Name: Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Erfahren Sie, wie Demyelinisierung und Remyelinisierung im Mausrückenmark durch fokale Lysolecithin-Injektion untersucht werden. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Reparaturmechanismen und dient als präklinisches Screening-Tool für therapeutische Ansätze.

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Dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss der Multiple Sclerosis Society of Canada und des Alberta Innovates - Health Solutions CRIO Team Programms finanziert. MBK ist Empfänger von Stipendien von Alberta Innovates - Health Solutions und der Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ wird durch ein Stipendium zur Unterstützung von Doktoranden des Alberta endMS Regional Research and Training Center der Multiple Sclerosis Society of Canada finanziert. Die Autoren danken Dr. Jan van Minnen und der Regenerationseinheit in der Neurobiologie für die Ausbildung und den Gebrauch der Geräte.

HINWEIS: Die in diesem Verfahren verwendeten Tiere wurden gemäß dem Canadian Council on Animal Care (CCAC) Richtlinien betreut. Ethik wurden von der Animal Care Committee der University of Calgary zugelassen. 1. Bereiten Sie Spritze zur Injektion <ol><li> Löse Lysolecithin auf eine 1% ige Lösung in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; pH 7.4) aufgenommen und bei -20 ° C in kleinen Aliquots (75 ul). Tauwetter ein Fläschchen auf RT. HINWEIS: Wenn Lysolecithin ungelöst, beschallen das Rohr in einem Ultraschallreiniger (40 kHz) für ungefähr 30 min, um eine einheitliche Lösung zu bilden. </li><li> Gehen Sie mit dem Pre-gezogen Glaskapillare mit äußerster Vorsicht, um eine Beschädigung der empfindlichen Spitze. Die Mutter einer 10 ul Injektion Spritze abschrauben und ziehen Sie ihn auf den flachen Ende der Kapillare, gefolgt von 2 Aderendhülse, sicherzustellen, dass die passenden Enden der Ferrulen ausrichten und die Kapillare ist gemütlich in der konischen Hülse (Abbildung 1). Spülen Sie die Spritze mit isopropyl Alkohol und nehmen Sie den Kolben. Nach dem Trocknen, schrauben Sie die Nadelanordnung handfest auf die Injektionsspritze. </li><li> Befestigen Sie die Metallnabe Nadel auf die Grundierung Spritze. Pierce eine Gummischeibe mit der Nadel und schieben Sie sie bis auf den Grund. Füllen Sie die Spritze mit Grundierung Lysolecithin. Der Entlüftungs Spritze leicht drücken bis Flüssigkeit an der Spitze der Nadel sichtbar wird. Dies stellt sicher, Luftblasen nicht in die Injektionsspritze eingeführt werden. </li><li> Legen Sie die Metall-Hub Nadel der Spritze in die Grundierung Injektionsspritze. Einen festen Dichtung mit der Gummischeibe, langsam die Grundierung Spritze drücken, bis die Kapillare füllt bis zur Spitze mit Lösung. Entfernen Sie vorsichtig die Grundierung Spritze und gleichzeitig gedrückt, um den Lauf der Injektionsspritze, ohne dabei Luftblasen zu füllen. Legen Sie den Kolben in die Injektionsspritze und sicherzustellen Lösung fließt von der Spitze der Kapillare, wenn der Kolben sanft gedrückt wird. HINWEIS: Wenn Luftblasen in der Kappe zu sehen sindIllary oder Injektionsspritze, muss die Spritze Herstellung von Anfang an wiederholt werden. Kontinuierliche Fluid in der Einspritzvorrichtung ist kritisch, um genaue Injektionsvolumina sicherzustellen. </li><li> Das ausgefüllte Injektionsspritze auf dem Arm eines stereotaktischen Mikromanipulator. Dies vervollständigte Vorrichtung in der Lage, 15-20 Tiere benötigen, bevor neu befüllt werden injizieren. </li><li> Entsorgen Sie die Rest Lysolecithin aus der Grundierung Spritze. Zurückziehen und mehrmals drücken Isopropylalkohol, und nehmen Sie den Metallnabe Nadel. Warten Sie einige Stunden für den Rest Isopropyl-Alkohol in der Grundierung Spritze vor dem erneuten Befüllen verdampfen. </li></ol> 2. Bereiten Tier für Operationsverfahren Hinweis: Dieses Verfahren ist für die weibliche C57BL / 6-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen beschrieben. <ol><li> Betäuben des Tieres mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (200 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) oder pro Institutional Animal Care Vorschriften. Plan für dieTier unter Narkose für ca. 1 Stunde, wenn mit injizierbaren Anästhesie. </li><li> Testen Sie, ob das Tier tief durch festes Einklemmen des Fußes betäubt. Ein richtig anästhesiert Tier nicht auf die Pinch reagieren. </li><li> Mit Knipser, rasieren eine 2-3 cm 2 Fläche auf der Rückenseite des Tieres, in der Nähe der Ohren. Achten Sie darauf, das Gehör beschädigen. </li><li> Wischen Sie den Bereich mit 70% Ethanol auf eine Gaze aufgebracht. Stellen Sie sicher, alles abgeschnitten Haare aus dem Bereich entfernt wurde. Desinfizieren Sie den Bereich mit Jod. </li><li> Vaseline in die Augen, um das Trocknen während des Verfahrens zu verhindern. </li><li> Halten Sie das Tier in einem beheizten Rückgewinnungskammer bis bereit, das Verfahren zu beginnen. </li></ol> 3. Führen Sie die Operationsverfahren HINWEIS: Für angemessene aseptische Technik für alle Schritte des Verfahrens. Dazu gehören die ordnungsgemäße Verwendung von Handschuhen, Haarnetze, Masken und Vorhänge. Alle Werkzeuge sollten, bevor er in contac sterilisiert werdent mit dem Tier. <ol><li> Bewegen Sie das Tier an einen stereotaktischen Rahmen, bis Rückenseite, erhöht in der Mitte Abschnitt von gefalteten Papierhandtücher, um die Krümmung der Wirbelsäule zu übertreiben. Befestigen Sie die Arme und Schwanz mit chirurgischen Band und sichern Sie den Kopf mit einer Zahnklammer. Stabilisierende Ohr Bars sind nicht notwendig für dieses Verfahren. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 3 cm Mittelschnitt zu machen, beginnend direkt unter den Ohren und Schneiden in der kaudal. </li><li> Suchen Sie die Kluft zwischen den 2 großen adipösen Strukturen und benutzen feinen Pinzette in jeder Hand, um diese auseinander zu ziehen. Verbreiten Sie Retraktoren auf das Operationsfeld zu öffnen. </li><li> Unter einem Operationsmikroskop, suchen Sie die prominente Auswuchs Prozess des T2 Wirbel (Hinweis: Diese Funktion ist charakteristisch für den C57BL / 6-Maus-Stamm). Führen Sie eine stumpfe Dissektion mit geschlossener Frühjahr Schere durch die Überlagerung der Muskulatur, um besser zu visualisieren T2. Mit der Pinzette, fühlen für den harten Oberflächen von T3 und T4 die richtige anatomische Lage zu bestätigen. </li><li> Mit Federschere, machen flache seitliche Schnitte (2-3 mm tief) des Bindegewebes zwischen T3 und T4. Aufgrund der natürlichen Abstand zwischen den Wirbeln in der oberen Brustabschnitt der Maus Wirbelsäule ist eine Laminektomie nicht notwendig, offenbaren das Rückenmark. Denken Sie, dass zu tief ein Schnitt wird durchstoßen und beschädigen Sie das Kabel. HINWEIS: Ein kleiner Grad der Blutung ist bei diesem Schritt gemeinsam. Wenn dies geschieht, halten Sie einen Schwamm Speer in den Bereich, bis die Blutungen Subventionen (30-60 s). </li><li> Visualisieren Sie das Rückenmark. Es wird mit einer dicken Schicht aus sichtbar Dura abgedeckt werden, wenn diese Hirnhautschicht wurde noch nicht geschnitten, gleichzeitig jedoch das Kabel. Ein prominenter Blutgefäß läuft Schwanz / rostral durch die ungefähre Mittellinie des Rückenmarks. HINWEIS: Diese Gefäßsystem sollte nicht als ein Wahrzeichen für die Mittellinie verwendet werden. Stattdessen sollte eine ausreichende Beleuchtung der grau-weiße Angelegenheit Grenzen flankieren den dorsalen Säule zu offenbaren, und diese sollten verwendet werden, um die Mittellinie zu schätzen. </li><li> Wenn der Durableibt erhalten, stellen sanfte seitliche Schrammen mit einer 32 G Metallnadel, bis es gelöscht wird. Ziel ist es, die Dura zu entfernen, während nicht schneiden Sie die verbleibenden zugrunde liegenden Hirnhäute, die nicht so dick und schwerer zu finden sind. HINWEIS: Freisetzung von Liquor eine Verletzung der Arachnoidea und während dies ohne mechanische Schädigung des Gewebes auftreten, sollte die akkumulierte Cerebrospinalflüssigkeit mit einem Schwamm Lanze entfernt, um die Oberfläche des schnur besser sichtbar werden. </li><li> Bewegen Sie die Injektionsspritze an Ort und Stelle und langsam absenken, bis die Spitze der Kapillare gerade noch berührt das Rückenmark sofort seitlichen von beiden Seiten der Mittellinie. Verriegeln Sie den Arm in Position. </li><li> Verwenden Sie die abgestufte Messungen der Z-Richtung der stereotaktischen Arm um eine Grundlinie Positionsmessung zu machen. Von diesem Messwert, subtrahieren 1,3 mm. Verwenden Sie eine schnelle und flache Abwärtsbewegung, um das Gewebe zu durchdringen und dann lassen Sie das kapillare, bis die neue Messung erreicht ist. Optional: wenn gewünscht,Läsionen in der dorsalen Säule kann durch das gleiche Stechbewegung an der Mittellinie und einer Tiefe von 0,3 mm (siehe Diskussion für weitere Informationen) erzeugt werden. ANMERKUNG: Diese Werte spezifisch für Injektion zwischen T3 und T4. Wenn die Entscheidung, um die Injektion an irgendeiner anderen Stelle in der Wirbelsäule durchzuführen, müssen diese Werte von allen verfügbaren Mausgehirnatlas abgeleitet werden. </li><li> Verwenden Sie die Mikromanipulator in der ventralen Rückenmark weißen Substanz drücken Lysolecithin. Make 1 Drehung der Mikromanipulator alle 5 Sekunden 2 Minuten, was zu einem Endvolumen von 0,5 &amp; mgr; l. Verlassen Sie die Kapillare in Platz für 2 weitere Minuten, um Rückfluss von Lösung zu verhindern, und dann vorsichtig die Kapillare. </li><li> Binden Sie einen einzigen Faden in der Überlagerung der Wirbelsäule Muskel / Fettgewebe. Verwenden Sie eine nicht-Knopfnaht, um die Haut zu schließen. Anwenden mehr Jod Inzisionsstelle. </li><li> Legen Sie das Tier in einem beheizten Rückgewinnungskammer, bis sie wieder, dann wieder in seinem Käfig. Bewerben Analgetika post-operativ nach institutionellen Tierpflegevorschriften. Zusätzliche postoperative Pflege ist in der Regel nicht erforderlich, da die Tiere uneingeschränkt gehfähig und in der Lage, selbst Fress- und Trink, sobald sie aus der Narkose. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Tiere. HINWEIS: Mit Kompetenz, der Betrieb kann in 10-15 Minuten pro Tier vor allem mit Hilfe einer zweiten Person zu binden Nähten abgeschlossen sein. Das gleiche Glaskapillare können für ca. 15-20 Operationen verwendet werden, bevor die Spitze stumpf und muss ersetzt werden. Steueroperationen können identisch ausgeführt werden, wie beschrieben, mit einer Injektion von PBS in das Rückenmark statt Lysolecithin. Wir empfehlen nicht, die Reinigung der Kapillaren für die zukünftige Verwendung. </li></ol> 4. Die Gewebeverarbeitung und -analyse <ol><li> Opfern die Tiere mit einer intraperitonealen Dosis von Ketamin (500 mg / kg) und Xylazin (25 mg / kg) in gewünschten Zeitpunkten. Läsionen in der foll entwickeln typischerweiseaufgrund Weise: 1-3 Tage, aktive Demyelinisierung; 3-7 Tage, OPC-Einstellung; 7-10 Tage, Oligodendrozyten-Differenzierung; 10-21 Tage, aktiv Remyelinisierung 2,10,11. </li><li> Um Gewebe für die Histologie vorbereitet, zunächst eine transkardialer Perfusion 12 führen mit 20 ml RT PBS, gefolgt von 20 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd in PBS. Für die Herstellung von Harz eingebetteten Gewebe für halb- oder ultradünne Schnitte, siehe Schritt 4.9. </li><li> Entfernen Sie das Rückenmark mit gebogenen Knochen Schere, um durch die einzelnen Wirbel ab zervikalen Ende der Wirbelsäule und Arbeiten bis in den unteren Brust Ebene geschnitten. Fixieren die Rückenmark O / N in 4% Paraformaldehyd in PBS bei 4 ° C. Schalten Sie die Kabel auf 30% Saccharose in PBS bei 4 ° C für mindestens 72 Stunden. </li><li> Identifizieren der Injektionsstelle nach einer Anomalie auf der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks. Schneiden Sie ein 3 mm Gewebestück (mit der Injektionsstelle in der Mitte) und in cryomolds, die optimale Schnitttemperatur (OAT) co richten Sie die Stückempound. Hängen Sie die Unterseite der cryomolds in einem gekühlten Mischung aus 2-Methyl und Trockeneis, bis der Oktober vollständig gefroren ist. Bei -80 ° C bis zu seiner Sektion. </li><li> Abschnitt der Rückenmark auf einem Kryostaten bei einer Breite von 20 &amp; mgr; m auf Objektträgern und an der Luft trocknen O / N vor dem Speichern der Objektträger bei -20 ° C. </li><li> Detect Läsion Lage und Größe mit einem Eriochrom Cyanin histologische Fleck von Myelin 13. