Einfache und Computergestützte Riechtests für Mäuse
15. Juni 2015
Wir präsentieren einen einfachen und unvoreingenommenen Geruchstest an Mäusen. Mit diesem Protokoll können die olfaktorische Unterscheidung, Präferenz, Vermeidung und Empfindlichkeit gegenüber einem neuen Geruch im Vergleich zu Wasser in einzelnen Verhaltenssitzungen beurteilt werden. Diese Methode ist für einen einzelnen Experimentator indiziert und die Analyse basiert auf computergestützter Videoverarbeitung.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die angeborene olfaktorische Diskriminierung, die olfaktorische Präferenz oder -vermeidung und die olfaktorische Empfindlichkeit bei Mäusen zu testen. Dies wird erreicht, indem die Maus einem neuartigen Lockstoff oder Beschwerdeführer und einem neutralen Geruch, bei dem es sich um Wasser handelt, ausgesetzt wird. Währenddessen zeichnet eine Videokamera die Verhaltenssitzung auf.
Als nächstes wird das Video in Bild J mit den bereitgestellten Makros analysiert, um die Zeit zu erhalten, die in den Geruchs- und Wasserparametern verbracht wurde. Die Ergebnisse zeigen das Präferenz- bzw. Vermeidungsverhalten von Gerüchen im Vergleich zu Wasser bei verschiedenen Genotypen, basierend auf der post-hoc-computergestützten Analyse. Der Hauptvorteil des Geruchstests gegenüber der Verwendung von dedizierten Arenen und Gerüchen besteht darin, dass er eine vertraute Arena verwendet und daher schnell abgeschlossen und einfach eingerichtet werden kann.
Darüber hinaus wird kostengünstige Hardware verwendet, die das Verfahren von Emmanuel Abry, einem Studenten in meinem Labor, demonstriert. Verwenden Sie für dieses Experiment drei bis fünf Monate alte männliche, C 57 schwarze, sechs Wildtyp- und transgene Mäuse. In dieser Demonstration werden zwei Knockout-Linien und Wurfgeschwisterkontrollen verwendet.
Verwenden Sie für die Versuchsarenen saubere, sterilisierte Mäusekäfige mit drei Zentimetern Einstreu. Bereiten Sie als Nächstes die Kameraeinrichtung vor. Positionieren Sie ihn 58 Zentimeter über dem Käfigboden auf einer individuell angefertigten Stativhalterung.
Machen Sie einige Markierungen auf der Arbeitsplatte, um zu markieren, wo der Käfig stehen sollte. Stellen Sie für ein zentriertes Bild die Kamera so ein, dass sie ein Video mit 320 x 240 Pixeln und einer Geschwindigkeit von ca. 15 Bildern pro Sekunde aufzeichnet. Zur Vorbereitung hat der Testteilnehmer nach Möglichkeit Konzentrate von jedem Duft in Lösungsmittel gelagert.
Für den Präferenztest stellen Sie eine Lösung von 10 Vol.-% Erdnussbutter in Erdnussöl her. Für den Vermeidungstest ist eine Lösung von 98 % zu Methylbuttersäure zu verwenden. Für den Sensitivitätstest wird ein bis zwei Tage vor dem Test weiblicher Urin von einer Maus desselben Stammes gesammelt.
Fesseln Sie ein Weibchen mit dem Bauch über dem Käfiggitter und sammeln Sie Tropfen seines Urins in eine Plastikschale. Sammeln Sie Proben von mehreren Weibchen, um sie zu normalisieren. Für eine individuelle Variabilität ziehen Sie alle Proben in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern es bei minus 20 Grad Celsius.
Um mit der Gewöhnung zu beginnen, setzen die Tiere eines in einen gereinigten Käfig und lassen es erkunden. Fünf Minuten lang sollte die Umgebung des Prüfkäfigs der des Heimkäfigs entsprechen. Wiederholen Sie die Gewöhnungsphase einmal an jedem Testtag, wenn die Gewöhnungsphase beendet ist, starten Sie die Aufzeichnung und pipettieren Sie 60 Mikroliter eines angenehmen Duftes.
In diesem Fall Erdnussbutter auf eine Wand an der gegenüberliegenden Wand geben, die gleiche Menge Wasser pipettieren. Tragen Sie die Tropfen mit einem neutralen Duft etwa 10 Zentimeter an jeder Wand auf. Lassen Sie das Tier nun zwei Minuten lang erkunden, stoppen Sie dann die Aufzeichnung und bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück.
