Einfache und Computergestützte Riechtests für Mäuse
15. Juni 2015
Wir präsentieren einen einfachen und unvoreingenommenen Geruchstest an Mäusen. Mit diesem Protokoll können die olfaktorische Unterscheidung, Präferenz, Vermeidung und Empfindlichkeit gegenüber einem neuen Geruch im Vergleich zu Wasser in einzelnen Verhaltenssitzungen beurteilt werden. Diese Methode ist für einen einzelnen Experimentator indiziert und die Analyse basiert auf computergestützter Videoverarbeitung.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die angeborene olfaktorische Diskriminierung, olfaktorische Präferenz beziehungsweise Vermeidung sowie die olfaktorische Empfindlichkeit bei Mäusen zu testen. Dies wird erreicht, indem die Maus einem neuartigen Lockstoff oder Reizstoff sowie einem neutralen Geruch, nämlich Wasser, ausgesetzt wird. Gleichzeitig zeichnet eine Videokamera die Verhaltenssitzung auf.
Anschließend wird das Video mit Image J unter Verwendung der bereitgestellten Makros analysiert, um die in den Bereichen Geruch und Wasser verbrachte Zeit zu ermitteln. Die Ergebnisse zeigen das Präferenz- oder Vermeidungsverhalten gegenüber Gerüchen im Vergleich zu Wasser bei verschiedenen Genotypen, basierend auf der nachträglichen computergestützten Analyse. Der Hauptvorteil der olfaktorischen Testung gegenüber der Verwendung einer speziellen Arena und olfaktorischer Systeme liegt darin, dass eine vertraute Arena verwendet wird, wodurch der Test schnell abgeschlossen und einfach eingerichtet werden kann.
Außerdem verwendet es kostengünstige Hardware, um das Verfahren zu demonstrieren, das Emmanuel Abry, ein Doktorand in meinem Labor, durchführen wird. Verwenden Sie für dieses Experiment drei bis fünf Monate alte männliche C57BL/6-Wildtyp- und transgene Mäuse. Diese Demonstration verwendet zwei Knockout-Linien und jeweilige Wurfgenossen-Kontrollen.
Verwenden Sie für die Versuchsarenen saubere, sterilisierte Mauskäfige mit drei Zentimetern Einstreu. Bereiten Sie anschließend die Kameraanordnung vor. Positionieren Sie diese 58 Zentimeter über dem Käfigboden auf einer speziell angefertigten Stativhalterung.
Bringen Sie einige Markierungen auf der Arbeitsfläche an, um die Position des Käfigs anzugeben. Stellen Sie für ein zentriertes Bild die Kamera so ein, dass ein Video mit 320 mal 240 Pixeln bei etwa 15 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet wird. Um den Testdurchführer vorzubereiten, haben Sie Konzentrate jedes Geruchs, wann immer möglich, in Lösungsmittel gelöst, bereitgestellt.
Für den Präferenztest stellen Sie eine 10 %ige (Gewicht pro Volumen) Lösung von Erdnussbutter in Erdnussöl her. Für den Vermeidungstest verwenden Sie eine Lösung mit 98 % Methylbutyrat. Für den Empfindlichkeitstest sammeln Sie weiblichen Urin von einer Maus desselben Stammes ein bis zwei Tage vor dem Test.
Halten Sie ein Weibchen mit dem Bauch über dem Käfiggitter fest und sammeln Sie Tropfen ihres Urins in einer Plastikschale. Sammeln Sie Proben von mehreren Weibchen, um eine Normalisierung vorzunehmen. Um individuelle Variabilität auszugleichen, geben Sie alle Proben in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.
Um mit der Gewöhnung der Tiere zu beginnen, stellen Sie eines in einen gereinigten Käfig und lassen Sie es die Umgebung erkunden. Während fünf Minuten sollte die Umgebung des Versuchskäfigs derjenigen des Heimkäfigs entsprechen. Wiederholen Sie die Gewöhnungsphase einmal pro Testtag; wenn die Gewöhnungszeit abgelaufen ist, beginnen Sie die Aufzeichnung und pipettieren 60 Mikroliter eines angenehmen Duftstoffs.