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur. Luft trocknen Folien für 30 min. Die Objektträger in Klärmittel für 1 min, gefolgt von Rehydratisierung in abgestuften Ethanollösungen (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, Wasser) für jeweils 1 min. <ol><li> Die Objektträger in Eriochrome Cyanin-Lösung für 15 min, gefolgt von einer 1 min mit Wasser gewaschen. Differenzieren in 0,5% Ammoniumhydroxid für 10 sec, gefolgt von einer 1 min mit Wasser gewaschen. Entwässern in abgestuften Ethanollösungen (in umgekehrter Reihenfolge wie oben beschrieben) für 1 min jeweils, Deckglas mit Montage Medien und Bild auf einer Hellfeld-mikop. </li></ol></li><li> Verwenden Sie die Immunhistochemie auf Axone und Myelin zu visualisieren. Luft trocknen Folien für 30 min. Entwässern mit abgestuften Ethanol (Wasser, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) für jede 2 Minuten bei Raumtemperatur und dann in umgekehrter Reihenfolge wieder zu Wasser. Dieser Schritt führt zu einer höheren Auflösung der einzelnen Ringe 14 Myelin. <ol><li> Blockieren nicht-spezifischer Antikörper-Wechselwirkungen unter Verwendung von 10% Ziegenserum und 0,25% Triton X-100 in PBS für 60 min bei RT. Verdünnte primäre Antikörper (Maus-anti-SMI312 1: 2.000 Kaninchen-Anti-MBP 1: 1000) in PBS und Inkubation auf Folien O / N bei 4 ° C. </li><li> Für 5 min mit PBS bei RT Waschen 5mal. Verdünnte sekundäre Antikörper (Alexa 488-Anti-Kaninchen 1: 500, Alexa 546-Anti-Maus 1: 500) in PBS und Inkubation auf Objektträgern für 60 min bei RT. Für 5 min mit PBS bei RT Waschen 5mal. Halterung gleitet mit Deckgläschen mit Gelvatol und Bild auf einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li><li> Immunhistochemie an Zellen des Oligodendrozyten-Linie sichtbar. Befolgen Sie die Anweisungen für step 4,7 Weglassen der Dehydratisierung / Rehydratisierung Schritt und unter Verwendung von 10% Pferdeserum anstelle von Ziegenserum. Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper Verdünnungen: Ziege-Anti-PDGFRα 1: 100, Maus-Anti-A1 1: 200, Kaninchen-Anti-Olig2 1: 200. Verwenden Sie die folgenden sekundären Antikörperverdünnungen: Alexa 488 Anti-Ziege 1: 500, Alexa 594-Anti-Maus 1: 500, Alexa 647-Anti-Kaninchen 1: 500. </li><li> Um Gewebe für halb- oder ultradünne Schnitte vorzubereiten, zuerst eine transkardialer Perfusion 12 führen mit 20 ml RT PBS, gefolgt von 20 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd / 1% Glutaraldehyd in PBS. Entfernen des Rückenmarks, wie in Schritt 4.3 beschrieben. Fix O / N in 4% Paraformaldehyd / 1% Glutaraldehyd in PBS bei 4 ° C. </li><li> Identifizieren Sie die Injektionsstelle, wie in Schritt 4.4 beschrieben. Schneiden Sie ein 1 mm Stück mit dem Gewebe der Injektionsstelle. Zusätzlich 1 mm Blöcke auf jeder Seite der Läsion, wenn gewünscht, hergestellt werden, sowie. </li><li> In einer Abzugshaube, fügen Sie das 10-fache Volumen 1% Osmiumtetroxid / 1,5% Kaliumferrocyanid auf jeden Block auf dem Eisfür 60 min. HINWEIS: Osmiumtetroxid ist eine hochgiftige Substanz, und sollte mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Alle Materialien, die in Kontakt mit Osmiumtetroxid sollte in Maisöl (das doppelte Volumen wie Osmiumtetroxid-Lösung) zur Neutralisation platziert werden. </li><li> Waschen Korden 3 mal mit 0,2 M Cacodylat 10 min bei RT, Verwerfen in Maisöl. Entwässern mit abgestuften Ethanollösungen (Wasser, 50%, 70%, 90%, 2-mal mit 95%, 2-mal mit 100% 2-mal mit Propylenoxid) für 10 Minuten bei RT. </li><li> Betten Sie Kabel in Harz nach Herstellerangaben. </li><li> Schneiden Blöcke auf einem Ultramikrotom und montieren Schnitte auf Wassertropfen auf Objektträgern. Objektträger auf eine heiße Platte (ca. 50 ° C) bis zur Trockne. </li><li> Visualisieren Myelin durch Zugabe einiger Tropfen von 1% Toluidinblau / 2% Borax-Lösung auf die Objektträger für 10-15 sec bei 50 ° C. Mit Wasser abspülen, trocken und Deckglas mit Montage Medien. Bildausschnitte auf einem Hellfeld-Mikroskop. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Eine Reihe von Tiermodellen wurden entwickelt, um MS, die meisten erkennbar der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) Modell zu studieren. In EAE sind Nagetiere gegen ein Fragment eines Myelin-Peptid und entzündlichen Läsionen Entwicklung manifestiert sich in aufsteigenden Lähmungen zu unterziehen. Während dieses Modell als hilfreich präklinische Prüfung von immunmodulatorischen MS Medikamente, ist es nicht ideal für das Studium Remyelinisierung aus drei Gründen: Erstens ist die Lage der entzündlichen Läsionen etwas zufällig, und Ortung Läsionen bei der Verarbeitung von Gewebe für die halb- oder ultradünnen Abschnitte kann eine Herausforderung sein. Der zweite ist, dass die Remyelinisierung tritt über einen bestimmten Zeitverlauf und die genaue Alter eines einzelnen EAE Läsion nicht ohne kontinuierliche nichtinvasive Magnetresonanztomographie bekannt sein. Das dritte ist, dass die Remyelinisierung ist ein natürlich auftretendes Phänomen in Nagetieren und der Nachweis Remyelinisierung nach Wirkstoffbehandlung in EAE kann ein primäres Ergebnis der Arzneimittel sein, aber inStatt ein sekundäres Phänomen der Verringerung der Entzündung. Ein anderes übliches Verfahren zur Herstellung von Demyelinisierung durch Einführen des Kupferchelatbildners Cuprizon in der Nahrung erzielt. Dies führt zu einer weit verbreiteten Demyelinisierung, insbesondere im Corpus callosum. Es gibt Beschränkungen bei der Untersuchung des Corpus callosum als Ort der Remyelinisierung aus den folgenden Gründen: Erstens Axon Durchmesser (und somit Myelindicke) kleiner sind als bei anderen ZNS-Regionen, und dadurch dünn remyelinated Scheiden können nicht von denen, die nie demyelinisierten waren sein. Zweitens, weil die Maus Balken enthält&gt; 70% marklosen Axonen 16, kann es nicht klar, ob ein remyelinated Segment gilt Reparatur geschädigter Myelin oder De-novo-Synthese Myelin im Erwachsenen, die in der Regel tritt auf, 17 sein. Es ist unsere Überzeugung, dass das beste Modell für die Untersuchung Remyelinisierung ist die direkte Injektion von Toxinen, entweder Lysolecithin, ethidium Bromid-, oder andere, in die Schwanzhirnschenkel 18 oder dem Rückenmark der weißen Substanz. Der frühere Ort wird nur durch präzise 3-Dimension stereotaktische Injektion gelöst und auf größere Nagetiere (Ratten) aufgrund der geringen Größe der Kleinhirnstiele beschränkt. Dies schließt die umfangreichen Ressourcen von transgenen Mäusen, bei der Untersuchung De- und Remyelinisierung. Das Rückenmark enthält jedoch viele große weiße Substanz Striche, die leicht zugänglich sind operativ. Räume zwischen den Wirbeln im rostralen thorakalen Segment ermöglicht Belichtung des Rückenmarks, ohne die Notwendigkeit für eine Laminektomie, die ein notwendiger Schritt bei kaudalen thorakalen chirurgischen Verfahren ist. Ein Vorteil der speziell auf die ventrale weißen Substanz ist, dass die Axone sind gleichmäßig größer ist als die dorsale weißen Substanz, so dass die Quantifizierung der Remyelinisierung ein eindeutiger Aufgaben ähnlich wie die Herausforderungen im Zusammenhang mit den Balken verbunden. Darüber hinaus macht die ventrale weißen Substanz eine viel größere tArget Bereich zu injizieren; mehrere hundert Mikrometer seitlich im dorsalen Bereich würde die Kapillare außerhalb der Kolonne zu platzieren, während die gleiche Abweichung ventral würde immer noch eine herausragende demyelinisierende Läsionen zu erzeugen. Einige Protokolle injizieren Lysolecithin sowohl in die dorsalen und ventralen Spalten derselben Tier 19. Dies kann sowohl die Wahrscheinlichkeit einer richtigen Kapillare Platzierung und die Anzahl der messbaren Läsionen in weniger Tiere zu erhöhen. Während die vorgestellten aktuellen Daten ist von 8 bis 10 Wochen alten Tieren zum Zeitpunkt der Operation haben wir hatten auch Erfolg mit dem gleichen Verfahren auf 8-10 Monate alten Mäusen, in denen die Remyelinisierung wird als deutlich langsamer 4 beschrieben. Die Quantifizierung der Remyelinisierung ist keine triviale Aufgabe. Eine zentrale Dogma postuliert, dass remyelinated Segmente kürzer und dünner im Durchschnitt als gesunde und damit g-Ratio-Berechnungen (Axondurchmesser geteilt durch Axon Myelin + Durchmesser) der Querschnittshalb or Ultradünnschnitte wurden Standardverfahren geworden. Es ist jedoch bekannt, dass remyelinated Segmente verdicken mit der Zeit 2 und eine kürzlich durchgeführte Studie mit einer transgenen Reporter remyelinisierende Oligodendrozyten legt nahe, dass viele Internodien schließlich nicht von Steuer 20 geworden. Quantifizieren der Anzahl reifer Oligodendrocyten innerhalb der Läsion ist ein indirekter Weg zur Reparatur zu messen, wie Oligodendrozyten geeignet ist, eine große Anzahl an Internodien, und ein signifikanter Anteil der Remyelinisierung-je nach Modell verwendet, kann von Schwann-Zellen 3 auftreten. Natürlich, wie Remyelinisierung wurde zur Wiederherstellung der saltatory Leitung 21 in Verbindung gebracht worden, die endgültige Metrik Reparatur würde funktionelle Erholung von neurologischen Defiziten sein. Während Remyelinisierung wurde auf Wiederherstellung der Funktion bei einigen Arten 22,23 in Verbindung gebracht worden, es war nicht ein Standardverfahren in murinen Lysolecithin Studien geworden. Dies ist wahrscheinlich auf einen Mangel an offenen observLage Defizite entweder von dorsal oder ventral Läsionen im Vergleich zu robusteren Demyelinisierung Modelle wie EAE und sogar Cuprizon. Wir glauben, dass funktionelle Defizite von Lysolecithin Einspritzung und anschließende Erholung mit Remyelinisierung resultierenden, nur zu beobachten sein mit empfindlichen Tests feiner sensomotorische Funktion. Eine PubMed-Suche von &quot;Remyelinisierung&quot; neben einem der oben genannten, wenn auch eine brüske methodischen Ansatz Tiermodellen, zeigt weniger Suchtreffer für Lysolecithin (109) gegenüber EAE (188) und Cuprizon (197). Wenn unser Argument, dass Lysolecithin Demyelinisierung ist die überlegene Ansatz für das Studium Remyelinisierung, warum ist es die am wenigsten diskutiert? Vielleicht eine Besorgnis für die Verwendung dieser Methode beruht auf dem Glauben, der technischen Schwierigkeiten bei der Durchführung der Operation. In Wirklichkeit ist dieses Verfahren schnell, kostengünstig, und ist nicht schwieriger als Routine Gewebedissektion, Materialien, die alle handels sind erforderlichüblichen. Es ist unsere Hoffnung, dass dieses Protokoll beweist, nützlich für diejenigen, die diese leistungsstarke Modell in ihr Repertoire für die Untersuchung der spannenden und wachsenden Bereich der Myelinreparatur hinzufügen möchten.

