Name: Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Erfahren Sie die dreidimensionale Bildgebung und Analyse von Mitochondrien in intraepidermalen Nervenfasern. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung nervenspezifischer Mitochondrien in Hautbiopsien für neurologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch nationale Institute der Gesundheit Stipendien K08 NS061039-01A2, The Program für Neurologie Forschung &#38; Entdeckung und A. Alfred Taubman Medical Research Institute an der University of Michigan. Dabei verwendet die Morphologie und die Bild-Analyse-Kern des Michigan Diabetes Research Center, finanziert durch das National Institute of Health Grant 5P 90 DK-20572 vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen. Die Autoren möchte J. Robinson Singleton und A. Gordon Smith (University of Utah) danken, für ihre großzügige Spende von menschlichen Hautproben.

Haut Stanzbiopsien stammen aus Themen, die von einem großen Community-basierte Erstversorgung Netzwerk an der University of Utah Diabeteszentrum (Salt Lake City, UT) rekrutiert wurden. Diese Studie wurde von der University of Michigan Institutional Review Board genehmigt und erfüllt mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki. Schriftliche Einwilligung eingeholt wurde, aus jedem Fach vor dem Test.
 1. Fluoreszenz Immunohistochemistry <ol><li>Prepare Stanzbiopsien für Intraepidermal Nervenfaser Immunohistochemistry: <ol><li>Perform 3 mm Haut Biopsien durch medizinisches Personal und die gesamte Biopsie in 1,5 mL Zamboni &#39; s Fixativ Lösung (2 % Paraformaldehyd, 0,3 % gesättigt Pikrinsäure in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4) bei 4 ° C über Nacht.</li>
		<li>Spülen Proben mit einer Lösung von 30 % Saccharose mit PBS-Puffer bei 4 ° C für 16-24 h oder bis die Probe sinkt.</li>
		<li>Embed Proben in optimale Arbeitstemperatur Verbindung (OCT) mit einem Cryomold. Legen Sie die ganze 3 mm-Biopsie mit der Epidermis nach unten in die Form und füllen Sie den Schimmel mit etwa 2 mL Okt. Freeze der Schimmel auf zerstoßenem Trockeneis. Shop bei-80 ° C bis zum Gebrauch.</li>
		<li>Cut 50 µm Dicke Querschnitte mit einem Kryostaten und speichern in einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 180 µL Frostschutzmittel Speicherlösung pro Bohrloch (30 % Ethylenglykol, 30 % Glycerin in PBS). Die folgenden Anweisungen sind für 8 Brunnen von einer 96-well-Platte. Flecken auf Abschnitte von jedem Standort der Biopsie, die 200-300 µm voneinander entfernt sind.</li>
	</ol></li></ol> Tag 1: <ol start="2"> <li>unspezifische Kennzeichnung des Stratum corneums zu stillen: <ol><li>Etikett 96-Well-Platte wie in Abbildung 1 gezeigt.</li>
		<li>Lager Signal Enhancer Lösung, um unspezifische Bindung der Sekundärantikörper 34 , 35 in jede Vertiefung Pipettieren 150 µL. Abschnitte in Signal-Enhancer-Lösung mit einer Impfkeimen Schleife übertragen. 
		Hinweis: Achten Sie darauf, während der Arbeit mit dem Gewebe beschädigen oder reißen die Gewebeschnitte zu vermeiden. Halten Sie in Signal-Enhancer-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem flachen Rocker.</li>
		<li>Vorbereiten spülen Brunnen in den Zeilen 2 und 3 des 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jede Vertiefung.</li>
		<li>Abschnitte sorgfältig in Zeile 2 und Spülen mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur übertragen.</li>
		<li>Spülen ein zweites Mal mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur (Zeile 3).</li>
	</ol></li> <li>5 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert Lösung vorbereiten: <ol><li>bereiten 5 % Lösung, die 5 % BSA enthält blockieren und 0,3 % Triton X 100 (TX-100) in 0,1 M PBS (siehe Tabelle 1) während der Abschnitte sind Inkubation Signal-Enhancer-Lösung. BSA geht einfach nicht in Lösung. Vortex Lösung bis BSA vollständig auflöst.</li>
		<li>Bereiten Sie blockierende Brunnen in Zeile 4 der 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 5 % BSA Lösung in jedem Bohrloch blockieren.</li>
		<li>Abschnitte in individuelle Vertiefungen von 5 % BSA Lösung blockiert und inkubieren Sie Abschnitte in 5 % BSA Lösung für 1-2 h bei Raumtemperatur auf einem flachen Rocker blockieren.</li>
	</ol></li> <li>1 % BSA Spülung Lösung und Verdünnung der Primärantikörper vorbereiten: <ol><li>bereiten Sie 1 % Spüllösung, die 1 % BSA und 0,3 % enthält TX-100 in 0,1 M PBS (siehe Tabelle 2) während der Abschnitte sind Inkubation in 5 % BSA blockierende Lösung. BSA geht einfach nicht in Lösung. Vortex Lösung bis BSA vollständig auflöst.</li>
		<li>Verdünnen Primärantikörper in 1 % BSA Spüllösung während Abschnitte in 5 % BSA blockierende Lösung brüten sind.
		<ol><li>1.500 µL Primärantikörper Lösung machen und fügen Sie jeweils gut in Zeile 5.</li>
