Name: Die Nutzung der Bioorthogonale inversem Elektronenbedarf Diels-Alder-Cycloaddition für Pretargeted PET Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Erfahren Sie die bioorthogonale inverse Elektronenbedarf Diels-Alder-Cycloaddition für präzises PET-Imaging von Kolorektalkarzinomen. Diese Methode ermöglicht hochkontrastreiche Tumordarstellungen bei deutlich reduzierter Strahlendosis.

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Die Autoren danken Prof. Ralph Weissleder, Dr. Pat Zanzonico und Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty für hilfreiche Gespräche und dem NIH für die Finanzierung (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

ETHIK STATEMENT: Alle beschriebenen In-vivo-Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt. 1. Synthese von Tz-Bn-NOTA <ol><li> In einem kleinen Reaktionsgefß löst man 7 mg NH 2 -Bn-NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) in 600 &amp; mgr; l NaHCO 3 Puffer (0,1 M, pH 8,1). Überprüfen Sie den pH-Wert der Lösung. Falls erforderlich, den pH-Wert der Lösung einzustellen, um 8.1 mit kleinen Aliquots von 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Füge das NH 2 -Bn-NOTA Lösung auf 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die Tz-NHS kann entweder trocken gewogen oder aus einer Stammlösung trockenem DMF oder DMSO (&lt;50 ul) hinzugefügt werden. </li><li> Ermöglichen die erhaltene Reaktionslösung für 30 min bei RT reagierenunter leichtem Rühren. </li><li> Nach 30 min reinigen Sie das Gerät mit Umkehrphasen-C18-HPLC-Chromatographie, um nicht umgesetztes NH 2 Bn-NOTA entfernen. Die NH 2 -Bn-NOTA kann bei einer Wellenlänge von 254 nm überwacht werden, während die Tz-NHS und Tz-Bn-NOTA werden am besten bei einer Wellenlänge von 525 nm überwacht. HINWEIS: Die Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC-Geräte-Setup jedes Labor (Pumpen, Säulen, Schläuche, etc.). Jedoch, um ein Beispiel zu präsentieren, wenn ein Gradient von 0: 100 MeCN / H 2 O (beide mit 0,1% TFA) bis 100: 0 MeCN / H 2 O über 25 min und einer Analysen 4,6 x 250 mm C18-Säule verwendet wird die Retentionszeiten von Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS und NH 2 -Bn-NOTA wird etwa 15 min, 16,5 min und 10 min, betragen. Das Produkt kann von den anderen Reaktionskomponenten entweder in einem einzigen Durchgang oder mehreren Durchläufen unter Verwendung einer semi-präparativen oder präparative C18-HPLC-Säule 1 H-NMR, anal, gereinigt werden.ytical HPLC und ESI-MS sind Methoden, die verwendet werden können, um die Reinheit des abgeschlossenen Tz-Bn-NOTA Vorläufer verifizieren. 11 </li><li> Frieren Sie die gesammelten HPLC Eluenten mit flüssigem Stickstoff. </li><li> Wickeln Sie das gefrorene Sammelröhrchen in undurchsichtigen Aluminiumfolie. </li><li> Das tiefgefrorene Sammelröhrchen in einer Gefriertrocknung Schiff O / N, um das HPLC mobilen Phase zu entfernen. </li><li> Lagern Sie das gereinigte Produkt (ein helles rosa Feststoff) im Dunkeln bei -80 ° C. Anmerkung: Dies ist eine akzeptable Anhaltepunkt in dem Verfahren. Die fertige Tz-Bn-NOTA Vorstufe für mindestens 1 Jahr unter diesen Bedingungen stabil. </li></ol> 2. Herstellung huA33-TCO Immunkonjugat <ol><li> In einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine 1 mg / ml (2,7 mM) Lösung von TCO-NHS in trockenem DMF. </li><li> In einem 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine 2 mg / ml (13,3 &amp; mgr; M) Lösung von huA33 in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (0,01 M PO 4 3-, </sub&gt; 0,154 M NaCl). </li><li> Mit Hilfe von kleinen Aliquoten (&lt;5 &amp; mgr; l) von 0,1 M Na 2 CO 3, pH-Wert der Antikörperlösung auf 8,8-9,0 einzustellen. Verwenden Sie entweder pH-Papier oder ein pH-Meter mit einer Mikroelektrode, um den pH-Wert zu überwachen und darauf achten, nicht, damit der pH-Wert auf pH-Wert über 9,0 steigen. </li><li> Nachdem die Antikörperlösung in der richtigen pH, einen Volumen der TCO-NHS-Lösung entsprechend 8 Moläquivalente des aktivierten Esters. Fügen Sie beispielsweise 7,9 ul der 1 mg / ml TCO-NHS-Lösung (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) an die 1 ml 2 mg / ml huA33 Antikörperlösung (1,33 x 10 -8 mol huA33). 