In diesem Fall wird Erdnussbutter auf eine Wand und auf die gegenüberliegende Wand mit einer Pipette die gleiche Menge Wasser aufgetragen. Bei einem neutralen Duft werden die Tropfen jeweils etwa 10 Zentimeter hoch an jeder Wand angebracht. Lassen Sie nun das Tier zwei Minuten lang erkunden, beenden Sie anschließend die Aufnahme und bringen Sie die Maus in ihren Heimkäfig zurück.
Wiederholen Sie den Vorgang mit jeder zu testenden Maus. Verwenden Sie dabei stets neue Testkäfige. Drei bis fünf Tage nach Durchführung aller Präferenztests führen Sie den Vermeidungstest unter Verwendung eines neuen Testkäfigs durch.
Führen Sie für jede Maus den Vermeidungstest durch. Wie beim Anziehungstest ersetzen Sie lediglich den angenehmen Duft durch den Vermeidungsduft, der aus den beiden Methylbuttersäuren besteht. Für den Empfindlichkeitstest kann ein Käfig zwischen den Versuchen derselben Maus wiederverwendet werden.
Markieren Sie daher die Wassersseite des Käfigs und bereiten Sie sich darauf vor, die kurzen Wände zwischen den Versuchen mit mit 70 % Ethanol getränktem Papier zu reinigen. Am Tag des Experiments stellen Sie vier Konzentrationen des Urins mittels einer zehnfachen Verdünnungsreihe her. Gewöhnen Sie jedes Tier unter Verwendung von doppelt destilliertem Wasser wie beim Vermeidungstest fünf Minuten lang an seinen Testkäfig an.
Danach jedem Maus zunächst Urin in der höchsten Verdünnung aussetzen, also 1 zu 10.000. Während der Aufnahme wird die Urinverdünnung in den Testkäfig gegeben und Wasser auf die gegenüberliegende Wand aufgetragen. Wie bei anderen Tests durchgeführt, lässt man das Tier erkunden.
Zwei Minuten lang. Danach das Tier in einen sauberen Mäusekäfig verbringen. Nachdem alle Tiere der niedrigsten Konzentration ausgesetzt waren, sämtliche Wände des Testkäfigs reinigen und den Test an jeder Maus mit dem nächst höher konzentrierten Urin wiederholen.
Setzen Sie diesen Prozess fort, bis der reine Urin getestet ist. Nachdem alle Daten für ein Experiment gesammelt wurden, öffnen Sie die Videos in ImageJ zur Anpassung und Verarbeitung, deren Details im Textprotokoll unter Verwendung der beschriebenen Protokolle bereitgestellt werden. Zwei verschiedene Knockout-Linien.
Die Gruppen B und C wurden mit der Kontrollgruppe A aus dem Wurf verglichen. Ein zweiseitiger Student-t-Test mit gleicher oder ungleicher Varianz vergleicht die verbrachte Zeit zwischen Duft- und Wasserplatz innerhalb der Genotypen. Vergleichen Sie das Verhalten zwischen den Genotypen mithilfe einer einwegigen ANOVA. Beide Versuchsgruppen, B und C, zeigten keine Präferenz für den attraktiven Duft. Im Vermeidungstest war die Reaktion gegenüber dem abstoßenden Duft der zwei Methylbuttersäure wie erwartet für die Gruppen A und B, doch Gruppe C zeigte kein Vermeidungsverhalten gegenüber diesem Duft.
Im Empfindlichkeitstest wurde die Attraktionschwelle ermittelt, indem die mit Urin verbrachte Zeit von der mit Wasser verbrachten Zeit subtrahiert wurde, wobei der Urin gegenüber Wasser bei einer Verdünnung von 1 zu 1000 bevorzugt wurde. Sowohl die experimentellen Gruppen B als auch C benötigten hingegen eine 100-fach höhere Konzentration, um eine Präferenz zu zeigen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Anschließend können mit dieser Vorgehensweise weitere Methoden wie olfaktorisches Lernen und Löschung angewendet werden, um die olfaktorische Plastizität und das Lernen zu untersuchen.