			<li>Verdünnen die primären Antikörper: verwenden Sie das Nerven-spezifische Beschriftung, Kaninchen polyklonale Anti-Protein Genprodukt 9.5 (PGP9.5) auf 1:1 000. Verwenden Sie die Mitochondrien-spezifische Bezeichnung, Maus monoklonalen Anti-Pyruvat-Dehydrogenase E2/E3bp Antikörper (PDH) bei 1: 100 in 1 % BSA Spüllösung.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Primärantikörper vorbereiten: <ol><li>Pipettieren 150 µL Primärantikörper in jede Zeile auch in 5 von 96-Well-Platte.</li>
		<li>Mit der Loop-Werkzeug Abschnitte aus der blockierenden Lösung (Zeile 4) in der Zeile 5 enthält den primären Antikörper übertragen.</li>
		<li>Wickeln Sie die Platte fest mit Parafilm zu halten vor dem Austrocknen.</li>
		<li>Proben auf flachen Rocker bei Raumtemperatur für 1 h und inkubieren Sie Proben bei 4 ° c auf einem flachen Rocker Übernachtung.</li>
	</ol></li></ol> Tag 2: <ol start="6"> <li>spülen Proben: <ol><li>Prepare spülen Brunnen in Reihen 6, 7 und 8 der 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 1 % BSA Spüllösung in jede Vertiefung.</li>
		<li>Abschnitte in ersten 1 % BSA Spüllösung (Zeile 6) und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Spülungen durch Inkubation Abschnitte in 1 % BSA Spüllösung in den Zeilen 7 und 8 für 1 h bei Raumtemperatur noch zweimal zu wiederholen.</li>
	</ol></li> <li>Sekundärantikörper in 1 % BSA Spüllösung zu verdünnen: <ol><li>machen 1.500 µL Sekundärantikörper Lösung während Abschnitte in den letzten Spülgang 1 % BSA Spüllösung (Zeile 8) Inkubation werden.</li>
		<li>Sekundärantikörper verdünnen: für PGP9.5 (grün-fluoreszierende konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, 1: 1000), für PDH (rot-fluoreszierend konjugierten Ziege Anti-Maus, 1:1 000) in 1 % BSA Spüllösung.</li>
	</ol></li> <li>Sekundärantikörper vorbereiten: <ol><li>Pipettieren 150 µL Sekundärantikörper in Zeile 9 von 96-Well-Platte.</li>
		<li>Sanft übertragen die Abschnitte von 1 % BSA Spüllösung (Zeile 8) in Sekundärantikörper Vertiefungen (Zeile 9).</li>
		<li>Mit Parafilm, wickeln Sie die Platte fest zu halten vor dem Austrocknen. Mit Alufolie abdecken. Proben auf flachen Rocker bei Raumtemperatur für 1 h und inkubieren Sie Proben bei 4 ° c auf einem flachen Rocker Übernachtung.</li>
	</ol></li></ol> Tag 3: <ol start="9"> <li>vorbereiten reinigen 1 X PBS durch Filterung durch einen 0,22 µm-Filter: <ol><li>Pipettieren 150 µL gefiltert 1 X PBS in Zeile 10, 11 und 12.</li>
		<li>Proben auf Zeile 10 übertragen und spülen Sie mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur. Decken Sie 96-Well-Platte mit Alufolie ab und auf einen flachen Rocker beim Spülen. Wiederholung gefiltert 1 x PBS spülen zwei weitere Male für 1 h bei Raumtemperatur in den Zeilen 11 und 12.</li>
	</ol></li> <li>Montage Gewebeschnitte Objektträger vorbereiten: <ol><li>Ort 50 µL 1 X PBS auf einer Folie gefiltert.</li>
		<li>Transfer-Abschnitt von 1 X PBS (Zeile 12) in den 50 µL Tropfen. Positionieren Sie sorgfältig Abschnitt in der Dropdownliste der PBS durch Entfaltung des Gewebes und Abflachung es sanft auf dem Objektträger. Entfernen Sie überschüssige PBS mit einer Glaspipette um das Montage-Reagenz Verdünnung zu vermeiden. Abschnitte mit der Glaskolben nicht berühren.</li>
		<li>Pipettieren 1 - 2 Tropfen Montage Reagenz mit DAPI direkt auf den Abschnitt über das Mikroskop Folie mit Sorgfalt um die Ausrichtung des Abschnitts nicht zu stören. Sanft lege ein 50 mm x 24 mm #1.5 Mikroskop Glas Deckglas über Abschnitt.</li>
		<li>Klare Luftblasen gebildet, indem man das Deckglas und wischen Sie überschüssige Flüssigkeit von den Kanten des Deckglases. Bereiten Sie eine neue Folie und wiederholen Sie die Montage-prdet für jeden Abschnitt.</li>
		<li>Heilung/trockene Montage Medien indem man die Folien in der dunklen Nacht bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Folien auf 4 ° C für kurzfristige (1-2 Wochen) oder-20 ° C für die Langzeitspeicherung (mehr als 2 Wochen). 
		Hinweis: Negativkontrollen Primärantikörper für PGP9.5 oder PDH in Schritt 1.4.2.2 weggelassen und angezeigt, keine unterscheidbare Kennzeichnung von Nerven oder Mitochondrien in der Epidermis. Positiv, dass Kontrollen wurden Etiketten für die PDH Antikörper zu beweisen alle Mitochondrien (Daten nicht gezeigt). Positivkontrollen wurden auf kultivierten primäre Maustaste Dorsal Root Ganglion Neuronen durchgeführt, die mit einem Baculovirus zum Label Mitochondrien mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Signal ausgestrahlt wurden und dann fixiert und befleckt mit dem PDH-Antikörper und rot fluoreszierende Sekundärantikörper. Alle Mitochondrien, die GFP zum Ausdruck zu bringen, wurden gemeinsam mit dem roten Etikett für PDH Immunohistochemistry (Daten nicht gezeigt) beschriftet wurden.</li>