5% DMF nicht überschreiten Volumenkonzentration in der Lösung. </li><li> Vorsichtig mischen Sie die Lösung durch Invertierung der Mikrozentrifugenröhrchen mehrmals. </li><li> Wickeln Sie das Reaktionsgefäß in undurchsichtigen Aluminiumfolie. </li><li> Lassen Sie die Lösung für 1 h bei RT unter leichtem Rühren inkubiert. </li><li> Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur, reinigen das resultierende Immunkonjugat mit einem abgepackten Einweg size Ausschluss Entsalzungssäule. Zuerst spülen Sie die Größenausschlusssäule, wie vom Hersteller beschrieben, welche die über die Spalte vorhanden Konservierungsmittel während der Lagerung zu entfernen. Fügen Sie dann das Reaktionsgemisch auf die Größenausschlusssäule, spülen Sie die Säule mit 1,5 ml 0,9% steriler Kochsalzlösung, und anschließend das Produkt mit 2 ml 0,9% steriler Kochsalzlösung als Laufmittel zu sammeln. HINWEIS: Dieser Schritt wird das fertige huA33-TCO als 2 ml Lösung zu erhalten. </li><li> Messung der Konzentration des resultierenden huA33-TCO auf einem UV-Vis-Spektrophotometers. </li><li> Wenn eine höhere Konzentration gewünscht wird, konzentrieren den huA33-TCO-Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off. HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass, während huA33 und eine Vielzahl von anderen bekannten Antikörpern (zB Bevacizumab, Trastuzumab, Cetuximab und J591) sind sehr tolerant gegenüber, die konzentriert, Aggregation und Präzipitation kann nach Konzentration in anderen Fällen auftreten. Forscher versuchen diese procedure mit einem neuen Antikörper sollte die Literatur oder ihrer eigenen Kenntnisse des fraglichen Antikörpers mit Bezug darauf, ob oder nicht, um den Antikörper zu konzentrieren vertrauen. </li><li> Lagern Sie das ausgefüllte huA33-TCO Immunkonjugat bei 4 ° C im Dunkeln. Anmerkung: Dies ist eine akzeptable Anhaltepunkt in dem Verfahren. Die fertige mAb-TCO-Konjugat sollte für mindestens 3 Monate unter diesen Lagerbedingungen stabil sein. </li></ol> 3. 64 Cu Radiomarkierung von Tz-Bn-NOTA Hinweis: dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte - oder bei anderen Arbeiten mit Radioaktivität - Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle möglichen Maßnahmen, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren. <ol><li> In einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten Sie eine 0,5 mg / ml (723 &amp; mgr; M) Lösung von Tz-Bn-NOTA. </li><li> In einem 1,7 ml MicroCentrifuge Rohr, mit 10 ul des Tz-Bn-NOTA Lösung (5 ug) und 400 ul 0,2 M NH 4 OAc, pH 5,5-Puffer. </li><li> Im Interesse einer ordnungsgemäßen radiochemische Hinweis Haltung, Messung und Aufzeichnung der Menge an Radioaktivität in der Probe unter Verwendung einer Dosiskalibrator vor und nach den folgenden Schritten in der folgenden Protokoll (3,4-3,8). Dies wird mit der genauen Bestimmung der radiochemischen Ausbeuten helfen. </li><li> In 2000 &amp; mgr; Ci (74 MBq) von 64 Cu auf die Tz-Bn-NOTA Lösung. HINWEIS: In der Regel wird [64 Cu] CuCl 2 in einem kleinen Volumen (&lt;30 ul) 0,1 N HCl zugeführt wird, und damit nur geringe Mengen (&lt;10 ul) dieser Stammlösung werden für die Radiomarkierungsreaktion benötigt. Wenn größere Mengen des [64 Cu] CuCl 2 Lager benötigt werden, ist der Radiomarkierungsreaktion tolerant Erhöhung der Gesamtreaktionsvolumen. Jedoch sollte der pH-Wert der Radiomarkierungsreaktion Lösung sorgfältig überwacht, um sicherzustellen,dass er nicht unter pH 4,0 fallen. </li><li> Die Lösung wird für 10 min bei RT unter leichtem Rühren inkubiert. </li><li> Nach 10 min Inkubation, reinigen Sie das Gerät mit Umkehrphasen-C18-HPLC-Chromatographie. Die Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC-Geräte-Setup