Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Aspekte der Demyelinisierung und der nachfolgenden Remyelinisierung im Rückenmark der Maus zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Reinigungsmittel Lyin aus einer gezogenen Glaskapillare in die weiße Substanz des ventralen Rückenmarks injiziert wird. Dann wird das Rückenmark zu verschiedenen Zeitpunkten bearbeitet, um Aspekte der Reparatur zu untersuchen, einschließlich der Rekrutierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen, der Differenzierung und der Remyelinisierung.

Diese Methode ist nicht nur nützlich für die Untersuchung der normalen Ereignisse bei der Remyelinisierung, sondern auch als präklinisches Instrument für das Screening von Remyelinisierungsfördernden Therapeutika. Beginnen Sie mit der Entnahme eines 75-Mikroliter-Aliquots von 1%iger Waschmittellösung aus minus 20 Grad Celsius, lagern Sie es und tauen Sie es auf Raumtemperatur auf der Bank auf, wenn das Reinigungsmittel ungelöst ist. Beschallen Sie das Röhrchen etwa 30 Minuten lang bei 40 Kilohertz, um eine gleichmäßige Lösung zu erhalten.

Schrauben Sie anschließend die Mutter einer 10-Mikroliter-Injektionsspritze ab und fädeln Sie sie auf das flache Ende einer PrepU-Glaskapillare. Fügen Sie zwei Varianten hinzu und stellen Sie sicher, dass sie eng an der Kapillare anliegen. Spülen Sie nun die Spritze mit Isopropanol aus und entfernen Sie den Kolben.

Nach dem Trocknen der Hand ziehen Sie die Nadel an der Injektionsspritze fest. Befestigen Sie dann eine Nabennadel aus Metall an der Zündspritze. Durchstechen Sie mit der Nadel eine Gummischeibe und schieben Sie sie bis zur Basis hinunter.

Füllen Sie nun die Grundspritze mit dem Raumtemperatur-Lyo als Waschmittel. Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, um unerwünschte Luft zu entfernen, bis die Lösung an der Nadelspitze sichtbar ist, um Kontrolloperationen durchzuführen. PBS laden.

Führen Sie nun die Metallnabennadel der Injektionsspritze in die Injektionsspritze ein und achten Sie darauf, dass die Gummischeibe dicht schließt. Drücken Sie dann langsam auf die Zündspritze, bis sich die Kapillare bis zur Spitze mit Lösung füllt. Ziehen Sie bei gefüllter Kapillare die Zündspritze vorsichtig heraus, während Sie den Zylinder der Injektionsspritze weiter füllen.

Versuchen Sie, das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden. Führen Sie nun den Kolben in die Injektionsspritze ein und stellen Sie sicher, dass die Lösung aus der Spitze fließt. Wenn Luftblasen in der Kapillar- oder Injektionsspritze sichtbar sind, wiederholen Sie die Spritzenvorbereitung von Anfang an.

Eine kontinuierliche Flüssigkeit in der Injektionsvorrichtung ist entscheidend, um genaue Injektionsmengen zu gewährleisten. Zum Schluss befestigen Sie die Injektionsspritze am Arm eines stereotaktischen Mikromanipulators. Mit diesem Aufbau können 15 bis 20 Tiere injiziert werden, bevor eine neue Kapillare benötigt wird.

Zuerst wird das Tier betäubt, in diesem Fall ein junges erwachsenes Weibchen, C 57 black six mouse. Verwenden Sie Ketamin und Xylazin und planen Sie eine Stunde Narkose ein. Stellen Sie eine angemessene Sedierung sicher, da Sie nicht auf ein festes Einklemmen des Fußes reagieren.

Rasieren Sie dann auf der Rückenseite in der Nähe der Ohren eine zwei bis drei Zentimeter große Fläche. Wischen Sie die Haut mit 70%igem Ethanol auf einem Mullpad ab und entfernen Sie alle Haare. Desinfizieren Sie dann den Bereich mit Jod.

Achten Sie darauf, eine Atomsalbe aufzutragen und das Tier in einer beheizten Auffangkammer zu halten. Bereit, mit dem Vorgang zu beginnen. Bewegen Sie das Tier mit der Rückenseite nach oben in der Mitte mit gefalteten Papiertüchern auf einen stereotaktischen Rahmen, um die Krümmung der Wirbelsäule zu übertreiben.

Sichern Sie dann den Kopf mit der Zahnklemme und befestigen Sie die Arme und den Schwanz mit chirurgischem Klebeband. Stabilisierende Ohrbügel sind nicht notwendig. Machen Sie nun mit einem Skalpell einen drei Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie, der knapp unter den Ohren beginnt und in Kuschelrichtung schneidet.

