Name: TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Erfahren Sie die TRAP-Methode zur Isolierung von mRNA aus seltenen Zellpopulationen in Drosophila-Embryonen. Dieses Protokoll ermöglicht zellspezifische Translationsanalysen ohne Zellauflösung.

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Die Autoren danken Nicolas Allegre, Maud Peyny und Jean-Philippe Da Ponte für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), das INSERM Starting Grant, das ANR ID-CELL-SPE Stipendium, das Equipe FRM und das AFM 15845 Stipendium.

1. Fliegenschnur Erstellung <ol><li> Generieren Sie zwei verschiedene Konstrukte. In dem ersten Konstrukt wird RpL10A cDNA (ribosomale Protein-Untereinheit L10a) stromabwärts von GFP kloniert in pUASP-PL-GFP-Nter Plasmid (modifizierte Version von 32). Die Verwendung einer Keimbahn-Promotor erlaubt eine polyvalente Nutzung der transgenen Linie. ANMERKUNG: Beziehen Sie das zweite Konstrukt durch Klonierung des regulatorischen Sequenz Fahrgewebespezifische Expression des slouch Gen stromaufwärts von GAL4 (TF) mit pPTGAL4 Plasmid. </li><li> Injizieren Plasmide getrennt in w 1118 Fliegen und legen Konstrukte in-the-fly-Genom durch P-Element-Insertion (nach Standard-Verfahren) 33. </li><li> Wählen Sie Trans um Fliegenlinien mit Konstrukten auf zwei verschiedenen Chromosomen erholen. Die endgültige TRAP Linie wird durch die Kombination dieser beiden Linien (genetische Kreuze), um ein Doppel-transgenen stabile Linie zu bekommen erstellt. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / SCU; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massiv verstärken diese Linie und sammeln Sie die gewünschten inszeniert Embryonen. </li></ol> 2. Embryonen <ol><li> Bereiten Sie 8 große zylindrische Bevölkerung Käfige mit jeweils etwa 40 g junger Fliegen pro Käfig (rund 180.000 Fliegen / Käfig). </li><li> Fahren Sie mit dem so genannten Pre-Lays, die Fliegen zu entwickelnden Embryonen aus ihren Eileitern löschen lassen. Dafür lag die Fliegen für 1 Stunde auf zwei 11 cm-Durchmesser Petrischalen, die eine Mischung aus erstarrtem Agar und Traubensaft und decken ⅓ der Oberfläche mit frisch zubereiteten Hefepaste. Nach 3 Austausch von Traubensaft Platten sammeln die realen Embryos auf ähnliche frisch zubereiteten Platten. Hinweis: Die Inkubationszeit wird nach Entwicklungszeitfenster untersucht variieren. </li><li> Platten entfernen von Käfigen und lassen Sie sie bei der gleichen Temperatur für den Zeitaufwand für die richtige Entwicklungsstufe (zB 3 Stunden der Eiablage + 10 h addit erhaltenional Inkubation erhält man Embryonen aus Stadium 10 bis 13 Stunden nach der Eiablage (AEL)). Resuspendieren Platte Inhalt (Embryonen, Hefepaste, tote Fliegen) mit 50 ml Wasser mit einer Bürste. </li><li> Gehen durch eine Reihe von Sieben (700 &amp; mgr; m, 355 &amp; mgr; m, 112 &amp; mgr; m) Embryonen aus toten Fliegen und restlichen Körperteilen zu trennen und sammeln Embryonen auf dem kleinerem Durchmesser Sieb zurückgehalten, dann kurz waschen in VE-Wasser. Verwenden Sie nicht mehr als 18 Platten pro Sammlung, wie es die Siebe verstopfen. </li><li> Dechorionate Embryonen in 4,5% Bleichmittel in VE-Wasser für 2 Minuten und gründlich mit VE-Wasser für 30-60 Sekunden. Inkubieren Embryonen in PBS 0,01% Tween 20, 100 ug / ml Cycloheximid für 5-10 min bei RT unter Rühren. </li><li> Trockener Embryonen auf Celluloseabsorptionslagen und sie auf Mikrozentrifugenröhrchen. Wiegen Sie die Rohre und Flash-Einfrieren der Embryonen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff. In diesem Stadium können die getrockneten Embryonen für mehrere Monate bei -80 ° C gelagert werden. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Vorbereitung der Magnetic Beads bis GFP Antikörper gebunden <ol><li> Gründlich resuspendieren Protein G magnetischen Kügelchen in der Originalflasche durch leichtes Schütteln. </li><li> Transfer 90 ul von Perlen auf ein RNase-freies Rohr und sammeln sie auf einem Magneten (30-60 sec). 90 ul Perlen notwendig ist, Immunpräzipitation (IP) mit 1 ml Lysat, 60-80 mg / mL Proteine ​​führen. Respektieren Verhältnisse zu Wulst Sättigung zu verhindern. Verwenden mehrere Rohre nach Proteinmenge. </li><li> Wash Perlen mit 1 x PBS 0,01% Tween 20 (500 ul) und sammeln Perlen auf dem Magneten, um Überstand verwerfen. Werden 30 ug des GFP-Antikörper in 350 ul PBS 0,01% Tween 20 auf die Kügelchen und Inkubation bei langsamen Kopfüber-Mischung für 30 min bei RT. </li><li> Sammeln Perlen auf dem Magneten (30-60 sec), Überstand verwerfen und gründlich in 500 ul Extraktionspuffer Polysomen (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl 2 5 mM, DTT 0,5 mM Triton 1%, Cycloheximid 100 ug / ml , Protease Inhibitor 1 ×, RNase-Inhibitor 100 U). </li><li> Sammle Perlen auf dem Magneten und fügen Sie 500 ul Blockierungspuffer (BSA 0,1 ug / ul, Hefe-tRNA 0,1 ug / ul, Glykogen 0,1 ug / ul in Polysom ​​Extraktionspuffer). </li><li> Inkubation für 30 min bei RT und wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit frischem Blockierungspuffer. </li><li> Sammle Perlen auf dem Magneten und spülen in 500 ul Polysom ​​Extraktionspuffer, dann erinnern Perlen und gehen sofort in den Immun Schritt (Abschnitt 6). </li></ol> 4. Lysatherstellung <ol><li> Bevor Sie beginnen, das Programm einzurichten auf der multidirektionale schnelle Geschwindigkeit Perlen Grinder: 2 x 10 sec bei 5000 Umdrehungen pro Minute, 15 Sekunden Pause. Transfer getrockneten Embryonen (1,5 g), um 15 ml Röhrchen auf Eis enthält Polysom ​​Extraktionspuffer vorgekühlt, und homogenisieren sofort. Homogenisieren 1,5 g Embryonen in 4 ml Extraktionspuffer Polysomen. </li><li> Spread homogenisiert Embryonen in zwei vorgekühlt 2 ml-Röhrchen und schleifen die embryos, indem Sie den Homogenisator Programm. Übertragen Sie das Lysat in frische vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und bereiten eine postnukleäre Stand durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 min bei 2000 g. </li><li> Überstand in ein frisches vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, fügen 1/100 Probenvolumen von 10% Nonidet P-40 zu dem Überstand (Endkonzentration = 0,1%), und mischen Sie sie vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens. </li><li> Puls Zentrifuge die Probe in einer Minifuge um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln, fügen 1/9 Probenvolumen von 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (DHPC) (Endkonzentration = 30 mM ), mischen Sie es vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens, und Inkubation der Mischung auf Eis für 5 min (Mischung durch mehrmaliges Wenden während der Inkubation). </li><li> Vorbereitung der post-mitochondrialer Überstand durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 Minuten bei 20.000 g. Messung der Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode: Konzentration im Lysat sollte zwischen 60-80 mg / ml sein. Take den Überstand in ein frisches neues vorgekühltem Mikrozentrifugenröhrchen und gehen sofort in den Pre-Absorptionsstufe (Abschnitt 5). </li></ol> 5. Pre-Absorption <ol><li> Die Magnetperlen gründlich durch vorsichtiges Schütteln resuspendieren und Transfer 30 ul Kügelchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur (30 &amp; mgr; l Perlen / 1 ml embryonalen Lysat). </li><li> Sammle Perlen auf dem Magneten, einer Pipette aus dem Überstand und resuspendieren die Perlen in Polysom ​​Extraktionspuffer (500 ul). Sammle Perlen auf dem Magneten, fügen embryonalen Lysat, und Inkubation für 1 h bei 4 ° C auf einem Rotator. <ol><li> Perlen bringen und Überstand auf Eis zur Immun Schritt. Vor Immun, halten 100 ul Überstand (Eingang) zur globalen RNA-Probe mit der RNA-Probe, nachdem Immun gesammelt, durch RT-qPCR zum Beispiel zu vergleichen. </li></ol></li></ol> 6. Immunreinigung <ol><li> 1 ml (entspricht 60-80 mg / ml Protein)pre-absorbiert Lysats auf ein RNase-freies Röhrchen mit 90 ul blockierter Perlen GFP-Antikörper gekoppelt ist. Inkubieren der Proben bei 4 ° C für 2 Stunden unter leichtem end-over-end Mischen in einem Rohrdrehgelenk. Alternativ führen die Inkubation O / N bei 4 ° C. </li><li> Nach der Inkubation, sammeln Perlen auf dem Magneten. Verwenden Sie einen Minifuge sich zu drehen, die Perlen, so resuspendieren sie in 500 ul Waschpuffer (Hepes 10 mM, KCl 350mm, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1% DTT 0,5 mM, Cycloheximid 100 ug / ml, RNase-Inhibitor 100 U ) und sammeln sie auf dem Magneten. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. </li><li> Ändern Sie die Perlen auf eine neue vorgekühltem RNase-freies Rohr und zwei Mal waschen. Sammle Perlen auf einem Magneten und zur RNA-Extraktion durch Zugabe von 1 ml Trizol direkt an die Beads und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 7. RNA Sanierung und Qualitätsbewertung <ol><li> Verwenden Sie eine RNeasy Micro Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Bei Fertigstellung Elute-RNA mit (x) &amp; mgr; l RNase-freies Wasser. Warm für 2 min bei 60 ° C, und speichern schockgefroren Proben bei -80 ° C. Überprüfen RNA-Qualität mit Bioanalyzer (folgen Sie den Anweisungen des Herstellers). </li><li> Um die Spezifität des Traped RNA zu testen, führen die reverse Transkription von 3 ng gereinigte RNA (Ein- und IP) nach den Anweisungen des Herstellers (hochgestellte III). Verwenden Sie das für die qPCR mit Gen-spezifischen Primer-Sets erhalten cDNA. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Papier beschreibt eine modifizierte Translating Ribosom Affinitätsreinigung Protokoll (genannt &quot;TRAP-rc &#39;) auf die Untersuchung von seltenen Zellpopulationen in Drosophila-Embryos gewidmet. Informationen über die wesentlichen Schritte für eine erfolgreiche Isolierung von spezifischen RNA mit einer Ausbeute geeignet für Microarray-oder RNA-seq-Analyse, dh 1) Menge an biologischem Material erforderlich ist und optimierte Verfahren für die Embryo-Lyse und Polysom ​​Extraktion bereitgestellt; 2) Perlen / Antikörper-to-Lysat Verhältnissen für eine optimale Immunfällung; 3) die Schritte ermöglicht Reduzierung der