jedes Labor (Pumpen, Säulen, Schläuche, etc.). Jedoch, um ein Beispiel zu präsentieren, wenn ein Gradient von 5:95 MeCN / H 2 O (beide mit 0,1% TFA) bis 95: 5 MeCN / H 2 O über 15 min verwendet wird, die Rückhaltezeit von 64 Cu-TZ Bn-NOTA sollte etwa 9,8 min, während freie, nicht komplexierte Cu 64 wird mit der Lösungsmittelfront bei etwa 2-4 min zu eluieren. </li><li> Mit einem Rotationsverdampfer, entfernen Sie die HPLC Eluenten. </li><li> Abgeblasen, und der 64-Cu Tz-Bn-NOTA Produkt in 0,9% steriler Kochsalzlösung. HINWEIS: In Anbetracht der 12,7 hr physikalische Halbwertszeit von 64 Cu, ist dies kein akzeptables Anhaltepunkt in dem Verfahren. Führen Sie die Synthese von 64 Cu-Tz-Bn-NICHTEin unmittelbar vor der Injektion des Radioliganden, und folgt nach Schritt 3.7 Schritt 4.5. </li></ol> 4. In Vivo Pretargeted PET Imaging HINWEIS: Wie in Protocol Abschnitt 3, wird dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle möglichen Maßnahmen, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren. <ol><li> In einem weiblichen athymischen nackten Maus, subkutan Implantat 1 x 10 6 SW1222 Kolorektalkrebszellen und ermöglichen, dass diese in einem 100-150 mm 3 Xenograft (9-12 Tage nach der Beimpfung) wachsen. 11 </li><li> Ein Aliquot des huA33-TCO-Lösung von Protocol Abschnitt 2 auf eine Konzentration von 0,5 mg / ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung. </li><li> Injizieren 200 ul der huA33-TCO-Lösung (100 &amp; mgr; g) in die Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Mäusen. </li><li> Lassen Sie 24 Stunden für die Akkumulation des huA33-TCO im Tumor der Maus. </li><li> Verdünne die 64 Cu-Tz-Bn-NOTA Radioligand in einer Konzentration von 1,5 mCi / ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung. </li><li> Injizieren 200 ul des 64 Cu-Tz-Bn-NOTA Radioligand-Lösung (300 &amp; mgr; Ci; 11,1 MBq; 1,6 nmol von 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, unter der Annahme einer spezifischen Aktivität von 6,7 MBq / nmol) in die Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Mäusen. </li><li> An der gewünschten Abbildungs ​​Zeitpunkt (zB 2, 6, 12, oder 24 Stunden nach der Injektion), betäuben die Maus mit einer 2% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Bett des Kleintier-PET-Scanner. Aufrechterhaltung einer Narkose bei der Untersuchung mit einem 1% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch. Vor Inbetriebnahme des Tieres auf das Scanner-Bett, überprüfen Anästhesie mit dem Zehe-Pinch-Methode und wenden Tier Salbe auf den Augen der Maus, um das Trocknen während der Narkose zu verhindern. </li><li> Erwerben Sie die PET-Daten für die Maus über einen statischenScannen mit einem Minimum von 20 Millionen koinzident Ereignisse unter Verwendung eines Energiefensters von 350-700 keV und eine Koinzidenzzeitfenster von 6 nsec. Nach Abschluss der Akquisition des Bildes, darf die Maus nicht unbeaufsichtigt zu lassen, und stellen Sie sie nicht in einem Käfig mit anderen Mäusen, bis sie wieder zu sich kam. </li></ol>

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<li>Carrasquillo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li>
<li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li>
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<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li>
<li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der Hauptvorteil dieser pretargeted PET Strategie ist, dass es in der Lage ist die Abgrenzung von Tumoren mit Ziel-zu-Hintergrund-Bildkontrast bei nur einem Bruchteil der direkt markierten Antikörpern produziert Hintergrund Strahlungsdosis. Zum Beispiel wird in dem hier beschriebenen Darmkrebs Abbildungssystem, Daten von akuten Bioverteilung Experimente wurden verwendet, um die Dosimetrie Berechnungen für die 64 Cu-Basis Pretargeting Strategie zusammen mit direkt markiertem 64 Cu-NOTA-huA33 und <su...