Wiederholen Sie den Vorgang mit jeder Maus, die getestet werden soll. Immer mit neuen Prüfkäfigen. Drei bis fünf Tage Nachdem Sie alle Präferenztests durchgeführt haben, führen Sie den Vermeidungstest mit einem neuen Testkäfig durch.
Führen Sie für jede Maus den Vermeidungstest durch. Ersetzen Sie wie beim Anziehungstest nur den angenehmen Duft durch den Vermeidungsduft, der aus den beiden Methylbuttersäure besteht. Für den Sensitivitätstest kann ein Käfig zwischen Versuchen für dieselbe Maus wiederverwendet werden.
Markieren Sie also die Wasserseite des Käfigs und bereiten Sie sich darauf vor, die kurzen Wände zwischen den Versuchen mit 70% Ethanol getränktem Papier zu reinigen. Am Tag des Experiments werden vier Konzentrationen des Urins mit der zehnfachen Verdünnungsreihe gebildet. Mit doppelt destilliertem Wasser wie beim Vermeidungstest gewöhnen Sie jedes Tier fünf Minuten lang an seinen Testkäfig.
Setzen Sie dann jede Maus zunächst dem Urin in der höchsten Verdünnung aus, die zwischen eins und 10.000 liegt. Tragen Sie während der Aufzeichnung die Urinverdünnung auf den Testkäfig auf und tragen Sie Wasser auf die gegenüberliegende Wand auf. Wie bei anderen Tests auch, lassen Sie das Tier erkunden.
Zwei Minuten lang. Bringen Sie das Tier danach in einen sauberen Mäusekäfig. Nachdem alle Tiere die niedrigste Konzentration festgestellt haben, reinigen Sie alle Wände des Testkäfigs und wiederholen Sie den Test an jeder Maus mit dem nächsthöheren Urin.
Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis der reine Urin getestet ist. Nachdem Sie alle Daten für ein Experiment gesammelt haben, öffnen Sie die Videos in Bild J zur Anpassung und Verarbeitung von Details, die im Textprotokoll unter Verwendung der beschriebenen Protokolle bereitgestellt werden. Zwei verschiedene K.O.-Varianten.
Die Gruppen B und C wurden mit den Kontrollen der Gruppe A verglichen. Der T-Test eines ungerichteten Schülers mit gleicher oder ungleicher Varianz vergleicht die Zeit, die zwischen dem Geruch und dem Wasser innerhalb der Genotypen verbracht wird. Vergleichen Sie das Verhalten zwischen Genotypen mit einer unidirektionalen Inova. Beide Versuchsgruppen B und C zeigten keine Präferenz für den attraktiven Geruch Im Vermeidungstest war die Reaktion auf den abstoßenden Zwei-Methylbuttersäure-Geruch für die Gruppen A und B wie erwartet, aber Gruppe C zeigte kein Vermeidungsverhalten gegenüber diesem Geruch.
Im Sensitivitätstest wurde die Anziehungsschwelle ermittelt, indem die mit Urin verbrachte Zeit von der mit Wasser verbrachten Zeit subtrahiert wurde, wobei der Urin gegenüber Wasser bei einer Verdünnung von eins bis 1000 bevorzugt wurde. Während beide Versuchsgruppen, B und c, eine 100-fach höhere Konzentration benötigten, um eine Präferenz zu zeigen. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in ein paar Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird, dann können nach diesem Verfahren andere Methoden wie olfaktorisches Lernen und Extinktion durchgeführt werden, um die olfaktorische Plastizität und das Lernen zu untersuchen.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert einen unkomplizierten olfaktorischen Test, der für Mäuse entwickelt wurde und die Beurteilung der olfaktorischen Diskriminierung, Präferenz, Vermeidung und Empfindlichkeit gegenüber einem neuen Geruch im Vergleich zu Wasser ermöglicht. Die Methode ist effizient für einen einzelnen Experimentator und basiert auf computergestützter Videoanalyse.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Verhaltensanalyse
- Olfaktorische Tests
Hintergrund
- Das Experiment zielt darauf ab, angeborene olfaktorische Verhaltensweisen bei Mäusen zu bewerten.
- Es beinhaltet die Exposition gegenüber einem neuen Geruch und einer neutralen Kontrolle (Wasser).
- Das Verhalten wird aufgezeichnet und analysiert, um Präferenzen oder Abneigungen zu bestimmen.