	</ol></li></ol> 2. Confocal Imaging <ol><li>konfokale Bildgebung durchführen: <ol><li>sammeln Bilder mit einem Laser-scanning-confocal Mikroskop mit einem 40 X Ölimmersion (1,25 numerische Apertur (N.A)) Ziel auf einem inversen Mikroskop.
		<ol><li>Bei jedem Brennebene sequenziell erwerben fluoreszierende Signale: Kerne: Erregung λ = 405 nm, spektrale Emission Filter λ = 420-480 nm Nervenfasern: Erregung λ = 488 nm, spektrale Emission Filter λ = 505-560 nm Mitoch Ondria: Erregung λ = 543 nm, spektrale Emission Filter λ = 606-670 nm</li></ol></li> <li>die folgenden Scan-Parameter in die Mikroskop-Software eingeben: Scan-Rate von 600 Hz mit 2 Rahmen mit durchschnittlich und Zoom von 2,2; Intensität 12-Bit Auflösung (4096 grau Ebenen).
		<ol><li>Stellen die Mikroskop-Software für optimierte laterale Auflösung (scan-Auflösung = 1.024 x 1.024) und axiale Auflösung/optische-Schnitt (konfokale Blende = 1 luftig Einheit (AU) mit Z-Schrittweite von 210 nm). 
			Hinweis: Die resultierende XYZ-Auflösung ist 172,2 nm x 172,2 nm X 210 nm mit einer Bildgröße von 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm.</li>
		</ol></li> <li>Aktivieren Sie ein live-Bild für das Nervensignal (grün-Fluoreszenz) und stellen Sie die Z-Fokus-Regler zu finden und einstellen den oberen und unteren Brennweite Flugzeuge in der Mikroskop-Software, die das Nervensignal im Abschnitt Gewebe umfassen. Z-Gesamtreichweite beträgt in der Regel 30-50 µm für einen 50 µm Gewebe Abschnitt.</li>
		<li>Feld Scan mit der Mikroskop-Software während einer live-Bild drehen, so dass die Epidermis in das Bild horizontal oder vertikal positioniert ist.</li>
		<li>Scannen jedes Signal getrennt und passen Sie den Detektor (Photomultiplier Röhre, PMT) Spannung und Offset zu minimieren/über und unter gesättigten Pixel entfernen. 
		Hinweis: Die Scan-Zeiten mit den oben genannten Parametern dauern ca. 20-40 min je nach Anzahl der Z-Scheiben.</li>
	</ol></li></ol> 3. 3D Visualisierung und Analyse der Mitochondrien innerhalb menschlicher Intraepidermal Nervenfasern <ol><li>3D Epidermis zu isolieren: <ol><li>duplizieren Sie das Originalbild und verwenden Sie die maximale Intensität Projektion (erweiterte Fokusansicht) des Bildes zu identifizieren und isolieren die Epidermis.</li>
		<li>Verwenden eine Region von Interesse-Werkzeug, um Spur entlang der oberen und unteren Kanten der Epidermis, um unerwünschte Bereiche wie das Stratum Corneum und Dermis zu entfernen, das Fehlen von Intraepidermal Nervenfasern. Auf diese Auswahl zuschneiden.</li>
	</ol></li> <li>Verwendung Dekonvolution auf die Nerven und mitochondriale fluoreszierende Signale: Hinweis: Dekonvolution hilft, die Integrität der fluoreszierenden Signale wieder herzustellen. Die Wiederherstellung, die in diesem Protokoll verwendeten wird blind Deconvolution genannt, weil es die fluoreszierenden Signale in den Bildern nutzt um zu bestimmen, wie viel die Signale von ihrer ursprünglichen Quelle verbreiten (Punkt spread Funktion). Der Prozess verbessert Signal Auflösung durch die Neuzuweisung des Signals zurück in seine Ursprungsposition verbreitet.
	<ol><li>Berechnen einen Punkt verteilen Funktion (PSF) für das grün fluoreszierende Nervensignal (grün-Fluoreszenz) mit den folgenden Parametern: <ol><li>stellen berechneten PSF auf konfokalen. Stellen Sie mittlere Brechungsindex auf 1.515 und numerische Apertur auf 1,25. Stellen Sie Detektor Lochkamera auf 1 luftig Einheit (AE). Set Laser Erregung Wellenlänge 488 nm und Emissions-Wellenlänge 515 nm.</li>
		</ol></li> <li>Ein PSF für rote mitochondriale Fluoreszenzsignal (rot-Fluoreszenz) mit den folgenden Parametern zu berechnen: <ol><li>Set PSF auf konfokalen berechnet. Stellen Sie mittlere Brechungsindex auf 1.515 und numerische Apertur auf 1,25. Detektor Lochkamera auf 1 gesetzt AU. Eingestellten Erregung Laserwellenlänge 543 nm und Emissions-Wellenlänge, 617 nm.</li>
		</ol></li> <li>Optimieren die Nerven- und Mitochondrien fluoreszierende Signale von Dekonvolution unter Verwendung der entsprechenden PSFs oben aufgeführten und iterative Wiederherstellung Feature auf 100 % Vertrauen und einer Iteration-Grenze von 10 Zyklen festgelegt.</li>
	</ol></li> <li>Nerv-spezifische Oberflächen zu schaffen: <ol><li>Gebrauch der &#34; DGM erstellen &#34; Werkzeug, um eine feste Oberfläche der Nerven von den deconvolved grün-fluoreszierende sekundäre Kennzeichnung von der PGP9.5 identifiziert Nerven.</li>
		<li>Uncheck die &#34; glatt &#34; verfügen und absolute Intensität-Funktion verwenden, um die Schwelle für das Nervensignal gesetzt, denn es ist deutlich heller als Hintergrundfluoreszenz.</li>
		<li>Funktion zum setzen Sie den Schwellenwert für das Nervensignal, da es deutlich heller als Hintergrundfluoreszenz ist die absolute Intensität. Legen Sie Schwellenwert niedrig genug, um die Nerven genau zu identifizieren.</li>