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Übersicht
Diese Studie stellt einen einfachen olfaktorischen Test für Mäuse vor, der die Beurteilung der olfaktorischen Diskrimination, Präferenz, Vermeidung und Empfindlichkeit gegenüber einem neuen Geruch im Vergleich zu Wasser ermöglicht. Die Methode ist effizient für einen einzelnen Experimentator und basiert auf computerunterstützter Videoanalyse.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensanalyse
- Geruchsprüfung
Hintergrund
- Das Experiment zielt darauf ab, angeborene olfaktorische Verhaltensweisen bei Mäusen zu bewerten.
- Es beinhaltet die Exposition gegenüber einem neuen Geruch und einer neutralen Kontrolle (Wasser).
- Das Verhalten wird aufgezeichnet und analysiert, um Präferenzen oder Aversionen zu bestimmen.
- Diese Methode nutzt eine vertraute Umgebung für die Mäuse, wodurch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse erhöht wird.
Zweck der Studie
- Beurteilung der olfaktorischen Diskriminationsfähigkeit bei Mäusen.
- Beurteilung von olfaktorischen Präferenz- und Vermeidungsverhalten.
- Messung der olfaktorischen Empfindlichkeit gegenüber neuen Gerüchen.
Verwendete Methoden
- Mäuse werden einem neuartigen Attraktant oder Reizstoff und Wasser ausgesetzt.
- Die Verhaltenssitzungen werden mit einer Videokamera aufgezeichnet.
- Die Videoanalyse wird mit der Image-J-Software unter Verwendung von Makros durchgeführt.
- Die Ergebnisse werden analysiert, um die mit jedem Geruch verbrachte Zeit zu bestimmen.
Hauptergebnisse
- Die Ergebnisse weisen auf Präferenz- oder Vermeidungsverhalten gegenüber Gerüchen im Vergleich zu Wasser hin.
- Die Verhaltensantworten variieren zwischen verschiedenen Genotypen.
- Die Methode ermöglicht einen schnellen Aufbau und die rasche Durchführung von Experimenten.
- Die computerunterstützte Analyse erhöht die Genauigkeit der Ergebnisse.
Schlussfolgerungen
- Der Geruchstest ist eine zuverlässige Methode zur Beurteilung des olfaktorischen Verhaltens bei Mäusen.
- Die Verwendung einer vertrauten Versuchsanlage vereinfacht den experimentellen Ablauf.
- Dieser Ansatz kann für verschiedene Verhaltensstudien in der Neurowissenschaft von Vorteil sein.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Riechstörung ist ein früher Biomarker in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen, weshalb zuverlässige Riechtests an Nagetieren für die Zielstrukturenvalidierung in der ZNS-Wirkstoffforschung entscheidend sind. Diese Methode ermöglicht eine schnelle, reproduzierbare Beurteilung der angeborenen Geruchswahrnehmung und -empfindlichkeit ohne Nahrungs- oder Wasserrestriktion und unterstützt somit die Hochdurchsatz-Screening-Untersuchung genetischer oder pharmakologischer Interventionen. Durch die Quantifizierung verhaltensbasierter Reaktionen auf Attraktanzien, Aversanzien und Empfindlichkeitsschwellen liefert sie eine mechanistische Entwicklungsrisikominderung für Zielstrukturen, die mit einer Dysfunktion des Riechnetzwerks in Verbindung gebracht werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem Genotyp mit olfaktorischem Verhalten verknüpft wird, und ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen in olfaktorischen Signalwegen.
- Operationaler Wert: Nutzt vertraute Umgebungen und minimale Habituation, reduziert stressbedingte Variabilität und verbessert die Reproduzierbarkeit des Assays über verschiedene Genotypen hinweg.