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische demyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die durch Immunzellinfiltration und die Plaques enthaltenden verloren Myelin Oligodendrozyten Axonen und Nervenzellen. Die meisten Patienten haben einen Krankheitsverlauf, bestehend aus entzündlichen Schübe begleitet von einer Vielzahl von neurologischen Symptome, gefolgt von Perioden der Remission. Über die Hälfte dieser Patienten schließlich den Übergang zu einer sekundär progredienten Stadium ohne erkennbare Rückfälle, aber kontinuierlichen Rückgang neurologischen. Es wird angenommen, daß diese fortschreitende Verschlechterung aufgrund axonale Schäden und Verluste ist, beigetragen teilweise durch chronische Demyelinisierung. Strategien, um verlorene Myelin wiederhergestellt werden daher als ein viel versprechender Behandlungsansatz bis zur Krankheitsprogression zu verzögern und vielleicht umkehren neurologische Symptome. Remyelinisierung ist ein körpereigenes Reparaturreaktion im ZNS, wobei neue Myelinscheiden aus rekrutiert Oligodendrozyten-Vorläuferzellen erzeugt(OPC), die in Myelin bildenden Oligodendrozyten differenzieren. Remyelinisierung hat in Tiermodellen gezeigt, recht robust 1-3, jedoch sinkt die Effizienz mit dem Alter 4 zu sein. Tatsächlich tritt Remyelinisierung beim Menschen, obwohl es nicht vollständig in der Mehrzahl von MS-Patienten 5 ist. Alle derzeit verfügbaren Medikamente für MS in erster Linie zielen die aberrante Immunkomponente der Erkrankung und, während effektiv bei der Reduzierung Rückfälle, nicht merklich verzögert Fortschreiten der Krankheit. Die nächste Generation von therapeutischen Strategien für die Behandlung von MS werden Fortschritte in der Immunmodulation mit Verbesserung des endogenen Remyelinisierung um beide Schübe und Progression 6 verhindern integrieren. Eine Methode, um zu studieren De- und Remyelinisierung im Zentralnervensystem beinhaltet die direkte Injektion der Waschmittel Lysophosphatidylcholin (Lysolecithin) in das Rückenmark weißen Substanz 1,3,7. Dieses Verfahren erzeugt eine gut charakterisierte demyelinating Verletzungen hauptsächlich aus Makrophagen / Mikroglia-Infiltration und Aktivierung 8,9, reaktive Astrogliose, Störung des axonalen Homöostase / axonalen Verletzungen und OPC-Proliferation und Migration 10. Die Läsion vorhersehbar entwickelt sich über einen Zeitraum von ein paar Wochen, und ist schließlich in der Lage, vollständig remyelinisierende. Diese Methode ist besonders nützlich bei der Untersuchung der Choreografie der Ereignisse in De- und Remyelinisierung beteiligt gewesen. Weiterhin hat sich als Instrument für die präklinische Prüfung von Kandidaten Therapien angenommen worden, um die Reparatur zu beschleunigen nach einer demyelinisierenden Beleidigung.