		<li>Filter, kleinen, nicht-Nerv Oberflächen basierend auf Größe. 
		Hinweis: Manuell bearbeiten Sie ggf. zusätzliche nicht-Nerv Oberflächen innerhalb der &#34; bearbeiten &#34; Registerkarte "halten Sie die Strg-Taste, um mehrere Objekte markieren und dann mit der Entf-Taste löschen.</li>
	</ol></li> <li>Isolieren Nerv-spezifische mitochondriale Fluoreszenzsignal: <ol><li>Wählen Sie die Registerkarte "Bearbeiten" der Nerv Oberfläche zum Anzeigen der &#34; Maskeneigenschaften &#34; Funktion. Die Nerv-Oberfläche in Schritten 3.3 erstellt wird verwendet, um die Mitochondrien in die Nerven weg von mitochondrialen Signale zugeordnet die Keratinozyten isolieren.</li>
		<li>Als die &#34; Maske alle &#39; Taste öffnet sich ein &#34; Maskenkanal &#34; Fenster, wählen Sie das deconvolved rot-fluoreszierend-Signal aus dem Pull-down-Menü unter &#34; Kanalwahl &#34; für das mitochondriale Signal.</li>
		<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen ein Häkchen setzen der &#34; doppelten Kanal vor dem Auftragen der Maske &#34; Option.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Radio-Taste an der &#34; konstant innen/außen &#34; Möglichkeit, die Maskeneinstellungen und klicken Sie im Feld ein Häkchen setzen die &#34; Voxel Außenfläche zu setzen &#34; Option und geben Sie für den Wert 0,00. Klicken Sie auf "OK"-Taste, um den neuen Kanal erstellen, die mitochondriale Signale innerhalb der Nerv Oberfläche darstellt.</li>
	</ol></li> <li>Mitochondrien-spezifische Oberflächen zu schaffen: <ol><li>Gebrauch der &#34; DGM erstellen &#34; Werkzeug, um eine feste Oberfläche der Mitochondrien aus dem neu geschaffenen fluoreszierende Kanal der Nerv-spezifische mitochondriale Signale von 3.4 Schritte.</li>
		<li>Uncheck die &#34; glatt &#34; verfügen, und wählen Sie den &#34; Hintergrund Subtraktion &#34; Funktion, um den Schwellenwert festlegen. Diese Funktion nutzt lokale Kontrast um das mitochondriale Signal Mitochondrien aus Hintergrund identifizieren.</li>
		<li>Set-Schwellenwert ist niedrig genug, um die Mitochondrien genau zu identifizieren. In diesem Beispiel wurde der untere Grenzwert auf 2.000 für einen 16-Bit (65.536) Maßstab festgelegt.</li>
		<li>Filtern mitochondriale Oberflächen basierend auf Größe. In diesem Beispiel wird das Voxel-Limit auf 1,0 Voxel festgelegt wurde, ist die niedrigste möglich zu begrenzen. Bearbeiten Sie ggf. manuell nicht Mitochondrien Oberflächen innerhalb der &#34; bearbeiten &#34; Registerkarte "halten Sie die Strg-Taste, um mehrere Objekte auswählen und dann mit der Entf-Taste löschen. 
		Hinweis: Gelegentlich wird die Software Oberflächen erstellen, die keine unterscheidbare mitochondriale Fluoreszenzsignal zugeordnet sind. In diesen Fällen ist es möglich, entfernen sie mit dem &#34; bearbeiten &#34; tab.</li>
	</ol></li> <li>Exportieren und morphometrische Werte für die Analyse berechnen: <ol><li>Werte für Nerven- und mitochondriale Oberflächen aus exportieren der &#34; Statistik &#34; Registerkarte zur weiteren Analyse mit elektronischen Tabellenkalkulations-Software.</li>
		<li>Exportieren die Volumenwerte für die Nerven und die mitochondriale Oberflächen.</li>
		<li>Die Anzahl der einzelnen Nervenfasern vorhanden in jedem Bild und notieren Sie den Wert in der elektronischen Tabellenkalkulation.</li>
		<li>Für jedes Bild die folgenden möglichen Werte für die Analyse in der elektronischen Tabellenkalkulation berechnen: <ol><li>Sum Volumes für alle Nerven Oberflächen.</li>
			<li>Filter, Nerven-spezifische mitochondriale Oberflächen unter einem Volumen von weniger als 0,02 µm 3 und bin Größe Oberflächen durch. Z. B. Behälter z. B. 0,02 - 0,04 0,04 - 0,08 0,08 - 0,16, 0,16 - 0,32, 0,32 - 0,64, 0,64 - 1.28 1.28-2,56, größer als 2,56 µm 3. 
			Hinweis: Die untere Grenze der mitochondrialen Volumen wurde gegründet um 0,02 µm 3 anhand der bisher erschienenen Bände der Mitonchodria 36 , 37 , 38.</li>
			<li>Zählen die Anzahl der Nerven-spezifische mitochondriale Flächen in jedem Lagerplatz und die Gesamtzahl der Flächen über die Lagerplätze (0,02 - mehr als 2,56 µm 3).</li>
			<li>Berechnung des Anteils der Nerv-spezifische mitochondriale Oberflächen in jedem Lagerplatz. Verwenden Sie die Anzahl die pro bin dividiert durch die Gesamtzahl der Mitochondrien Oberflächen.</li>
			<li>Summe der Volumina für alle Nerven-spezifische mitochondriale Oberflächen.</li>
			<li>Berechnet den Anteil des Nervs mit mitochondrialen Signal dividiert das total Nerv Oberfläche Volumen durch die Summe aller mitochondriale Oberfläche Volumes.</li>
			<li>Berechnen Sie die Anzahl der Mitochondrien pro Nerv Volumen dividiert das total Nerv Oberfläche Volumen durch den Grafen von allen mitochondriale Oberflächen.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Keine Interessenkonflikte zu erklären.

