Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

Das übergeordnete Ziel dieser Bildgebungs- und Analysetechnik besteht darin, spezifische Informationen aus einem komplexen Signal zu isolieren. Insbesondere beschreibt dieses Protokoll, wie nervenspezifische Mitochondrien im Vergleich zu anderen Mitochondrien in der Epidermis sichtbar gemacht und quantifiziert werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurologie zu beantworten, beispielsweise wie sich Mitochondrien in intraepidermalen Nervenfasern gesunder Personen mit den nervenspezifischen Mitochondrien von Patienten mit neurologischen Komplikationen vergleichen lassen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir ein komplexes Signal aufnehmen und gezielt spezifische Informationen daraus extrahieren. Dieses Protokoll hilft uns, ein bestimmtes Signal – wie beispielsweise das Signal in diesen Röhrchen – von den umgebenden Signalen zu isolieren. Bereiten Sie die fluoreszenzbasierte Immunhistochemie-Färbung von Hautbiopsien vor, indem Sie zunächst eine 96-Loch-Platte gemäß diesem Schema beschriften.

Anschießend pipettieren Sie 150 µL der Stammlösung des Signalverstärkers, um die unspezifische Bindung sekundärer Antikörper in jedes Loch der oberen Reihe zu reduzieren. Bereiten Sie Spül-Löcher vor, indem Sie 150 µL 1x phosphatgepufferter Salzlösung in jedes Loch der Reihen zwei und drei der 96-Loch-Platte geben. Geben Sie danach 150 µL der 5 % BSA-Blocklösung in die Löcher der vierten Reihe.

Verdünnen Sie die primären Antikörper PGP9.5 und PDH in 1.500 µL 1 %-BSA-Spüllösung und geben Sie jeweils 150 µL in jede Vertiefung der Reihe fünf. Überführen Sie die Schnitte mithilfe einer Inokulationsnadel in die Signalverstärkerlösung in Reihe eins. Sobald sich die Schnitte in der primären Antikörperlösung in Reihe fünf befinden, verschließen Sie die Platte fest mit Laborfolie, um Verdunstung zu verhindern, und schütteln Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem flachen Schüttler.

Inkubieren Sie mit Schütteln über Nacht bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie am zweiten Tag des Verfahrens damit, 150 Mikroliter 1 % BSA-Spüllösung in die Vertiefungen der Reihen sechs, sieben und acht der 96-Loch-Platte abzupipettieren. Geben Sie die fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper zu 1.500 Mikrolitern 1 % BSA.

Anschießend pipettieren Sie 150 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung in jedes Loch der Reihe neun. Spülen Sie die Schnitte durch die Löcher sechs, sieben und acht. Sobald sich die Schnitte in der sekundären Antikörperlösung in Reihe neun befinden, umwickeln Sie die Platte mit Parafilm und bedecken Sie sie mit Aluminiumfolie, um die Fluoreszenzsignale zu schützen.

Unter Schütteln wie zuvor inkubieren. Am dritten Tag 150 Mikroliter steril filtriertes 1x PBS in die Reihen 10, 11 und 12 pipettieren. Die Proben in Reihe 10 überführen und die Platte anschließend mit Aluminiumfolie abdecken.

Einmal eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schwenken spülen. Bereiten Sie danach eine Mikroskopie-Objektträger vor, um die Schnitte darauf zu montieren, indem Sie 50 Mikroliter gefilterte 1x PBS per Pipette auf den Objektträger überführen. Sobald die Spülschritte abgeschlossen sind, transferieren Sie einen Schnitt aus Reihe 12 auf den Objektträger und geben anschließend ein bis zwei Tropfen Montiermedium mit DAPI direkt auf den Schnitt.

Platzieren Sie vorsichtig einen 50 Millimeter mal 24 Millimeter großen Mikroskop-Deckglas der Güte 1,5 über den Schnitt. Stellen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln, um das Eindeckmedium aushärten zu lassen, bevor die Objektträger aufbewahrt oder abgebildet werden. Wählen Sie das 40X-Ölimmersionsobjektiv an einem invertierten Laser-Scanning-Konfokalmikroskop aus.

Wählen Sie die geeigneten Laser und Detektoren aus, um die Zellkerne, Nervenfasern und Mitochondrien abzubilden. Geben Sie die folgenden Scan-Parameter in die Mikroskop-Software ein: 12-Bit-Intensitätsauflösung, Scan-Geschwindigkeit von 500 Hertz mit zwei Bildmittelungen und einem Zoomfaktor von 2,2. Stellen Sie die Mikroskop-Software für eine optimierte laterale Auflösung ein, indem Sie eine Scan-Auflösung von 1024 × 1024 wählen.

Optimieren Sie die axiale Auflösung und optische Schichtung, indem Sie eine konfokale Blende von einer Luft-Einheit bei einer Z-Schrittgröße von 210 Nanometern wählen. Scannen Sie jedes Signal separat und passen Sie die Detektorspannung und den Offset an, um über- und unterbelichtete Bildpunkte zu eliminieren. Aktivieren Sie einen Live-Scan für das Nervensignal und stellen Sie mithilfe der Z-Fokus-Steuerung die oberen und unteren Fokusebenen in der Mikroskopsoftware ein, sodass das Nervensignal innerhalb des Gewebeschnitts vollständig erfasst wird.

