TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen Drosophila Embryos

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, an der Translations-RNA beteiligte RNA auf zelltypisierte Weise in Drosophila-Embryonen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen aus einer transgenen Fliegenlinie entnommen werden, was eine spezifische Expression der A-GFP-markierten ribosomalen Untereinheit im Zielzelltyp, in diesem Fall den Slouch-Muskelzellen, ermöglicht. Der zweite Schritt besteht darin, ein Lysat zu erzeugen, um ein Polysomenpräparat zu erhalten, das eine Mischung aus markierten und nicht markierten Ribosomen enthält.

Als nächstes wird die Proteinkonzentration im Lysat geschätzt und die Affinitätsreinigung mit Beads durchgeführt, die an GFP-Antikörper gekoppelt sind, um Ribosomen-RNA-Komplexe aus dem interessierenden Zelltyp zu erfassen. Der letzte Schritt ist dem Triol, der RNA, der Extraktion und der Reinigung gewidmet. Letztendlich werden Qualitäts- und Spezifitätsbewertungen mit einem Bioanalysator bzw. R-T-Q-P-C-R durchgeführt.

RNA kann dann für die globale quantitative Analyse durch RNA-Sequenzierung oder Microarrays verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik unserer bestehenden Methode, wie der VX-Sortierung, besteht darin, dass sie keinen Labo-Schritt der Zelldissoziation erfordert. Es kann auf der Bank durchgeführt werden.

Es ist schnell und ermöglicht die direkte Identifizierung von translatierter RNA in sehr kleinen Zellpopulationen, was ein Messwert für das Verständnis des Erwerbs von Zelleigenschaften ist. Auch wenn diese Methode einen Einblick in die Myogenese im Josephinen-Embryo geben kann, kann sie auch auf andere Gewebe oder moderne Organismen wie Pflanze, Zebra, Fisch oder Maus angewendet werden und könnte auch helfen, die Auswirkungen der Behandlung auf die Proteinsynthese im Falle einer Pathologie zu verfolgen. Benjamin Berta, ein Doktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Nach der Entwicklung beider transgener Linien gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls und der Kreuzung zur Erstellung der transgenen Linie mit doppelter Kreuzung wird die Linie amplifiziert, indem zunächst acht große zylindrische Populationskäfige mit etwa 40 Gramm junger Fliegen pro Käfig vorbereitet werden. Das entspricht rund 180.000 Fliegen pro Käfig.

Bereiten Sie Petrischalen mit einem Durchmesser von 11 Zentimetern vor, die eine Mischung aus erstarrtem Agar und Traubensaft enthalten, wobei ein Drittel der Oberfläche mit frisch hergestellter Hefepaste bedeckt ist, und lassen Sie die Fliegen eine Stunde lang Eier auf diese Platten legen. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf zwei weiteren Sets frischer Traubensaftplatten, damit die Fliegen ihre Blütenblätter vollständig entleeren können. Die gewünschten doppelt-transgenen Embryonen aus der Kreuzung werden auf die vierte Platte gelegt.

Nehmen Sie die Platten mit den gewünschten Embryonen aus den Käfigen und lassen Sie sie bei Raumtemperatur bis zum gewünschten Entwicklungsstadium inkubieren. Hier kommt eine 13-stündige Inkubation zum Einsatz. Anschließend den Platteninhalt mit etwa 50 Millilitern Wasser mit einem Pinsel resuspendieren.

Trennen Sie die Embryonen von den toten Fliegen, indem Sie die Flüssigkeit durch drei Siebe mit Durchmessern von 700, 355 und 112 Mikrometern passieren. Spülen Sie die entnommenen Embryonen in einem Sieb mit dem kleinsten Durchmesser mit dem ionisierten Wasser ab. Beschichten Sie die Embryonen zwei Minuten lang mit 4,5%igem Bleichmittel in ionisiertem Wasser und spülen Sie sie dann 30 bis 60 Sekunden lang gründlich mit dem ionisierten Wasser aus.

Inkubieren Sie die Embryonen in PBS 0,01%T zwischen 20 und 100 Mikrogramm pro Milliliter. Cycloheide für fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren. Nachdem Sie die Embryonen auf saugfähigen Zelluloseblättern getrocknet haben, übertragen Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen, wiegen Sie die Röhrchen und frieren Sie die Embryonen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff ein.

In diesem Stadium können die getrockneten Embryonen mehrere Monate bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. 1,5 Gramm der getrockneten Embryonen werden in vorgekühlte 15-Milliliter-Röhrchen überführt, die vier Milliliter Polysomenextraktion enthalten, puffern und homogenisieren. Mit einer sterilen serologischen 10-Milliliter-Pipette.