Dieses Protokoll soll zu isolieren, zu quantifizieren und zu analysieren, die Größe und Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien innerhalb von IENFs in 3D aus Menschenhaut Biopsien. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Die frei schwebenden Fluoreszenz Immunohistochemistry soll beflecken und mehrere Signale in jeder Probe, die eine vielseitigere Methodik für explorative Forschung44,45analysieren. Dieses Verfahren ermöglicht für die Penetration der ...

Mitochondrien dienen wichtige Zellfunktionen, die Produktion von Zellenergie, Pufferung, Kalzium, und Regulierung der nekrotischen und Apoptotic Zelle Tod1,2,3enthalten. Das Nervensystem hat eine hohe metabolische Rate im Vergleich zu den Körper4 darauf hindeutet, dass Neuronen ein hohes Maß an zelluläre Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP erzeugen) durch mitochondriale Atmung. Eine Menge Beweise dokumentiert, dass neuronale Funktionen ATP5, vor allem bei den Synapsen6abhängig sind. Die Verteilung der Mitochondrien innerhalb von Neuronen sind deshalb wichtig.
In die letzten 10 Jahren, die eine Vielzahl von Informationen, dass gezeigt hat der Handel und das Andocken des neuronalen Mitochondrien, ist streng reglementiert. Motorproteine sind bei der Verteilung der Mitochondrien zu spezifischen zellulären Fächer in das Neuron beteiligt. Handel mit Mitochondrien ist besonders wichtig, weil Neuronen Axone und Dendriten fernab der Soma-Projekt. Motorproteine Kinesin direkt in erster Linie Anterograde (Weg von der Soma) Handel mit Mitochondrien entlang der Mikrotubuli während Dynien Motorproteinen direkte retrograde (in Richtung der Soma) Motilität7,8,9 , 10. Zelluläre Signale gibt es solch eine mitochondriale Membranpotential und Impuls-Leitung, die Einfluss auf das Vorhandensein und die Richtung der mitochondrialen Menschenhandel11,12,13.
Neben Mitochondrien zu transportieren, gibt es spezielle Proteine, Mitochondrien zu spezifischen zellulären Kompartimenten zu lokalisieren, die hohen Energiebedarf, wie Knoten von Ranvier und Synapsen8,14, 17. In der Tat, die meisten von Mitochondrien in Axonen sind nicht bewegliche9,13,18. Spezielle Proteine wie Syntaphilin Anker Mitochondrien Mikrotubuli entlang der Axone während andere Proteine Anker Mitochondrien an den Aktin-Zytoskelett19–21. Wachstumsfaktoren und Ionen wie Calcium wurden berichtet, um die Einstellung der Mitochondrien Bewegung sie Regionen lokalisieren wo sie benötigte21,22,23sind zu unterstützen.
Zusammengenommen, sind Menschenhandel und docking der Mitochondrien entscheidend für die richtige Funktion der Neuronen. Zur Unterstützung dieser wurde Unterbrechung des mitochondrialen Handel mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Zahn Krankheit, Huntington Krankheit, erbliche spastische Paraparese und Optikusatrophie15,24,25,26,27. Neuere Studien konzentrierten sich auf mitochondriale Dysfunktion und Pathologie als ein möglicher Mechanismus für diabetische Neuropathie, die sensorische Verlust im Zusammenhang mit Diabetes28,29,30,31 ,32,33. Die Hypothese ist, dass Diabetes die Verteilung der Mitochondrien innerhalb der sensorischen Projektionen der kutanen Nervenendigung verändert. Daher wurde eine Technik entwickelt, um zu visualisieren und zu quantifizieren Mitochondrien innerhalb der Intraepidermal Nervenfasern (IENFs), die distalen Spitzen der Dorsal Root Ganglion sensorischen Afferenzen. Die Technik kombiniert Fluoreszenz Immunohistochemistry spezifische mitochondriale und Nervenfaser Etiketten mit konfokalen Mikroskopie Z-Serie Erwerb von Signalen mit leistungsstarken 3D Bildanalyse-Software zur Messung der Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien von menschlichen kutanen Stanzbiopsien zur Erreichung dieses Ziels.