Im Laufe der letzten dreißig Jahre, Positronenemissionstomographie (PET) ist ein unverzichtbares klinisches Werkzeug bei der Diagnose und Behandlung von Krebs. Antikörper werden seit langem als vielversprechende Vektoren für die Abgabe von Positronen emittierende Radioisotope zu Tumoren durch ihre vorzügliche Affinität und Spezifität für-Biomarkern. 1,2 jedoch die relativ langsame in vivo pharmakokinetischen Eigenschaften von Antikörpern sieht die Verwendung von Radioisotopen mit mehrtägiges physikalische Halbwertszeiten. Im Gegensatz zu Teilkörper-CT-Scans - - in Energiedosen in jedem Teil des Körpers Ergebnis Diese Kombination kann hohe Strahlendosen auf die Nichtzielorgane von Patienten, eine wichtige Komplikation, die von besonderer klinischer Bedeutung ist, da Radioimmunkonjugate intravenös injiziert und damit ergeben unabhängig von den abgefragten Geweben. Um dieses Problem zu umgehen, hat erhebliche Anstrengungen unternommen worden, um die develo gewidmetpment der PET-Bildgebung Strategien, die die Radioisotops und der Targeting-Einheit zu entkoppeln, wodurch die Nutzung der vorteilhaften Eigenschaften von Antikörpern und gleichzeitig Sockel ihrer intrinsischen pharmakokinetischen Einschränkungen. Diese Strategien - am häufigsten genannt Pretargeting oder mehrstufige Targeting - typischerweise vier Schritte: (1) die Verabreichung eines Antikörpers, der zur Bindung sowohl ein Antigen und ein Radioligand; (2) die Anreicherung des Antikörpers in das Zielgewebe und seine Clearance aus dem Blut; (3) die Verabreichung eines kleinen Moleküls Radioligand; und (4) die in vivo-Ligation des Radioliganden an den Antikörper, gefolgt durch die schnelle Clearance von überschüssigem Radioligand. 3-8 In einigen Fällen kann ein zusätzlicher Klärungsmittel zwischen den Schritten 2 und 3, um die Ausscheidung von jedem Antikörper beschleunigen spritzt Dazu ist es noch, den Tumor zu binden und im Blut bleibt. 5 Im Großen und Ganzen two Arten von Pretargeting Strategien sind besonders häufig in der Literatur. Während beide erfolgreich in präklinischen Modellen nachgewiesen, sie besitzen auch Schlüssel Einschränkungen, die ihre klinische Anwendbarkeit behindert haben. Die erste Strategie beruht auf der hohen Affinität zwischen Streptavidin-konjugierte Antikörper und Biotin-modifizierten Radiomarkierungen; jedoch die Immunogenität der Streptavidin-modifizierten Antikörper erwies sich eine beunruhigende Problem hinsichtlich der Übersetzung sein. 5,6,9,10 Die zweite Strategie, die im Gegensatz dazu verwendet bispezifischen Antikörpern, die genetisch manipuliert wurden, um sowohl eine Krebs binden Biomarker Antigen und ein kleines Molekül radiomarkierten Haptens. 3,11-14 Während dieser letztere Weg ist sicherlich kreativ, wird ihre breite Anwendbarkeit durch die Komplexität, die Kosten und die fehlende Modularität des Systems begrenzt. In letzter Zeit entwickelt und veröffentlicht eine pretargeted PET Methodik, die auf dem inversem Elektronenbedarf Diels-Alder (I wirEDDA) Cycloaddition zwischen trans -Cycloocten (TCO) und Tetrazin (Tz;. Abbildung 1) 11 Während der Reaktion selbst ist seit Jahrzehnten bekannt, hat IEDDA Chemie eine Renaissance in den letzten Jahren als Klick-Chemie Biokonjugation Technik erlebt, wie dargestellt die faszinierende Arbeit der Gruppen von Ralph Weissleder, Joseph Fox und Peter Conti unter anderem. 