Prozentsatz der Mitochondrien zu visualisieren, die in jeder der verschiedenen Biegungen entsprechend ihrem Volumen vorhanden sind. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, das Gewebe während des Färbeprozesses zu pflegen, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig in die Lösungen eingetaucht ist, um eine gleichmäßige und gleichmäßige Färbung in allen Schnitten zu gewährleisten.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mitochondrien in menschlichen intraepidermalen Nervenfasern visualisiert und quantifiziert. Unser detailliertes Protokoll wurde entwickelt, um anderen Forschern beizubringen, wie man menschliche Hautbiopsien färbt, abbildet, verarbeitet und analysiert, mit dem Ziel, die Mechanismen zu verstehen, die der Pathogenese von mitochondrialen neurologischen Erkrankungen wie Neuropathie zugrunde liegen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Visualisierung und Quantifizierung nervenspezifischer Mitochondrien mittels dreidimensionaler Bildgebung und Analyse. Es ermöglicht Forschern, spezifische mitochondriale Signale aus komplexen Hintergründen zu isolieren, was für das Verständnis neurologischer Erkrankungen entscheidend ist.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Fluoreszenz-Bildgebung
Hintergrund
- Mitochondrien spielen eine entscheidende Rolle im zellulären Energiestoffwechsel.
- Das Verständnis der mitochondrialen Funktion in Nervenfasern kann Einblicke in neurologische Erkrankungen liefern.
- Fluoreszenz-Immunhistochemie ist eine Schlüsseltechnik zur Visualisierung zellulärer Strukturen.
- Diese Methode kann zwischen gesundem und pathologischem mitochondrialem Verhalten unterscheiden.
Zweck der Studie
- Zur Visualisierung nervenspezifischer Mitochondrien innerhalb der Epidermis.
- Zum Vergleich mitochondrialer Eigenschaften bei gesunden Personen im Vergleich zu Patienten mit neurologischen Komplikationen.
- Zur Verbesserung des Verständnisses der mitochondrialen Rollen in der Nervenfunktion.
Verwendete Methoden
- Fluoreszenz-Immunhistochemie-Färbung von Hautbiopsien.
- Dreidimensionale Bildgebungstechniken zur Datenanalyse.
- Isolierung spezifischer mitochondrialer Signale aus komplexen fluoreszierenden Hintergründen.
- Quantitative Analyse der mitochondrialen Verteilung und Eigenschaften.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung nervenspezifischer Mitochondrien in epidermalen Proben.
- Identifizierung von Unterschieden in den mitochondrialen Eigenschaften zwischen gesunden und betroffenen Personen.
- Demonstration der Wirksamkeit der 3D-Bildgebung bei der Isolierung spezifischer Signale.
- Einblicke in die Rolle der Mitochondrien in der neurologischen Gesundheit und Krankheit.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion in Nervenfasern.
- Die Fähigkeit, spezifische Signale zu isolieren, verbessert das Verständnis komplexer biologischer Systeme.
- Zukünftige Forschung kann auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um therapeutische Ziele in der Neurologie zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise isolation and quantification of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers, addressing a critical need in neurology research to de-risk target validation by providing disease-relevant, quantitative mitochondrial phenotypes. The method supports mechanistic de-risking in preclinical models by allowing direct comparison of mitochondrial characteristics between healthy and neurologically affected tissues, thereby improving predictive confidence in target selection for neurodegenerative disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating nerve-specific mitochondrial signals from complex epidermal backgrounds, clarifying pathway involvement in mitochondrial dysfunction.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible workflow for functional target validation using disease-altered mitochondrial morphology as a biomarker.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying mitochondrial size frequency distributions, enabling objective assessment of target engagement and biological de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, imaging-based readouts (e.g., mitochondrial volume, surface data) suitable for high-content screening platforms assessing compound effects on nerve-specific mitochondria.
- Reproducibility: Defines consistent parameters for staining, acquisition, and analysis, ensuring assay standardization across laboratories and timepoints for reliable compound evaluation.
- Scalability: The 3D imaging and analysis pipeline can be adapted to multi-well formats, supporting scalable screening of therapeutic candidates in disease-relevant human tissue models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly examines mitochondria in human sensory nerve fibers, providing a translationally accurate model for neuropathy and other mitochondrial-based neurologic diseases.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal assessment of mitochondrial alterations in the same tissue system used for target identification.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by linking mitochondrial phenotypes to neurological complications, reducing late-stage failure due to unanticipated biological mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, specifically enabling mechanistic de-risking of mitochondrial targets in neurodegenerative disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating nerve-specific mitochondria to clarify their role in axonal integrity and energy metabolism in sensory neurons.
- Screening: Delivers quantitative, standardized outputs (e.g., mitochondrial size frequency histograms) that allow comparison of compound-treated versus control conditions in human tissue.
- Analytics: Generates 3D surface data and threshold-based measurements that enable statistical analysis of mitochondrial distribution and morphology across experimental groups.
- Translational Research: Uses human skin biopsies to maintain disease relevance, ensuring findings are directly applicable to human neuropathy pathophysiology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis capability for studying mitochondrial dynamics in various nerve fiber types across multiple neurodegenerative indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial involvement in nerve fiber degeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined staining, imaging, and analysis parameters, minimizing inter-user variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of mitochondrial targets, reducing investment in targets with poor biological validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative mitochondrial phenotypes that inform advancement decisions in neurology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence immunohistochemistry and confocal microscopy for proper antibody labeling and signal detection.
- Dependent on laser scanning confocal microscopy with specific objectives (40X oil immersion) and spectral separation capabilities for green and red fluorophores.
- Necessitates 3D image analysis software capable of deconvolution, surface creation, masking, and threshold-based segmentation.
- Requires consistency in staining, acquisition, and analysis parameters across batches to ensure comparability of mitochondrial measurements.
- Limited to tissue systems where nerve-specific markers (e.g., PGP9.5) and mitochondrial markers (e.g., PDH) can be effectively labeled and distinguished from background signals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 1
9:39
Conclusion
8:41
Results: Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers
2:27
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 2
3:21
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 3
4:22
Confocal Imaging
6:00
Image Processing
7:03
Isolation of Nerve-specific Mitochondrial Signal