<table><tbody><tr><td>2% Zamboni's Fixative</td><td>Newcomer Supply, Middleton, WI&nbsp;</td><td>1459A</td><td>2 % Paraformaldehyd, 0,2 % gesättigte Pikrinsäure in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4</td></tr><tr><td>10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>BP399-4</td><td>Zur Herstellung von 1x PBS</td></tr><tr><td>Image-iT FX Signal Enhancer</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>I36933</td><td>verbessert Alexa Fluor-Farbstoffsignale durch Reduzierung der unspezifischen Bindung</td></tr><tr><td>Anti-Protein Gene Product 9.5 Antikörper (Kaninchen polyklonal)</td><td>Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td><td>14730-1-AP</td><td>abgekürzt als PGP9.5, ersetzt das abgekündigte AbD Serotec (Kat. Nr. 7863-0504) Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Pyruvat-Dehydrogenase E2/E3bp Antikörper (Maus monoklonal)</td><td>abcam, Cambridge, MA</td><td>ab110333</td><td>abgekürzt als PDH</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Sekundärer Antikörper Alexa Fluor 594 Konjugat</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11034</td><td>rot fluoreszierender konjugierter Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Sekundärer Antikörper Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11032</td><td>grün-fluoreszierender konjugierter Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Albumin, aus dem Rinderserum</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A7906-100</td><td>abgekürzt als BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T9284</td><td>abgekürzt als TX-100</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Filter</td><td>EMD Millipore, Billerica MA</td><td>MILLEX GP SLGP 033NS</td><td>0,22 &micro; m Millipore-Filter</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>13-374-10</td><td>Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td></tr><tr><td>Nicht kalibrierte Schleife</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>22-032092</td><td>Impfschleife von Decon LeLoop (MP 199-25)</td></tr><tr><td>96-Well-Assay-Platte</td><td>Corning Incorporated, Corning, NY</td><td>3603</td><td>96-Well-Platte mit flachem Boden</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifading-Reagenz mit DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>P-36931</td><td>DAPI Färbung von Zellkernen</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas 50 x 24 mm</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-544E</td><td>Deckgläser</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-550-15</td><td>Objektträger</td></tr><tr><td>Leica SP5 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td><td>SP5</td><td>Konfokales Mikroskop</td></tr><tr><td>Volocity x64 Software&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Waltham , MA</td><td>Version 4.4.0</td><td>Volocity-Software wird für die Schritte 3.1 und 3.2 im Protokoll für die Bildverarbeitung verwendet</td></tr><tr><td>Imaris x64 3-dimensionale Analysesoftware</td><td>Bitplane, Concord, MA</td><td>Version 7.7.1</td> Die <td>Imaris-Software wird für die Schritte 3.3 bis 3.5 im Protokoll für die Bildanalyse</td></tr><tr><td>verwendet Excel</td><td>Microsoft, Redmond, WA</td><td>Version Office 2013</td><td>Die Excel-Tabellenkalkulationssoftware wird für Schritt 3.6 im Protokoll verwendet, um die morphometrischen Merkmale zusammenzufassen</td></tr><tr><td>Optimum Cutting Temperature Compound</td><td>Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td>abgekürzt als OCT</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td><td>CM1850</td><td>Kryostat zum Schneiden von 50 & Mikro; m Schnitte</td></tr><tr><td>CellLight Mitochondrien-GFP, BacMam 2.0</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>C10600</td><td>Wird als positive Kontrolle verwendet, um Mitochondrien mit einem grün fluoreszierenden Signal zu markieren</td></tr></tbody></table>