Lokalisieren Sie dann die Trennlinie zwischen den beiden großen Fettstrukturen und verwenden Sie in jeder Hand eine feine Pinzette. Um diese auseinander zu ziehen, spreizen Sie die Retraktoren, um das Operationsfeld unter einem Operationsmikroskop zu öffnen, lokalisieren Sie den markanten knöchernen Auswuchs der beiden Wirbel, der für den Stamm C 57 black six mouse charakteristisch ist. Um den Wirbel zu betrachten, wird die überliegende Muskulatur mit einer geschlossenen Federschere stumpf diseziert.

Fühlen Sie dann nach den harten Oberflächen von T drei und T vier, um die richtige anatomische Position zu bestätigen. Machen Sie nun flache seitliche Schnitte im Bindegewebe zwischen T drei und T vier. Seien Sie sich bewusst, dass ein zu tiefer Schnitt die Nabelschnur durchbohrt und beschädigt.

Einige Blutungen sind häufig und können mit einem Schwammspeer beseitigt werden. Das Rückenmark ist mit einer dicken Duraschicht bedeckt und wird sichtbar sein, wenn diese Hirnhautschicht noch nicht durchtrennt wurde. Wenn die Dura intakt bleibt, entfernen Sie sie vorsichtig mit sanften seitlichen Kratzern mit einer 32-Gauge-Metallnadel.

Vermeiden Sie es, die verbleibenden darunter liegenden Hirnhäute zu durchstechen, die nicht so dick und schwerer zu sehen sind. Wenn Flüssigkeit aus dem Spinnenbein austritt, entfernen Sie sie mit dem Schwammspeer. Beginnen Sie die Injektion, indem Sie die Kapillare über dem Rückenmark in Position bringen.

Das herstehende rostrale Blutgefäß sollte nicht als Orientierungspunkt in der Mittellinie verwendet werden. Verwenden Sie stattdessen die Grenzen der grauen weißen Substanz, die die dorsale Säule flankieren, um die Mittellinie zu schätzen. Senken Sie nun die Kapillare langsam ab, bis die Spitze das Rückenmark unmittelbar lateral von beiden Seiten der Mittellinie gerade noch berührt.

Arretieren Sie den Arm in dieser Position. Notieren Sie sich dann die Position der Grundlinie auf den abgestuften Messungen der Z-Richtung am stereotaktischen Arm. Ziehen Sie von diesem Messwert 1,3 Millimeter ab und stechen Sie mit einer schnellen und flachen Abwärtsbewegung in das Gewebe, indem Sie die Kapillare vorsichtig auf die gewünschte Tiefe absenken.

Führen Sie nun mit dem Mikromanipulator alle fünf Sekunden zwei Minuten lang eine volle Umdrehung durch, um ein Gesamtvolumen von 0,5 Mikrolitern zu injizieren. Lassen Sie dann die Kapillare zwei Minuten lang an Ort und Stelle. Ziehen Sie nach zwei Minuten die Kapillare vorsichtig aus dem Gewebe zurück.

Dadurch kann die Lösung eindringen. Andernfalls könnte es zu einem Rückfluss kommen, der das Injektionsgerät vom Tier wegbewegt und die Retraktoren entfernt. Verschließen Sie das Tier, indem Sie eine einzelne Naht in das Muskelfettgewebe binden und die Wirbelsäule überlagern.

Verwenden Sie dann eine ununterbrochene Naht, um die Haut zu schließen, und tragen Sie mehr Jod auf die Inzisionsstelle auf. Zum Schluss setzen Sie das Tier in eine beheizte Auffangkammer, bis es sich erholt hat, und bringen Sie es dann in seinen Käfig zurück. Die postoperative Betreuung und Analyse ist im Textprotokoll Fokale Injektion von Lyin in die ventrale weiße Substanz beschrieben.

Erzeugte eine diskrete demyelinisierende Läsion, die sich über etwa drei Millimeter erstreckte. Es wurde eine immunhistochemische Färbung des Läsionskerns durchgeführt, wobei Myelin mit MVP und Axone mit SM I drei markiert wurden 12. Die Axone wurden nach sieben Tagen vom Myelin befreit und nach 14 Tagen umgaben MVP-positive Ringe viele Axone, was darauf hindeutet, dass eine Remyelinisierung stattfand.

Die Färbung von Zellen der Oligodendrozytenlinie mit PDG, FFR, alpha, LIC two und CC one zeigte eine signifikante Zunahme sowohl der Gesamtzahl der Zellen nach 14 Tagen im Vergleich zu sieben Tagen als auch eine größere Verteilung reifer Oligodendrozyten im Vergleich zu OPCs. In Übereinstimmung mit diesem Befund zeigten halbdünne Schnitte, die mit Toluidin, blau gefärbt waren, nach 14 Tagen das Vorhandensein dünner Myelinblätter, die nach sieben Tagen selten nachgewiesen wurden. Anzeige des Vorhandenseins von remyelinierten Internodien Mit Kompetenz.

Die Operation kann in 10 bis 15 Minuten pro Tier durchgeführt werden, insbesondere mit Hilfe einer zweiten Person, die die Nähte bindet.