<table><tbody><tr><td>Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15004-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Retraktor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17003-03</td><td></td></tr><tr><td>Schermaschine</td><td>Philips</td><td>QG3330</td><td></td></tr><tr><td>Heizung Rückgewinnungskammer</td><td>Peco Services</td><td>V1200</td><td></td></tr><tr><td>chirurgisches Band</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge</td><td>Feder</td><td>Nr. 15</td><td></td></tr><tr><td>Schwammspeer</td><td>Biber Visitec</td><td>581089</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Vicryl Nähte</td><td>Ethicon</td><td>J511G</td><td></td></tr><tr><td>gebogen ToughCut Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15123-12</td><td></td></tr><tr><td>32 G Metallnadel</td><td>BD</td><td></td><td></td>305106</tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>abgewinkelte Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Applikator mit Baumwollspitze</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Mullbinden</td><td>Safe Cross First Aid</td><td>3763</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l Spritze</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td>stellen Sie sicher, dass Sie die Mikroliter kaufen, nicht gasdichte Spritze</td></tr><tr><td>Klemmverschraubung</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td>enthält die 2 Aderendhülsen und die abnehmbare Mutter, aber die Mutter, die mit der 10 &mu; l Spritze ist ein fester sitzendes</td></tr><tr><td>Priming-Kit</td><td>Hamilton</td><td>PRMKIT</td><td>enthält die Priming-Spritze, die abnehmbare Nabennadel und die Gummischeiben</td></tr><tr><td>vorgezogene Glaskapillaren</td><td>WPI</td><td>TIP10TW1 (10er-Pack)</td><td>enthält Kapillaren mit 10 &mu; m Innendurchmesser. 30 &mu; m Innendurchmesser funktioniert auch (TIP30TW1)</td></tr><tr><td>stereotaktischer Rahmen</td><td>David Kopf Instrumente</td><td>Modell 900</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS-20</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek optimale Schnitttemperatur (OCT) Verbindung</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Zwischen-Kryoform</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Hellfeldmikroskop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica EM UC7</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Lysophosphatidylchoin</td><td>Sigma</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-SMI312 Antikörper</td><td>Covance</td><td>SMI-312R</td><td>Verdünnung im Verhältnis 1:2.000</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-MBP Antikörper</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ziege Anti-PDGFR&alpha; Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>AF1062</td><td>1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Olig2 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Maus Anti-CC1 Antikörper</td><td>Calbiochem</td><td>OP80</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Ziege Anti-Maus IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11003</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ziege</td><td>IgG Jackson Immuno</td><td>705-546-147</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Esel Anti-Maus IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>715-586-151</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Esel Anti-Kaninchen IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>711-606-152</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Oxoid</td><td>BR0014</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Sigma</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>CDMV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>CDMV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>West Penetone</td><td>2021</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline Vaseline</td><td>VWR</td><td>CA05971</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>Eriochrom Cyanin R</td><td>Sigma</td><td>32752</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Sigma</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(III)-chlorid</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>320145</td><td></td></tr><tr><td>Acrytol</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801700</td><td></td></tr><tr><td>Citrisolv</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143-975</td><td></td></tr><tr><td>Pferd Serum</td><td>Sigma</td><td>H0146</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Osmum Tetroxid</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>19150</td><td>hochgiftiges</td></tr><tr><td>Kaliumhexacyanoferrat (II)-Trihydrat</td><td>Sigma</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Maisöl</td><td>Sigma</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalkohol</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylsäure</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Propylenoxid</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>EMBED Kit</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Toluidinblau O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Natriumtetraborat-Decahydrat</td><td>Sigma</td><td>S9640</td><td></td></tr><tr><td>Rezepte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eriochrom-Cyanin-Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zutat</td><td></td><td></td><td>Menge der Zugabe</td></tr><tr><td>Eriochrom-Cyanin R</td><td></td><td></td><td>0,8 g</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td></td><td></td><td>400 ml 0,5 %</td></tr> <tr><td>Eisen(III)chlorid</td><td></td><td></td><td>20 ml 10 %</td></tr> <tr><td>Wasser</td><td></td><td></td><td>80 ml</td></tr><tr><td>* Eriochromcyanin zur Schwefelsäure geben, gefolgt von Eisen(III)-chlorid und Wasser. Die Lösung kann nach Gebrauch aufbewahrt werden. Einmal im Jahr frisch machen.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelvatol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zutat</td><td></td><td></td><td>Menge zum Hinzufügen von</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>140 mL</td></tr><tr><td>Polyvinylalkohol</td><td></td><td></td><td>20 g</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td></td><td></td><td>40 g</td></tr><tr><td>*gut mischen, bei 37 μg absetzen; C O/N, Zentrifuge bei 1.960 x g 30 min, aliquot in 40 Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