12-15 Die IEDDA Cycloaddition wurde in einer Vielzahl von Einstellungen angewendet wurden, einschließlich Fluoreszenz-Imaging mit Peptiden, Antikörpern, und Nanopartikel sowie die nuklearmedizinische Bildgebung . mit beiden Radiohalogene und Radiometalle 16-26 Die Ligation ist ertragreiche, saubere, schnelle (k 1&gt; 30000 M -1 s -1), selektiver und - entscheidend -. bioorthogonale 27 Und während eine Reihe von Arten von Klick-Chemie - einschließlich Cu-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition, spannungskatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition und Staudinger ligtionen -. sind bioorthogonale als gut, es ist die einzigartige Kombination von schnellen Reaktionskinetik und Bioorthogonalität die IEDDA Chemie macht so gut geeignet, um Pretargeting Anwendungen in ganzen Organismen 28,29 In diesem Sinne ist es wichtig zu beachten, dass dem jüngsten Bericht von unserem Labors war nicht der erste, IEDDA Chemie Pretargeting gelten: der erste Bericht über pretargeted Bildgebung mit IEDDA entstand aus der Arbeit von Rossin, et al und enthielt eine SPECT Methodik unter Verwendung einer 111 In-markierten Tetrazin 30.. Wie wir oben diskutiert, hat der Pretargeting Methodik vier ziemlich einfachen Schritten (Abbildung 2). In dem Protokoll zur Hand, wird ein pretargeted Strategie für die PET-Bildgebung von Darmkrebs, der eine 64 Cu-NOTA-markierten Tetrazin Radioliganden und einem TCO-modifizierte Konjugat des Antikörpers huA33 beschäftigt beschrieben werden. Ist einer seiner gr jedoch letztendlich die Modularität dieser Methodikißt Vermögen als trans -Cycloocten Rest kann ein beliebiges nicht-internalisierenden Antikörper angehängt werden, und das Tetrazin kann auf eine Vielzahl von radioaktiven Reporter befestigt werden.

<table><tbody><tr><td>Tetrazine NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764701</td><td>Store bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Trans-Cycloocten NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764523</td><td>Lagern bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>p-NH2-Bn-NOTA</td><td>Makrozyklika</td><td>B-601</td><td>Bei -80 > lagern C</td></tr></tbody></table>

die nutzung der bioorthogonale inversem elektronenbedarf diels-alder-cycloaddition für pretargeted pet imaging

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Aufgrund ihrer exquisiten Affinität und Spezifität sind Antikörper zu äußerst vielversprechenden Vektoren für die Abgabe von Radioisotopen an Krebszellen für die PET-Bildgebung geworden. Die Notwendigkeit, Antikörper mit Radionukliden mit langen physikalischen Halbwertszeiten zu markieren, führt jedoch häufig zu hohen Hintergrund-Strahlendosisleistungen für Nicht-Zielgewebe. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir eine zielgerichtete PET-Bildgebungsstrategie eingesetzt, die auf der Diels-Alder-Cycloadditionsreaktion mit inversem Elektronenbedarf basiert. Die Methodik entkoppelt den Antikörper von der Radioaktivität und nutzt so die positiven Eigenschaften von Antikörpern, während ihre pharmakokinetischen Nachteile vermieden werden. Das System besteht aus vier Schritten: (1) der Injektion eines mAb-trans-Cycloocten (TCO)-Konjugats; (2) eine Lokalisationszeitspanne, in der sich der Antikörper im Tumor ansammelt und aus dem Blut verschwindet; (3) die Injektion des radioaktiv markierten Tetrazins; und (4) die in vivo Click-Ligation der Komponenten, gefolgt von der Clearance des überschüssigen Radioliganden. In dem in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Beispiel wurden ein 64Cu-NOTA-markierter Tetrazin-Radioligand und ein trans-Cycloocten-konjugierter humanisierter Antikörper (huA33) erfolgreich verwendet, um SW1222-Darmkrebstumoren mit hohem Tumor-Hintergrund-Kontrast abzugrenzen. Darüber hinaus erzeugt die Pre-Targeting-Methode qualitativ hochwertige Bilder bei nur einem Bruchteil der Strahlendosis für Nicht-Zielgewebe, das durch Radioimmunkonjugate erzeugt wird, die direkt mit 64Cu oder 89Zr markiert sind. Letztendlich ist die Modularität dieses Protokolls einer seiner größten Vorteile, da die trans-Cycloocten-Einheit an jeden nicht-internalisierenden Antikörper angehängt werden kann und das Tetrazin an eine Vielzahl von Radioisotopen gebunden werden kann.