dreidimensionale bildgebung und analyse der mitochondrien innerhalb von menschlichen intraepidermal nervenfasern

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Das Ziel dieses Protokolls ist, Mitochondrien innerhalb Intraepidermal Nervenfasern zu studieren. Daher wurden 3D Bildgebung und Analysetechniken entwickelt, um Nerv-spezifische Mitochondrien zu isolieren und Krankheit verursachten Veränderungen der Mitochondrien in der distalen Spitze der sensorischen Nerven zu bewerten. Das Protokoll verbindet Fluoreszenz Immunohistochemistry, konfokale Mikroskopie und 3D-Bild Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Detaillierte Parameter sind im gesamten Verfahren definiert, um ein konkretes Beispiel, wie man diese Techniken verwenden, um Nerv-spezifische Mitochondrien isolieren zu bieten. Antikörper wurden verwendet, um Nerven zu beschriften und mitochondriale Signale in Gewebeschnitten der Haut Punsch Biopsien, die folgte indirekte Immunfluoreszenz, Nerven und Mitochondrien mit grünen und roten Fluoreszenzsignal bzw. zu visualisieren. Z-Serie-Bilder wurden mit der konfokalen Mikroskopie erworben und 3D Analyse-Software wurde zur Verarbeitung und Analyse der Signale. Es ist nicht notwendig, die genauen Parameter innerhalb beschrieben folgen, aber es ist wichtig, die konsistent mit denen, die in der Färbung, Erfassung und Analyse Schritten gewählt werden. Die Stärke dieses Protokolls ist, dass es auf eine Vielzahl von Umständen anwendbar ist, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um andere Signale zu isolieren, die sonst unmöglich, allein zu studieren.

Visualisierung und Quantifizierung der Mitochondrien innerhalb von menschlichen IENFs
Fluoreszenz Immunohistochemistry ermöglicht die gleichzeitige Kennzeichnung von mehreren Signalen innerhalb menschlicher Hautbiopsien, Nerven, Mitochondrien und Kerne zu visualisieren. Eine 96-Well-Platte ist eine komfortable Möglichkeit, die Schritte des Verfahrens Immunohistochemistry zu organisieren. Abb...

Dieses Protokoll verwendet dreidimensionale (3D) Bildgebung und Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Die Techniken sind anwendbar auf andere Situationen, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um eine Teilmenge der Daten aus einem anderen Fluoreszenzsignal zu isolieren.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Das übergeordnete Ziel dieser Bildgebungs- und Analysetechnik besteht darin, spezifische Informationen aus einem komplexen Signal zu isolieren. Insbesondere beschreibt dieses Protokoll, wie nervenspezifische Mitochondrien im Vergleich zu anderen Mitochondrien in der Epidermis sichtbar gemacht und quantifiziert werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurologie zu beantworten, beispielsweise wie sich Mitochondrien in intraepidermalen Nervenfasern gesunder Personen mit den nervenspezifischen Mitochondrien von Patienten mit neurologischen Komplikationen vergleichen lassen.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir ein komplexes Signal aufnehmen und gezielt spezifische Informationen daraus extrahieren. Dieses Protokoll hilft uns, ein bestimmtes Signal – wie beispielsweise das Signal in diesen Röhrchen – von den umgebenden Signalen zu isolieren. Bereiten Sie die fluoreszenzbasierte Immunhistochemie-Färbung von Hautbiopsien vor, indem Sie zunächst eine 96-Loch-Platte gemäß diesem Schema beschriften.Anschießend pipettieren Sie 150 µL der Stammlösung des Signalverstärkers, um die unspezifische Bindung sekundärer Antikörper in jedes Loch der obe