experimentelle demyelinisierung und remyelinisierung von murine rückenmark von focal injektion von lysolecithin

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple Sklerose ist eine entzündliche demyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems, gekennzeichnet durch die Bildung von Plaque, verloren geht Oligodendrozyten Myelin, Axonen und Nervenzellen. Remyelinisierung ist ein körpereigenes Reparaturmechanismus, wodurch neue Myelin wird im Anschluss an die Proliferation, Rekrutierung und Differenzierung der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen in Myelin bildenden Oligodendrozyten produziert und ist notwendig, um Axone vor weiteren Schäden zu schützen. Derzeit werden alle Therapeutika für die Behandlung von Multipler Sklerose zielen auf den aberranten Immunkomponente der Erkrankung, die entzündliche Schübe zu verringern, aber nicht verhindern, dass das Fortschreiten zu irreversiblen neurologischen Verfall. Es ist daher unerlässlich, dass die Remyelinisierung fördernde Strategien entwickelt, die den Krankheitsverlauf verzögern kann und vielleicht umkehren neurologische Symptome werden. Mehrere Tiermodelle der Demyelinisierung existieren, einschließlich experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis und curprizone; jedoch gibt es Begrentungen in ihrer Verwendung für das Studium Remyelinisierung. Ein robusteres Ansatz ist die Brenn Injektion von Toxinen in das Zentralnervensystem, einschließlich der Waschmittel Lysolecithin in das Rückenmark der weißen Substanz von Nagetieren. In diesem Protokoll zeigen wir, dass das chirurgische Verfahren im Injizieren Lysolecithin des ventralen weißen Substanz von Mäusen beteiligt ist schnell, kostengünstig und erfordert keine zusätzlichen Materialien als die im Handel erhältlich. Dieses Verfahren ist nicht nur wichtig für die Untersuchung der normalen Ereignissen in der Remyelinisierung Prozess beteiligt, sondern auch als eine vorklinische Werkzeug zum Screenen von Kandidaten Remyelinisierung fördernde Therapeutika.