Hintergrund einschließlich Waschpuffer-Zusammensetzung, um TRAP-rc Experimente mit hoher Spezifität und Sensitivität geführt. Dieses Protokoll liefert reproduzierbare Daten macht es leicht auf andere Zelltypen verwendet. Diese Technik ermöglicht es, differentiellen Genexpression auf der Ebene der aktiv-Übersetzung von mRNA zu analysieren und damit den Weg zum Verständnis der Proteinexpression in einer spec<html> ific Zelltyp in einem bestimmten Zeitfenster. Man beachte jedoch, dass Proteinmenge wird auf die Geschwindigkeit der Übersetzung und Abbauprozesse abhängen. Eine Hauptbeschränkung der Trap-Verfahren ist die Unfähigkeit, Proteingehalt in einer genauen quantitativ zu messen oder posttranslationale Modifikation detektieren. Verbesserung der Quantifizierung durch Messung Ribosom Dichte entlang der mRNA Körper und, damit, in einem zelltypspezifische Weise können TRAP kombiniert mit Ribosomen-Footprinting ein sehr leistungsfähiges Werkzeug zu machen. In einer aktuellen Arbeit 34 wurde diese Verbindung in menschliche embryonale Nieren-293-Zellen durchgeführt. Die Autoren lief Nuklease Footprinting, gefolgt von Affinitätsreinigung eines induzierbaren biotinylierten Form RpL10A mit Streptavidin-Kügelchen. Dies ist ein Beweis für das Prinzip, daß es möglich ist, Ribosom-Footprinting in einem gesamten Organismus durchzuführen, während Targeting eines spezifischen Zelltyps, die Begrenzung wobei die Menge des biologischen Materials zum Zwecke erforderlich. &quot;&gt; Darstellende TRAP Experimenten parallel globale Transkriptom Analysen ermöglichen es, Proportionen zwischen neu transkribiert und actively- übersetzen RNA. Diese wird tief informative der potenziellen posttranskriptionale Mechanismen, die sich in spezifischen Entwicklungszusammenhängen oder spezifischer Zellpopulationen sein verfolgen -durch microRNAs zum Beispiel. Zusammenfassend ist TRAP eine hoch effiziente, spezifische und sensitive Methode zur Identifizierung RNAs aktiv umsetze Ribosomen in einer zellspezifischen Weise gebunden. Dieses Verfahren kann in einer breiten Vielfalt von Organismen und Gewebetypen verwendet werden. Das hier beschriebene neue TRAP-rc-Protokoll wurde für seltene Zellpopulationen (weniger als 1% der Gesamtzellzahl) und für eine Menge von Endmaterial ausreichend für spätere Analysen bei Gesamtgenom-Niveau optimiert. Eine mögliche Einschränkung dieses Verfahrens ist das Erfordernis einer starken Treiber, den markierten Ribosomen in ausreichender Menge zu produzieren, um compete mit endogenen untagged diejenigen in der Zielzelltyp. In einer neueren Studie 25. geschätzten Autoren zu 10-30% das Verhältnis von markierten gegen unmarkierte Ribosomen. Um dieses Problem zu steigenden UAS-RpL10A-EGFP Kopienzahl sollte dieses Gleichgewicht deutlich verbessern zu überwinden. Alternativ, zusätzlich zu den beschriebenen genetischen Hintergrund ein UAS-GAL4-Transgens wird die Produktion von GAL4-Protein zu verstärken und die Expression von RpL10A-EGFP indirekt zu erhöhen. Dies sollte eine bessere Auslastung von markierten Ribosomen auf mRNA begünstigen. Beachten Sie, dass dies bereits effizienten Ansatz kann noch leistungsfähiger durch Anpassung komplementäre Methoden, um einen quantitativen Aspekt zu bringen oder zu entdecken und zu entwirren, die molekularen Mechanismen, die für die Genexpression Kontrolle vorgenommen werden.