Die ersten drei Schritte des Experiments - die Synthese von Tz-Bn-NOTA, die Konjugation von TCO zu huA33 und der radioaktiven Markierung des Tz-Bn-NOTA konstruieren (Abbildungen 3 und 4) - sind sehr zuverlässig. Im Fall der oben beschriebenen Verfahren wurde die Tz-Bn-NOTA Konstrukt in hoher Ausbeute und Reinheit hergestellt. Die huA33 Antikörper wurde mit 4,2 ± 0,6 TCO / mAb modifiziert und Tz-Bn-NOTA wurde radioaktiv markiert und mit 64 Cu, um das gereinigte Radioligand in&...

Die bioorthogonale inverse Elektronennachfrage Diels-Alder-Cycloaddition wurde genutzt, um eine effektive und modulare prägezielte PET-Bildgebungsstrategie für Krebs zu entwickeln. In diesem Protokoll werden die Schritte dieser Methodik im Kontext eines Modellsystems beschrieben, das den auf Darmkrebs abzielenden Antikörper huA33 und einen 64-Cu-markierten Radioliganden verwendet.

Die Nutzung der Bioorthogonale inversem Elektronenbedarf Diels-Alder-Cycloaddition für Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Krebsgewebe mithilfe einer bioorthogonalen Reaktion zwischen Tetrazin und trans-Cyclooctin für die PET-Bildgebung vorab anzusteuern. Dies wird erreicht, indem einem tumortragenden Mäuschen ein mit trans-Cyclooctin markierter Antikörper verabreicht wird, gefolgt von einer Intervallphase, in der sich der Antikörper langsam am Tumor anreichert und gleichzeitig aus dem Blut eliminiert wird. Anschließend wird ein radioaktives Tetrazin-Ligand in dasselbe Tier injiziert.Der Radioligand bindet an den mit TCO markierten Antikörper am Tumor, und da es sich um ein kleines Molekül handelt, wird es rasch aus dem Blut eliminiert. Die resultierende PET-Bildgebung an Kleintieren zeigt eine klare Abgrenzung des Tumors mit hohem Kontrast und hohen Tumor-zu-Hintergrund-Aktivitätsverhältnissen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie der PET-Bildgebung mit direkt markierten Antikörpern liegt darin, dass sie hochkontrastreiche Bilder liefert, die nur einen Bruchteil der Strahlendosis für den Patienten erfordern.Die Implikationen dieser Technik reichen bis in die Therapie hinein, da Prä-Targeting-Verfahren sehr hohe Strahlendosen gezielt an Tumore abgeben können, während gleichzeitig die Dosen, die gesunden Organen und gesundem Gewebe zugeführt werden, sehr gering sein werden. Ich werde diese Technik gemeinsam mit Catherine Kaza, einer Technikerin in unserem Labor, demonstrieren. Die Synthesereaktion beginnt damit, sieben Milligramm NH₂-BN-Notta in 600 Mikrolitern 0,1-molarer Natriumbicarbonatlösung bei einem pH-Wert von 8,1 zu lösen.Überprüfen Sie den pH-Wert und verwenden Sie gegebenenfalls kleine Aliquote von 0,1-molarer Natriumcarbonat-Lösung, um den pH-Wert auf 8,1 einzustellen. Geben Sie anschließend diese Lösung zu 0,5 Milligramm TZ NHS in einem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Lassen Sie diese Reaktion für eine halbe Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.Der TZ NHS-Stammlösung kann nach einer halben Stunde in DMF oder DMSO gelöst werden. Reinigen Sie das Produkt mittels Umkehrphasen-C 18 HPLC, um das inaktive NH two BN notta zu entfernen, das bei 254 Nanometern nachweisbar ist. Die Überwachung von TZ NHS und TZ BN Notta erfolgt am besten bei 525 Nanometern.Die Retentionszeit der Probe variiert je nach Gerät; bei Verwendung eines Acetonitril-Wasser-Gradienten von 0 auf 100, dann 100 auf 0 über 25 Minuten und