three-dimensional-imaging-analysis-mitochondria-within-human

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Source: Hamid, H. S., et al. Dreidimensionale Bildgebung und Analyse von Mitochondrien in menschlichen intraepidermalen Nervenfasern. J. Vis. exp.  (2017) Dieses Video demonstriert die Methode zur Visualisierung nervenspezifischer Mitochondrien mittels dreidimensionaler Bildgebung. Es beschreibt den Prozess der Erfassung sequentieller Scans von vormarkierten intraepidermalen Nervenfasern und der Erstellung von 3D-Oberflächenbildern, um Mitochondrien in Bezug auf Nervenstrukturen zu isolieren...

Visualisierung der Mitochondrien innerhalb der intraepidermalen Nervenfasern

Um die Änderungen des nozizeptiven intraepidermal Nervenfasern (IENFs) in schmerzhafte Neuropathie (PN) zu untersuchen, haben wir Protokolle, die direkt untersuchen könnte dreidimensionalen morphologischen Veränderungen in nozizeptiven IENFs beobachtet. Dreidimensionale Analyse IENFs hat das Potenzial, um die morphologischen Veränderungen in IENF PN bewerten.

Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben

Das Protokoll für die dynamische Längs Bildgebung und Selective Laser Läsion des Nervenenden in Reporter-transgenen Mäusen wird vorgestellt.

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Mitochondriale Visualisierung und Analyse aus Säugetier-Hirngewebe ist eine herausfordernde Aufgabe. Hier beschreiben wir, wie die dreidimensionale (3D) Rekonstruktionsanalyse aus der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBFSEM) genutzt werden kann, um Einblicke in die morphologische und volumetrische Analyse dieser kritischen energieerzeugenden Organelle zu gewinnen.

Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie

Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie sind an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das vorgestellte Protokoll verwendet induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Vorhirn-Neuronen, um mitochondrialen Transport und Morphologie bei erblicher spastischer Paraplegie zu bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des mitochondrialen Handels entlang von Axonen und die Analyse ihrer Morphologie, die das Studium neurodegenerativer Erkrankungen...

Analyse von mitochondrialem Transport und Morphologie bei humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen bei erblicher spastischer Paraplegie

Wir beschreiben Fluoreszenz-Photoaktivierungsmethoden zur Analyse des axonalen Transports von Neurofilamenten in einzelnen myelinierten Axonen peripherer Nerven von transgenen Mäusen, die ein photoaktivierbares Neurofilamentprotein exprimieren.

Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Unter Verwendung transgener fluoreszierender Mäuse werden detaillierte Protokolle beschrieben, um den axonalen Transport von Signalendosomen und Mitochondrien innerhalb motorischer und sensorischer Axone des intakten Ischiasnervs bei lebenden Tieren in vivo zu beurteilen.

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports

Dieses Protokoll beschreibt, wie mitochondriale Cristae rekonstruiert werden, um eine 3D-Bildgebung mit hoher Genauigkeit, hoher Auflösung und hohem Durchsatz zu erreichen.

Eine dreidimensionale Technik zur Visualisierung mitochondrialer ultrastruktureller Veränderungen in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen

Diese Studie präsentiert einen in-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebungsansatz zur Visualisierung der Strukturen von Axonterminals mit niedriger Schwelle von Mechanorezeptoren (LTMR) in der Vorderpfotenhaut von Mäusen. Durch wiederholte, hochauflösende Bildgebung einzelner Axone bietet diese Methode eine neue Grundlage, um die Struktur und Funktion des kutanen Sinneskreises während der Entwicklung und bei Erwachsenen zu untersuchen.

Intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung der Morphologie des berührungssensorischen Axons in der Maushaut

Lokale Injektionen einer mitochondrialen Farbstoffbeschriftung terminaler Schwann-Zellmitochondrien in vivo zur konfokalen Mikroskopie. Diese Methode nutzt einen Proof of Concept, der im Skelettgewebe von Mäusen mit gesunden oder kranken Muskeln demonstriert wurde, um eine hochauflösende mitochondriale Visualisierung zu ermöglichen.

Methoden zur In-situ-Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in Muskel- und terminalen Schwannzellen von Mäusen

Erfahren Sie die dreidimensionale Bildgebung und Analyse von Mitochondrien in intraepidermalen Nervenfasern. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung nervenspezifischer Mitochondrien in Hautbiopsien für neurologische Forschung.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

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