Verteilen Sie dann die homogenisierten Embryonen in zwei Pre-Chill-Röhrchen mit zwei Millilitern und mahlen Sie die Embryonen in einer multidirektionalen Bead-Mühle mit hoher Geschwindigkeit. Zweimal für 10 Sekunden bei 5.000 U/min mit einer Pause von 15 Sekunden zwischen jedem Zyklus. Nach 10 Minuten Zentrifugation bei 2000 g wird das Lysat in ein frisches, vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis überführt.

10%non P 40 zum S-Überstand bis zu einer Endkonzentration von 0,1% geben und vorsichtig mischen, indem das Röhrchen umgedreht wird. 300 Mikromolar DHPC in eine Endkonzentration von 30 Millimolar geben und vorsichtig mischen, indem das Röhrchen umgedreht wird. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang auf Eis und mischen Sie sie während der Inkubation mehrmals durch Inversion.

Nach der Inkubation im Eis. Bereiten Sie das postmitochondriale Supinat durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 20.000 G vor. Nachdem Sie die Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode gemessen und eine Proteinkonzentration zwischen 60 und 80 Milligramm pro Milliliter erhalten haben, übertragen Sie das SNAT in ein frisches, vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen und fahren Sie sofort mit dem Vorabsorptionsschritt fort. Die magnetischen Kügelchen werden durch leichtes Rühren resuspendiert und anschließend 30 Mikroliter Kügelchen pro Milliliter Lysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

Sammeln Sie die Kügelchen auf dem Magneten, pipettieren Sie die Schlinge ab und resuspendieren Sie die Kügelchen und 500 Mikroliter Polysomen-Extraktionspuffer. Sammeln Sie als Nächstes die Perlen auf dem Magneten. Auch hier wird embryonales Lysat zugegeben und eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotator inkubiert.

Entfernen Sie die Kügelchen und legen Sie das Mittel in Rückenlage bis zum Immunreinigungsschritt auf Eis. Reservieren Sie 100 Mikroliter des Supinats als globale RNA-Probe für den Vergleich mit der Probe, die nach der Immunreinigung zur Immunreinigung der Probe entnommen wurde, und geben Sie einen Milliliter vorabsorbiertes Lysat in ein RNA-freies Röhrchen, das 90 Mikroliter blockierter Kügelchen enthält, die an den GFP-Antikörper gekoppelt sind. Inkubieren Sie die Probe zwei Stunden lang oder über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanftem Durchgehen in einem Röhrchenrotator nach der Inkubation.

Waschen Sie die Perlen, indem Sie zuerst die restlichen Kügelchen in einer Mini-Zentrifuge herunterschleudern. Dann auf einem Magneten sammeln, in 500 Mikrolitern waschen, puffern und nach und nach inkubieren. Beenden Sie das Mischen 10 Minuten im Kühlraum und sammeln Sie erneut die Kügelchen auf dem Magneten.

Übertragen Sie die Kügelchen in ein frisches, vor dem Schild R RNAs freies Röhrchen und waschen Sie sie noch zweimal. Nachdem Sie die Kügelchen auf dem Magneten gesammelt haben, fahren Sie mit der RNA-Extraktion fort, indem Sie den Kügelchen einen Milliliter TRIOL hinzufügen und die Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durchführen. Führen Sie anschließend eine RNA-Reinigung mit einem RNEZ-Mikrokit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.

Um die Spezifität der gefangenen RNA zu testen, führen Sie eine reverse Transkription an drei Nanogramm immungereinigter und eingegebener RNA nach Standardverfahren durch. Verwenden Sie dann die für die QPCR erhaltene CDNA mit genspezifischen Primer-Sets. Dieses konfokale Bild eines Embryos im Stadium 16 zeigt die Expression von RPL 10 A-E-G-F-P, spezifisch in den sechs Slouch-Muskelzellen in jedem HEMI-Segment, eine Kolokalisation von RPL 10 A-E-G-F-P mit dem allgemeinen Muskelmarker beta drei Tubulin wird beobachtet.

Die eingeschlossene RNA wurde zu Qualitätskontrollzwecken auf einem Bioanalysator laufen lassen. Beachten Sie die perfekte Integrität von einer Acht-s- und zwei Acht-s-ribosomalen RNAs. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse einer RT-QPCR-Analyse an drei biologischen Replikaten von Embryonen im Stadium 16 und zeigt die hohe Spezifität von isolierter mRNA aus der Falle.

Die FO-Änderung wurde im Vergleich zur Eingabe berechnet und gegen das RPL 32-Genmeth normiert. Zwei Transkripte, die in allen Muskellinien vorhanden sind, sind im Vergleich zum Input 2,3-fach angereichert, während eingeschränktere Slouch-Transkripte 5,6-fach angereicherte Nervenzellen sind, die Prospero exprimieren, und Socken und Gene sind nach ihrer Entwicklung 2,2-fach bzw. 5,5-fach erschöpft. Diese Technik ebnete Forschern, insbesondere auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, den Weg zur Erforschung des Selbsthilfeengagements und des Erwerbs von Zelleigenschaften während der Differenzierung von Doof-Embryonen.