einer analytischen C18-Säule mit 4,6 × 250 Millimetern betragen die Retentionszeiten für die drei Verbindungen jeweils 16,5, 15 und 10 Minuten. Gefrieren Sie das gesammelte HPLC-Fraktion in flüssigem Stickstoff ein und umwickeln Sie das Röhrchen anschließend mit undurchsichtigem Folienband. Stellen Sie das gefrorene Röhrchen nun in ein lyophilisiertes Gefäß und setzen Sie es über Nacht auf einen Gefriertrockner.Um die HPLC-Mobilphase zu entfernen und die Reinheit des fertigen TZ-bn-no-top-Vorläufers zu überprüfen, verwenden Sie die protonen-NMR-analytische HPLC und/oder die ESI-Massenspektrometrie. Beginnen Sie diese Reaktion, indem Sie eine 2,7 Millimolarlösung von T-C-O-N-H-S in DMF in einem Mikrozentrifugenröhrchen herstellen; in einem zweiten Mikrozentrifugenröhrchen bereiten Sie eine Lösung von zwei Milligramm pro Milliliter HUA 33 in einem Milliliter PBS pH 7,4 vor.Danach den pH-Wert der Lösung unter Verwendung kleiner Zugaben von 0,1 molarem Natriumcarbonat auf einen Wert zwischen 8,8 und 9,0 einstellen, jedoch nicht höher. Anschließend ein Volumen von T-C-O-N-H-S zugeben, das acht molaren Äquivalenten des aktivierten Esters entspricht. Die Lösung vorsichtig durch mehrmaliges Umkippen mischen und mit Aluminiumfolie umwickeln.Stellen Sie dann das Gefäß für etwa eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren zur Inkubation. Nach einer Stunde reinigen Sie das Immunkonjugat aus der Reaktion mithilfe einer vorgefertigten, Einweg-Desaltingsäule zur Größenausschlusschromatographie. Geben Sie ein Milliliter Reaktionsgemisch auf die Säule und anschließend 1,5 Milliliter sterile Kochsalzlösung (0,9 %).Eluieren Sie dann das humanisierte HUA 33 TCO-Produkt mit zwei Millilitern 0,9 %iger Kochsalzlösung. Messen Sie die Konzentration des Produkts mit einem UV-Vis-Spektrometer. Falls die Konzentration niedriger als gewünscht ist, konzentrieren Sie das Produkt mit einem Zentrifugalfilter mit einer Molekularmasse von 50.000.Bereiten Sie zunächst eine 0,5 Milligramm pro Milliliter Lösung von TZ BN notta in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor. In einem zweiten Mikrozentrifugenröhrchen geben Sie 10 Mikroliter der hergestellten TZ BN Notta-Lösung zu 400 Mikrolitern 0,2-molarer Ammoniumacetat-Pufferlösung mit pH 5,5 hinzu. Achten Sie darauf, die Menge der Radioaktivität Ihrer Probe vor und nach jedem der folgenden Schritte zu messen und zu dokumentieren.Dies ist entscheidend für die genaue Berechnung der radiochemischen Ausbeute und die Dokumentation. Geben Sie nun 2000 Mikrocurie Kupfer-64 zu der TZ-BN-Notta-Lösung hinzu. Inkubieren Sie dieses Gemisch 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.Zur Reinigung des Produkts verwenden Sie eine umgekehrte Phase C18-HPLC und verdünnen die Produkte mit einem fünf zu 95 bis 95 zu fünf Acetonitril zu Wasser-Gradienten über 15 Minuten mit 0,1 % TFA. Die radioaktiv markierte tz, BN nota eluiert nach 9,8 Minuten, während das freie Kupfer-64 mit der Laufmittel-Front nach zwei bis vier Minuten eluiert. Nach der Entfernung des HPLC-Elutionsmittels mittels Rotationsverdampfer wird das radioaktiv markierte Produkt in 0,9 % steriler Kochsalzlösung gelöst und das Produkt anschließend so bald wie möglich verwendet. Dieses Verfahren beginnt mit der Verdünnung eines Eloqua der hergestellten HEA-33-TCO-Lösung auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter in 0,9 % steriler Kochsalzlösung.Injizieren Sie dann 200 Mikroliter der Lösung in die Schwanzvene der mit dem Xenotransplantat beladenen Maus. Lassen Sie den humanisierten a33 TCO 24 Stunden lang zirkulieren und sich im Tumor anreichern. Nach 24 Stunden verabreichen Sie das mit Kupfer-64 markierte TZ-BN-Notta in einer Konzentration von 1,5 MILLCURIE pro Milliliter in 0,9 % steriler Kochsalzlösung.Verabreichen Sie dann 200 µL der hergestellten Radioligandenlösung zum gewünschten Zeitpunkt per Injektion in die Schwanzvene an die Maus. Betäuben Sie die Maus und platzieren Sie sie auf der Untersuchungsliege eines Kleintier-PET-Scanners. Die Anästhesie sollte über eine Nasenkonnektionsvorrichtung aufrechterhalten werden, und der anästhetisierte Zustand sollte durch einen Zehenquetschtest bestätigt werden.Um außerdem Austrocknung zu verhindern, eine dünne Schicht Augensalbe auftragen. Nun die Tierdaten mittels einer statischen Aufnahme mit 60 Millionen Koinzidenzereignissen bei 350 bis 700 Kiloelektronenvolt und einer Koinzidenzzeit von sechs Nanosekunden erfassen. Nach der Bildgebung warten, bis die Maus das Bewusstsein wiedererlangt, bevor sie in ihren Käfig zurückgebracht wird, möglicherweise zusammen mit anderen Mäusen. Eine thymische Nude-Maus trägt ein SW-1222-Kolonkarzinom, das das 33-Antigen exprimiert.Xenotransplantate wurden mit dem beschriebenen Protokoll untersucht. Sowohl die akute Biodistribution als auch die PET-Bildgebung zeigen, dass die Prätargeting-Strategie in der Lage ist, das kolorektale Krebs-Xenotransplantat mit hervorragendem Bildkontrast und hohen Tumor-zu-Hintergrund-Aktivitätsverhältnissen abzugrenzen. Im Laufe mehrerer Stunden wird der Radioligand über den Kot ausgeschieden, und die Tumor-zu-Hintergrund-Aktivitätsverhältnisse werden sehr hoch.Einige Variablen bei diesem Prä-Targeting-Ansatz mussten optimiert werden, wie dies bei jeder Bildgebungsstrategie erforderlich ist. Die Gabe von 300 Mikrogramm Antikörper-TCO-Konjugat anstelle von 100 Mikrogramm führte zu einer erhöhten Radioaktivität, die im Herzen der Maus sichtbar war; ebenso die Verkürzung des Intervalls von 24 auf 12 Stunden. In beiden Fällen erfolgte die Click-Reaktion jedoch weiterhin am Tumor, was durch die tumorale Aufnahme zu frühen Zeitpunkten deutlich veranschaulicht wird.Jedoch findet die Click-Reaktion eindeutig auch im Blut statt, was nicht erwünscht ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens muss ein empfindliches Gleichgewicht aller Vorabziel-Variablen erreicht werden. Es ist sehr wichtig, dass die Masse des TCO-Immunkonjugats sowie das Zeitintervall zwischen den Injektionen optimiert werden.Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit Radioaktivität äußerst gefährlich sein kann, und während des Experiments Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter PSA und die ständige Abschirmung der Strahlung getroffen werden sollten.

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Biotechnik

Dieses Video beschreibt die Technik der präzielgerichteten Radioimmuntherapie oder PRIT, bei der Immunkonjugate gefolgt von Radioliganden zur Behandlung von Tumoren verabreicht werden. Diese Radioimmuntherapie reduziert die Strahlendosis für gesundes Gewebe und verwendet Radionuklide mit sehr geringen Halbwertszeiten, die mit antikörperbasierten Vektoren inkompatibel sind.

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