Brenn Injektion von Lysolecithin des ventralen weißen Substanz erzeugt eine diskrete demyelinisierende Läsion, die über eine Strecke von etwa 3 mm (2) detektierbar ist. Immunhistochemische Färbung der Läsion Kern für Myelin (MBP) und Axonen (SMI312) zeigt Axonen von Myelin bei 7 Tagen (Abbildung 3) abgestreift wurden. Von 14 Tagen werden viele Axone von MBP-positive Ringe, die das Auftreten von Remyelinisierung schlägt umgeben. Anfärben von Zellen des Oligodendrozyten Linie (PDGFRα, Olig2, CC1), gibt es eine signifikante Zunahme sowohl der Gesamtzahl der Zellen am Tag 14 im Vergleich zu 7 Tagen, sowie die Verteilung der reifen Oligodendrocyten Vergleich zu OPCs (Figur 4) . In Übereinstimmung mit diesem Befund Semidünnschnitte mit Toluidinblau gefärbt zeigen das Vorhandensein von dünnen Myelinhüllen nach 14 Tagen, die selten bei 7 Tagen (Abbildung 5) detektiert werden, was anzeigt, dass diese i remyelinatednternodes. Das Verfahren ist sehr gut reproduzierbar zwischen Tieren. Variation tritt auf, wenn schwere Atmung verändert die stationäre Position der Kapillare, das ist in der Regel kein Problem mit ausreichenden Sedierung. Beschädigung Axone erscheint minimal sein, außer in der Mitte der Läsion, die sich seit der frühesten Verwendung des Modells 1 beschrieben wurde. Wir glauben, dass diese gegen mechanische Schädigung der Glaskapillare, da sie auch beobachtet werden in PBS injizierten Kontrollen. Dennoch tendiert Variabilität klein sein, und wir und andere mit einem ähnlichen Verfahren Unterschiede zwischen Versuchsbedingungen mit nur 4 Tieren pro Gruppe 15 erfaßt haben. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig1.jpg" /> Abbildung 1. Montage der Injektionsspritze. (A) Die Mutter des Injektionsspritze wird auf t Gewinde<html> er flache Ende der Glaskapillare, gefolgt von dem 2 Ferrulen sind, daß ihre Passungsenden Verriegelung. Sobald die Kapillare fest im konischen Hülse eng ist die Baugruppe handfest auf das Ende der Injektionsspritze eingeschraubt. (B) Stück das Zentrum einer Gummischeibe mit dem Metall-Hub Nadel an der Spritze befestigt Grundierung und schieben Sie sie bis zum die Basis. (C) herausziehen Lysolecithin Lösung in die Grundierung Spritze. (D) die Grundierung Spritze vorsichtig drücken, bis der erste Tropfen Lysolecithin an der Spitze der Nadel sichtbar ist. (E) Legen Sie die Priming-Spritze in den Lauf von der Einspritz Spritze, so dass eine feste Dichtung mit der Gummischeibe. Die Lösung vorsichtig zu drücken, bis es mit dem Ende der Kapillare läuft. Vorsichtig ziehen Sie die Grundierung Spritze und gleichzeitig Druck auf den Kolben, um das Metall-Hub Nadel, ohne dabei Luftblasen in die Injektionsspritze entfernen.Upload / 52.679 / 52679fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig2.jpg" /> Abbildung 2. Representative Lysolecithin Läsion mit Erio- chromcyanin gefärbt. Serienschnitte eines charakteristischen Lysolecithin Läsion an 14 Tagen mit Erio- chromcyanin gebeizt (400 &amp; mgr; m voneinander entfernt), um Myelin (blau) sichtbar zu machen. Beachten Sie, dass Demyelinisierung auf der ventralen weißen Substanz beschränkt und dass die Läsion erstreckt sich über etwa 3 mm im rostralen / kaudal. Maßstabsbalken = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig3.jpg" /> Abbildung 3. Axone und Myelin indie Lysolecithin Modell. (A) Ein Schein (PBS) injiziert Rückenmark nach 7 Tagen zeigt gesunde Axone, die von Myelin Ringen umgeben sind. (B) A Lysolecithin Läsion nach 7 Tagen zeigt entblößt Axone als auch abgebaut Myelin. (C) Nach 14 Tagen ein Anteil der Axone (Beispiele mit weißen Pfeilen bezeichnet) mit dem Wiederauftreten von Myelin Ringe verbunden. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig4.jpg" /> Abbildung 4. Oligodendrocyte Linie Zellen im Lysolecithin Modell. (A, C) nach 7 Tagen, es gibt eine größere Darstellung PDGFRα + OPCs (weiße Balken), bezogen auf A1 + Oligodendrozyten (magenta Balken); die Zahlen in den Balken geben Prozentsätze. Olig2 wurde untersuchtBestätigen Färbung von Oligodendrozyten Linie Zellen. (B, C) ​​Nach 14 Tagen gibt es einen signifikanten Anstieg in der Gesamtzahl der Oligodendrozyten Linie Zellen im Vergleich zu 7 Tagen (p &lt;0,05, zweiseitiger t-Test, n = 4 pro Gruppe ). Es gibt auch einen signifikanten Anstieg in der Verteilung der Oligodendrozyten OPCs nach 14 Tagen im Vergleich zu 7 Tagen (p &lt;0,0001, Fisher-Exact-Test). Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. Jedes Feld wird in einem Original-Vergrößerung von 60X eingefangen. Werte sind Mittelwerte ± SD. * Bedeutet, p &lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig5.jpg" /> Abbildung 5. Remyelinisierung im Lysolecithin Modell. (A) eine Querschnitts Toluidinblau gefärbt Semidünnschnitt der ventralen weißen Substanz in einem healthy Maus zeigt Axone über einen weiten Bereich von Kaliber mit entsprechenden Myelindicke. (B) nach 7 Tagen, ein Mangel an Myelinscheiden ist neben einem nicht betroffenen Gebiet (rechts unten) beobachtet. (C) Nach 14 Tagen dünn markScheiden ( Beispiele mit roten Pfeilen gekennzeichnet) erscheinen in der gesamten Läsion, was auf remyelinated Segmenten. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

Demyelinisierende Krankheiten können bei Tieren durch fokale Anwendung von Lysolecithin in das ZNS modelliert werden. Eine einzige Injektion von Lysolecithin in das Rückenmark der Maus führt zu einer Läsion, die sich im Laufe der Zeit spontan repariert. Ziel ist es, Faktoren zu untersuchen, die an der De- und Remyelinisierung beteiligt sind, und Wirkstoffe zur Verbesserung der Reparatur zu testen.

Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Aspekte der Demyelinisierung und anschließenden Remyelinisierung im Maus-Rückenmark zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Detergens lyin aus einer gezogenen Glas-Kapillare in die weiße Substanz des ventralen Rückenmarks injiziert wird. Anschließend werden die Rückenmarkproben zu verschiedenen Zeitpunkten aufgearbeitet, um Aspekte der Reparatur zu untersuchen, einschließlich der Rekrutierung, Differenzierung von Vorläuferzellen der Oligodendrozyten sowie der Remyelinisierung.Diese Methode ist nicht nur nützlich zur Untersuchung der normalen Vorgänge, die an der Remyelinisierung beteiligt sind, sondern auch als präklinisches Werkzeug zum Screening von therapeutischen Substanzen, die die Remyelinisierung fördern. Entnehmen Sie zunächst eine 75 µL-Aliquotprobe einer 1 %igen Detergenslösung aus der Lagerung bei minus 20 Grad Celsius und lassen Sie sie auf der Arbeitsfläche auf Raumtemperatur auftauen, falls das Detergens nicht gelöst ist. Sonizieren Sie das Gefäß bei 40 Kilohertz für etwa 30 Minuten, um eine homogene Lösung zu erhalten.Als Nächstes lösen Sie die Mutter einer 10-Mikroliter-Injektionsspritze und ziehen Sie sie auf das flache Ende einer PrepU-Glaskapillare. Fügen Sie zwei Varials hinzu, um sicherzustellen, dass sie fest um die Kapillare sitzen. Spülen Sie nun die Spritze mit Isopropanol aus und entfernen Sie den Kolben.Nach dem Trocknen die Nadelanordnung per Hand am Injektionsspritze festdrehen. Danach eine Metallhülsen-Nadel an der Befüllspritze befestigen. Eine Gummischeibe mit der Nadel durchstechen und bis zur Basis heruntergleiten lassen.Füllen Sie nun die Primerspritze mit dem lyophilisierten Produkt bei Raumtemperatur, bevor Sie das Detergens hinzufügen. Drücken Sie vorsichtig den Kolben, um unerwünschte Luft zu entfernen, bis die Lösung an der Nadelspitze sichtbar ist, für Kontrolloperationen. Geben Sie PBS zu.Setzen Sie nun die Metallnadel der Präzisionsspritze in die Injektionsspritze ein und stellen Sie sicher, dass ein dichter Abschluss mit der Gummischeibe gewährleistet ist. Drücken Sie dann langsam die Präzisionsspritze zusammen, bis die Kapillare bis zur Spitze mit der Lösung gefüllt ist. Ziehen Sie unter gleichzeitigem Weiterfüllen des Zylinders der Injektionsspritze vorsichtig die Präzisionsspritze heraus, nachdem die Kapillare gefüllt ist.Vermeiden Sie es, Luftblasen einzuführen. Setzen Sie nun den Kolben in die Injektionsspritze ein und stellen Sie sicher, dass die Lösung aus der Spitze austritt. Falls Luftblasen in der Kapillare oder der Injektionsspritze sichtbar sind, wiederholen Sie die Vorbereitung der Spritze von Anfang an.Ein kontinuierlicher Flüssigkeitsstrom in der Injektionsvorrichtung ist entscheidend, um genaue Injektionsvolumina sicherzustellen. Zum Abschluss wird die Injektionsspritze am Arm eines stereotaktischen Mikromanipulators befestigt. Mit diesem Aufbau können 15 bis 20 Tiere injiziert werden, bevor eine neue Kapillare benötigt wird.Zunächst betäuben Sie das Tier, in diesem Fall eine erwachsene weibliche Maus der C57BL/6-Zuchtlinie. Verwenden Sie Ketamin und Xylazin und planen Sie eine Narkosedauer von einer Stunde ein. Stellen Sie eine ausreichende Sedierung sicher, basierend auf dem Fehlen einer Reaktion auf einen kräftigen Zehenreiz.Dann rasieren Sie einen zwei bis drei Zentimeter großen quadratischen Bereich an der Rückseite in der Nähe der Ohren. Wischen Sie die Haut mit 70 %igem Ethanol auf einem Mulltupfer ab, um alle Haare zu entfernen. Desinfizieren Sie anschließend die Fläche mit Jod. Tragen Sie unbedingt eine Atoma-Salbe auf und halten Sie das Tier in einer beheizten Erholungskammer. Bereit, um mit dem Verfahren zu beginnen. Bewegen Sie das Tier in einen stereotaktischen Halter, wobei die dorsale Seite nach oben zeigt und der mittlere Bereich mit gefalteten Papiertüchern angehoben wird, um die Krümmung der Wirbelsäule zu verstärken.Befestigen Sie dann den Kopf mit der Zahnklemme und fixieren Sie die Arme und den Schwanz mit chirurgischem Klebeband. Stabilisierende Ohrstangen sind nicht erforderlich. Verwenden Sie nun ein Skalpell, um einen drei Zentimeter langen medianen Schnitt vorzunehmen, der knapp unterhalb der Ohren beginnt und in Richtung der Kuschelposition verläuft.Danach die Grenze zwischen den beiden großen Fettgewebestrukturen lokalisieren und feine Pinzetten in jeder Hand verwenden. Um diese auseinanderzuziehen, die Retraktoren spreizen, um das Operationsfeld unter dem Operationsmikroskop freizulegen, und den auffälligen knöchernen Vorsprung der T2-Wirbelsäule identifizieren, der für die Mausstamm C57BL/6 charakteristisch ist. Um den Wirbel sichtbar zu machen, eine stumpfe Präparation des überliegenden Muskelgewebes mit geschlossenen Schmetzschere durchführen.Dann tasten Sie die harten Strukturen von Th3 und Th4 ab, um die korrekte anatomische Lage zu bestätigen. Führen Sie nun flache laterale Schnitte im Bindegewebe zwischen Th3 und Th4 durch. Achten Sie darauf, dass ein zu tiefer Schnitt das Rückenmark durchstoßen und beschädigen könnte.Ein gewisses Maß an Blutung ist üblich und kann mit einem Schwammsprenger beseitigt werden. Das Rückenmark ist von einer dicken Dura-Schicht bedeckt und wird sichtbar sein, falls diese meningeale Schicht noch nicht durchtrennt wurde. Falls die Dura intakt bleibt, entfernen Sie sie vorsichtig durch sanftes seitliches Abkratzen mit einer Metallnadel der Größe 32.Vermeiden Sie es, die verbleibenden darunterliegenden Hirnhäute zu durchbohren, die nicht so dick sind und schwerer zu erkennen sind. Falls zerebrale Spinalflüssigkeit aus der Arachnoidea austritt, entfernen Sie sie mit dem Schwammbohrer. Beginnen Sie die Injektion, indem Sie die Kapillare über das Rückenmark bringen. Das auffällige coddle-rostrale Blutgefäß sollte nicht als Mittellinien-Markierung verwendet werden. Verwenden Sie stattdessen die grau-weißen Grenzen zwischen Grauer und Weißer Substanz, die die Hinterstränge flankieren, um die Mittellinie abzuschätzen. Senken Sie nun die Kapillare langsam ab, bis ihre Spitze knapp das Rückenmark unmittelbar lateral zu einer der beiden Seiten der Mittellinie berührt.Bringen Sie den Arm an dieser Position in der Verriegelung an. Notieren Sie dann die Ausgangsposition anhand der skalierten Messungen in Z-Richtung am stereotaktischen Arm. Subtrahieren Sie von diesem Wert 1,3 Millimeter und durchbohren Sie das Gewebe mit einer schnellen, flachen Abwärtsbewegung, wobei Sie die Kapillare vorsichtig auf die gewünschte Tiefe absenken.Verwenden Sie nun den Mikromanipulator, um alle fünf Sekunden eine volle Umdrehung durchzuführen, und injizieren Sie über einen Zeitraum von zwei Minuten ein Gesamtvolumen von 0,5 µL. Belassen Sie die Kapillare anschließend zwei Minuten lang an Ort und Stelle. Nach zwei Minuten ziehen Sie die Kapillare vorsichtig aus dem Gewebe zurück.Dadurch kann die Lösung eindringen. Andernfalls könnte es zu einem Rückfluss kommen. Bewegen Sie die Injektionsvorrichtung von dem Tier weg und entfernen Sie die Retraktoren. Schließen Sie das Tier, indem Sie eine einzelne Naht im Muskel-Fett-Gewebe anlegen, die die Wirbelsäule überdeckt.Verwenden Sie anschließend eine durchgehende Naht, um die Haut zu verschließen, und tragen Sie erneut Jod auf die Schnittstelle auf. Platzieren Sie das Tier zum Abschluss in eine beheizte Erholungskammer, bis es sich erholt hat, und bringen Sie es danach in seinen Käfig zurück. Die postoperative Versorgung und Analyse sind im Textprotokoll zur fokalen Injektion von Lyin in das ventrale weiße Mark beschrieben.Es wurde eine begrenzte demyelinisierende Läsion erzeugt, die etwa drei Millimeter umfasste. Eine immunhistochemische Färbung des Läsionskerns wurde durchgeführt, wobei Myelin mit MVP und Axone mit SM I drei 12 markiert wurden. Die Axone waren nach sieben Tagen von Myelin befreit, und nach 14 Tagen umgaben MVP-positive Ringe viele Axone, was darauf hindeutet, dass eine Remyelinisierung stattfand.Färbung von Zellen der Oligodendrozyten-Linie unter Verwendung von PDGFRα, LIC2 und CC1 zeigte einen signifikanten Anstieg sowohl der Gesamtanzahl der Zellen nach 14 Tagen im Vergleich zu sieben Tagen als auch eine größere Verteilung von reifen Oligodendrozyten im Vergleich zu OPCs. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigten semidünne Schnitte, die mit Toluidinblau gefärbt wurden, das Vorhandensein dünner Myelinscheiden nach 14 Tagen, die nach sieben Tagen nur selten nachweisbar waren. Dies weist auf das Vorhandensein von remyelinisierten Internodien mit ausreichender Effizienz hin.Der Eingriff kann pro Tier in 10 bis 15 Minuten durchgeführt werden, insbesondere mit Hilfe einer zweiten Person, die die Nähte zubindet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Krankheit löst autoreaktive Immunzellen aus, die Myelinproteine angreifen und die Myelinscheide, die die neuronalen Axone umgibt, abbauen.