- Prädiktiver Wert: Erkennt veränderte Geruchspräferenz oder -vermeidung in Knockout-Modellen und unterstützt so die frühe Risikominimierung von Zielstrukturen, die mit neurodegenerativen oder psychiatrischen Indikationen assoziiert sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Metriken für die verbrachte Zeit mittels computerunterstützter ImageJ-Analyse und ermöglicht so einen objektiven Vergleich von Duftstoffantworten zwischen experimentellen Gruppen.
- Operativer Wert: Benötigt lediglich Standardkäfige, Einstreu, Düfte und eine Videokamera, wodurch eine skalierbare Implementierung in Forschungslaboren ohne spezielle Ausrüstung möglich ist.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Charakterisierung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen bei Empfindlichkeitstests und leitet dadurch die Optimierung von Leitsubstanzen ein, indem wirksame Konzentrationsbereiche für geruchsinduziertes Verhalten definiert werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Übereinstimmung mit olfaktorischen Defiziten beim Menschen als prodromale Biomarker und erhöht dadurch die translationale Relevanz von Mausmodellen in der Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die Durchführung langzeitlicher Sensitivitätsprüfungen mittels serieller Verdünnungsreihen und unterstützt so die Verlaufsbeobachtung in präklinischen Wirksamkeitsstudien.
- Prädiktiver Wert: Identifiziert genotypspezifische Schwellenwerte für die Geruchswahrnehmung und leistet damit einen Beitrag zur Patientenstratifizierung sowie zur Auswahl von Zielstrukturen, die auf Biomarker abgestimmt sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen bis hin zur Identifizierung von Leitsubstanzen ein und liefert Verhaltensauslesungen, die vor der Investition in Verbindungen über Go/No-Go-Entscheidungen informieren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Messung der angeborenen olfaktorischen Unterscheidungsfähigkeit und Präferenz und klärt die Genfunktion in sensorischen Verarbeitungswegen auf.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse (Verweildauer in Duft- gegenüber Wasserzonen), die einen zuverlässigen Vergleich der Wirkungen von Substanzen oder Genotypen ermöglichen.
- Analytik: Die computergestützte Analyse liefert reproduzierbare, schwellenbasierte Messungen, die statistische Vergleiche zwischen verschiedenen Behandlungsbedingungen unterstützen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem sie den Verlust der Geruchsempfindlichkeit modelliert, ein Merkmal, das auf klinische Neurodegeneration hinweist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Wiederverwendbar in mehreren Testtypen (Präferenz, Vermeidung, Empfindlichkeit) und bei verschiedenen Mausstämmen; fungiert als plattformbasierte Fähigkeit statt als Einmal-Assay.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in der Funktion olfaktorischer Schaltkreise reduziert werden.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher durch feste Expositionszeiten, verblindete Videoanalyse und interne Wasser-Kontrollen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine schnelle Vorauswahl von Targets mittels kostengünstiger, hochreproduzierbarer Verhaltens-Phänotypisierung ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem Targets identifiziert werden, deren Modulation olfaktorische Phänotypen wiederherstellt oder nachbildet.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Handhabung von Nagetieren, der Verhaltensbeobachtung und in der Anwendung grundlegender Video-Tracking-Software (ImageJ).
- Hängt von konstanten Lichtverhältnissen, der genauen Positionierung der Kamera (58 cm über dem Käfig) sowie der Vorbereitung der Duftstoffe ab (z. B. Verdünnungen von Erdnussbutteröl, Verdünnungsreihen von Urin).
- Erfordert eine standardisierte Durchführung der Gewöhnungsprotokolle und eine verblindete Analyse über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg, um Bedienerbias zu minimieren.
- Die Übertragung auf verschiedene Modellsysteme erfordert die Validierung der Relevanz der Duftstoffe (z. B. artenspezifische Pheromone oder Aversivstoffe).
- Praktische Einschränkung: Die Empfindlichkeit des Tests hängt von einer präzisen Applikation und vollständigen Entfernung der Duftstoffe zwischen den Versuchen ab, um Kreuzkontaminationen – insbesondere bei Empfindlichkeitstests – zu vermeiden.