Scannen Sie die endgültige Z-Serie mit sequenziellem Scannen, um Fluoreszenzsignalkreuzsprache zu vermeiden. Isolieren Sie die Epidermis vom Stratum corneum und der Dermis, indem Sie mithilfe eines Auswahlwerkzeugs auf einem duplizierten Bild des Originalbilds einen Bereich um die Epidermis zeichnen. Anschließend beschneiden Sie das Bild auf die Auswahl.

Berechnen Sie die Punktverteilungsfunktionen für die grünen und roten fluoreszierenden Konfokalsignale mithilfe der Funktion zur Berechnung der Verteilungsfunktion. Anschließend legen Sie die Parameter für den Brechungsindex des Mediums bei Öl mit 1,515 und für die numerische Apertur des 40X-Öl-Objektivs mit 1,25 fest. Stellen Sie die Detektorblende auf eine Luft-Einheit ein und wählen Sie eine Laseranregungswellenlänge aus.

Verwenden Sie die iterative Restauration mit 100 % Konfidenz, einer Iterationsgrenze von 10 Zyklen und den grünen und roten PSFs zur Entfaltung der grünen und roten Fluoreszenzsignale. Nutzen Sie das Werkzeug „Oberfläche erstellen“, um eine Oberfläche um die entfalteten Nervensignale zu generieren, wählen Sie dabei „Glättungsfunktion deaktivieren“, „absolute Intensität“ für die Schwellenwertbildung, einen unteren Schwellenwert von 3.000 und einen oberen Schwellenwert von 65.535. Behalten Sie Oberflächen oberhalb von 10 Voxel bei.

Entfernen Sie die Nicht-Nerven-Oberflächen, indem Sie im Bearbeitungs-Tab der Nervenoberfläche einzelne Nicht-Nerven-Oberflächen auswählen oder die Strg-Taste gedrückt halten, um mehrere Nicht-Nerven-Oberflächen auszuwählen. Löschen Sie die ausgewählten Nicht-Nerven-Oberflächen, indem Sie die Entfernen-Taste drücken. Verwenden Sie den Bearbeitungs-Tab in der Nervenoberfläche und klicken Sie auf die Schaltfläche „Alle maskieren“ in den Maskeneigenschaften.

Wählen Sie im neuen Fenster unter der Kanalauswahl Kanal fünf, Mitochondrien, entfaltet, und aktivieren Sie dann die Option zum Duplizieren des Kanals, bevor Sie die Maske anwenden. Drücken Sie die Optionschaltfläche für konstant innerhalb/außerhalb und aktivieren Sie die Option „Voxel außerhalb der Oberfläche auf 0,0 setzen“. Bestätigen Sie mit OK. Erstellen Sie abschließend mitochondrienspezifische Oberflächen mithilfe des Werkzeugs „Oberfläche erstellen“, indem Sie eine Oberfläche um die maskierten entfalteten mitochondriellen Signale erzeugen, die Option „Glättungsfunktion deaktivieren“ deaktivieren und die Hintergrundsubtraktion zur Schwellwertbestimmung verwenden.

Stellen Sie den Durchmesser der größten Kugel auf 1,50 Mikrometer ein, die untere Schwelle auf 2.000 und die obere Schwelle auf maximal 65.535. Achten Sie darauf, die Oberflächen über 1,0 Voxel zu halten. Dieses repräsentative 3D-Konfokalmikroskopiebild veranschaulicht das nervenspezifische grüne Fluoreszenzsignal.

Eine 3D-Oberfläche, dargestellt in Cyan, wird für das Nervensignal erstellt. Anschließend wird das nervenspezifische mitochondriale Signal mithilfe der Nervenoberfläche als Maskierungswerkzeug von den übrigen epidermalen mitochondrialen Signalen isoliert. Das resultierende nervenspezifische mitochondriale rote Fluoreszenzsignal wird verwendet, um Oberflächen in Magenta um die Mitochondrien innerhalb der in Cyan dargestellten Nervenoberfläche zu erzeugen.

Dadurch können die Mitochondrien in den Nervenfasern detailliert dargestellt werden. Hier werden Daten zur mitochondriale Oberfläche als Histogramm der Größenverteilung präsentiert, um den Prozentsatz der Mitochondrien in den jeweiligen Biegungen entsprechend ihrem Volumen zu veranschaulichen. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, während des Färbeprozesses sorgfältig mit dem Gewebe umzugehen, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig in den Lösungen eingetaucht bleibt, was eine gleichmäßige und konsistente Färbung über alle Schnitte hinweg gewährleistet.

Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mitochondrien in menschlichen intraepidermalen Nervenfasern sichtbar macht und quantifiziert. Unser detailliertes Protokoll wurde entwickelt, um anderen Forschern beizubringen, wie menschliche Hautbiopsien angefärbt, abgebildet, verarbeitet und analysiert werden, um die Mechanismen zu verstehen, die der Pathogenese mitochondrienerkrankungsbedingter neurologischer Erkrankungen wie beispielsweise Neuropathien zugrunde liegen.