Ultrastrukturelle Analyse der Demyelinisierung in Querschnitten des Rückenmarks von Mäusen

Dieses Video zeigt die Prozedur des chirurgischen Zugangs zum Sehnerv bei einem anästhesierten Tier und die präzise Abgabe von Lysolecithin, um eine fokale Demyelinisierung zu induzieren und neuropathologische Zustände für weitere Studien zu schaffen.

Induktion der lokalen Demyelinisierung im Sehnerv mit Lysolecithin

Dieses Video zeigt die Generierung eines fokalen Demyelinisierungs-Mausmodells unter Verwendung einer Zweipunkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin (LPC). Der Schädel einer betäubten Maus wird freigelegt. Die Injektionskoordinaten werden bestimmt und ein Loch gebohrt, um LPC-Injektionen an den Zielstellen zu ermöglichen. LPC induziert die fokale Demyelinisierung von Neuronen über Entzündungen, während eine Zweipunktinjektion ihre Nachhaltigkeit gewährleistet.

Etablierung eines fokalen Demyelinisierungs-Mausmodells durch eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin

Dieses Video zeigt die Methode zur Induktion der Demyelinisierung in Rückenmarksneuronen der Maus durch Lysolecithin-Injektionen, gefolgt von einer Remyelinisierung durch Migration und Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. Der Prozess beeinträchtigt die neuronale Signalübertragung und stellt sie dann allmählich wieder her.

Demyelinisierung und Remyelinisierung von Rückenmarksneuronen der Maus

Eine neue ex vivo Herstellung zum Abbilden der Rückenmark der Maus. Dieses Protokoll ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung von lebenden zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Dieses Protokoll beschreibt, wie bestimmt werden kann, ob pharmakologische Behandlungen für experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis einen ZNS-Schutz als Folge der Unterdrückung der Immunzellinfiltration zeigen oder während des Ansturms der Immunzellinfiltration neuroprotektiv sind.

Die Bestimmung Unterdrückung des Immunsystems gegen ZNS-Schutz für pharmakologische Interventionen im Bereich der Autoimmun- Demyelinisierung

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Reproduktion einer weit verbreiteten Demyelinisierung der grauen Substanz beider kortikaler Hemisphären bei erwachsenen männlichen Dunklen Agouti-Ratten. Die Methode umfasst die intrazerebrale Implantation eines Katheters, die subklinische Immunisierung gegen Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die intrazerebrale Injektion einer entzündungsfördernden Zytokinmischung durch den implantierten Katheter.

Rattenmodell der weit verbreiteten zerebralen kortikalen Demyelinisierung, induziert durch eine intrazerebrale Injektion von entzündungsfördernden Zytokinen

Die Demyelinisierung findet bei multiplen Erkrankungen des zentralen Nervensystems statt. Eine zuverlässige In-vivo-Arzneimittelabgabetechnik ist für remyelinisierende Arzneimitteltests erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt eine osmotische pumpbasierte Methode, die eine langfristige Arzneimittelabgabe direkt in das Gehirnparenchym ermöglicht und die Bioverfügbarkeit des Arzneimittels verbessert, mit breiter Anwendung in der Remyelinisierungsforschung.

Osmotische pumpbasierte Wirkstoffabgabe für die In-vivo-Remyelinisierungsforschung am zentralen Nervensystem

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen, um ein stabiles und reproduzierbares Demyelinmodell in Mäusen zu erzeugen.

Ein stabil etabliertes Zwei-Punkt-Injektionsmodell für Lysophosphatidylcholin-induziertes fokales Demyelin-Modell bei Mäusen

Dieses Video zeigt eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus E13 Ratte Rückenmark. Dissoziiert kommissuralen Neuronen sind nützlich, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Axon-Wachstum und Anleitung zu studieren.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Erfahren Sie, wie Demyelinisierung und Remyelinisierung im Mausrückenmark durch fokale Lysolecithin-Injektion untersucht werden. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Reparaturmechanismen und dient als präklinisches Screening-Tool für therapeutische Ansätze.

Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin

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