- Diese Methode nutzt eine vertraute Umgebung für die Mäuse, was die Zuverlässigkeit der Ergebnisse erhöht.
Zweck der Studie
- Um olfaktorische Diskriminierung bei Mäusen zu bewerten.
- Um olfaktorische Präferenz- und Vermeidungsverhalten zu bewerten.
- Um olfaktorische Empfindlichkeit gegenüber neuen Gerüchen zu messen.
Verwendete Methoden
- Mäuse werden einem neuen Anlockmittel oder Anreizen und Wasser ausgesetzt.
- Verhaltenssitzungen werden mit einer Videokamera aufgezeichnet.
- Die Videoanalyse wird mit Image J Software und Makros durchgeführt.
- Die Ergebnisse werden analysiert, um die Zeit zu bestimmen, die mit jedem Geruch verbracht wurde.
Hauptergebnisse
- Die Ergebnisse zeigen Präferenz- oder Vermeidungsverhalten gegenüber Gerüchen im Vergleich zu Wasser.
- Die Verhaltensreaktionen variieren zwischen verschiedenen Genotypen.
- Die Methode ermöglicht eine schnelle Einrichtung und Durchführung von Experimenten.
- Die computergestützte Analyse erhöht die Genauigkeit der Ergebnisse.
Schlussfolgerungen
- Der olfaktorische Test ist eine zuverlässige Methode zur Beurteilung des olfaktorischen Verhaltens bei Mäusen.
- Die Verwendung einer vertrauten Arena vereinfacht den experimentellen Prozess.
- Dieser Ansatz kann für verschiedene Verhaltensstudien in der Neurowissenschaft von Vorteil sein.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Olfactory dysfunction is an early biomarker in neurodegenerative disease models, making reliable rodent olfaction assays critical for target validation in CNS drug discovery. This method enables rapid, reproducible assessment of innate odor perception and sensitivity without food/water restriction, supporting high-throughput screening of genetic or pharmacological interventions. By quantifying behavioral responses to attractants, aversants, and sensitivity thresholds, it provides mechanistic de-risking for targets implicated in olfactory network dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking genotype to olfactory behavior, enabling functional validation of targets in olfactory pathways.
- Operational Value: Uses familiar environments and minimal habituation, reducing stress-induced variability and improving assay reproducibility across genotypes.
- Predictive Value: Detects altered odor preference or avoidance in knockout models, supporting early de-risking of targets associated with neurodegenerative or psychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative time-spent metrics via computer-assisted ImageJ analysis, enabling objective comparison of odor responses across experimental groups.
- Operational Value: Requires only standard cages, bedding, scents, and a video camera, allowing scalable implementation in discovery labs without specialized equipment.
- Predictive Value: Supports dose-response characterization in sensitivity testing, informing lead optimization by defining effective concentration ranges for odorant-evoked behaviors.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human olfactory deficits as prodromal biomarkers, enhancing translational relevance of mouse models in neurodegenerative disease research.
- Operational Value: Enables longitudinal sensitivity testing through serial dilution series, supporting progression tracking in preclinical efficacy studies.
- Predictive Value: Identifies genotype-specific thresholds for odor detection, aiding in patient stratification and biomarker-aligned target selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing behavioral readouts that inform go/no-go decisions prior to compound investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring innate olfactory discrimination and preference, clarifying gene function in sensory processing pathways.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (time in odor vs. water zones) that enable reliable comparison of compound or genotype effects.
- Analytics: Computer-assisted analysis provides reproducible, threshold-based measurements that support statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling olfactory sensitivity loss, a feature predictive of clinical neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Reusable across multiple test types (preference, avoidance, sensitivity) and mouse strains, functioning as a platform capability rather than a single-use assay.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in olfactory circuit function.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through fixed exposure times, blinded video analysis, and internal water controls.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of targets using low-cost, high-reproducibility behavioral phenotyping.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying targets whose modulation rescues or recapitulates olfactory phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, behavioral observation, and basic video tracking software (ImageJ).
- Dependent on consistent lighting, camera positioning (58 cm above cage), and odorant preparation (e.g., peanut butter oil dilutions, urine dilution series).
- Necessitates cross-team standardization of habituation protocols and blind analysis to minimize operator bias.
- Adaptation across model systems requires validation of odorant relevance (e.g., species-specific pheromones or aversants).
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on accurate odorant delivery and cleanup between trials to prevent cross-contamination, particularly in sensitivity testing.