Zu verstehen, wie Zellen während der Entwicklung bestimmte Eigenschaften zu erwerben, ist, um die Komplexität der Organe und deren potenzielle Entwicklung hin zu pathologischen Bedingungen zu schätzen wissen von entscheidender Bedeutung. Es gibt einen großen Forschungs Push, um die Gen-regulatorischen Netzwerke, die das Zell Spezifizierung und Differenzierung zugrunde liegen durch unrevealing globalen Genexpressionsprofile zu entziffern, Pol II bindenden Status, Transkriptionsfaktor-Belegung am regulatorischen Sequenzen bzw. post-translationale Modifikationen von Histonen. Um die Genexpression auf globaler Ebene Microarrays zu bewerten und RNA-seq Ansätze verwendet. Microarrays erlauben, mRNA-Häufigkeit zu erkennen, während RNA-seq ist besser auf die Information über die verschiedenen Arten von RNAs einschließlich codierenden und nichtcodierenden RNAs wie microRNAs, lncRNAs oder snRNAs. Jedoch können diese Techniken nicht zu unterscheiden aktiv transkribierten, stationären mRNA aktiv umsetze mRNA und mRNA in die Abbauprozess. Mess stationären staß mRNA-Spiegel ist bekannt, dass eine schlechte Schätzung des Proteoms Zusammensetzung 1-3 sein. Im Gegenteil, die Identifizierung aktiv-Übersetzung von mRNA ergibt ein genaueres Bild der Proteinproduktion. Allerdings transkriptomischen Studien vor allem auf ganze Organismus Ebene durch den Vergleich Gewinn oder Verlust der Funktion eines bestimmten Faktor zu Wildtyp-Zustand 4-7 oder seziert Gewebe, so dass Genexpressionsprofile schwer zu interpretieren geführt worden. Jüngste Fortschritte in der Zell-Targeting-Tools, Affinitätsreinigung und Empfindlichkeit Verbesserungen erlauben jetzt ausführen genomweiten Analysen zu kleinen Zellpopulationen oder sogar einzelne Zellen in einem lebenden Organismus. In Drosophila, große Sammlungen von transgenen Linien ermöglichen es, bestimmte zeitliche und räumliche Ausrichtung der verschiedenen Geweben und Zellpopulationen über den GAL4 / UAS-System 8-10 wodurch genauere Quantifizierung der molekularen Mechanismen für die Zellfunktion notwendig. 11 beschrieben. Diese Methode basiert auf Sucrosegradientenzentrifugation ermöglicht die Auswahl der Polysomen-Fraktion und Bestimmung von mRNA übersetzt genomweite, wenn sie mit Microarrays oder tiefe Sequenzierung analysiert. Polysom ​​Isolation kann mit Nucleaseverdau um ribosomale Fußabdrücke entsprechenden RNA-Fragmente durch die Ribosomen während des Übersetzungsprozesses 12 geschützt identifizieren gekoppelt werden. Ribosomalen Footprinting erhöht die Genauigkeit der Quantifizierung der RNA-Translation und RNA-Sequenzlevel Auflösung und Ribosom Positionierung ermöglicht es, Translationsrate zu messen. Jedoch ist es bis heute nicht zellspezifische Isolierung translatomes aufgebracht worden ist, vor allem aufgrund der starken Abnahme der RNA-Ausbeute am Ende des Ribosoms Footprinting Verfahren erhalten. Da die Größenauswahl der RNA kann potenzielle Falsch p zu erzeugenositives aus verschiedenen RNPs, die auch sein könnte Schutz RNA auf ähnliche Weise werden weitere Entwicklungen notwendig, um ribosomale Fußabdruck zu verbessern und ihre Anpassung an zellspezifische Ansätze. Eines dieser Verfahren, die so genannte Translating Ribosom Affinitätsreinigung (TRAP) wurde im Jahr 2008 von Heiman et al. und auf die translatome aus einer Untergruppe von Neuronen bei Mäusen zu isolieren. Durch Epitop-Markierung des ribosomalen Proteins in einem zelltypspezifischen Weise kann Polysomen selektiv ohne den mühsamen Schritt der Zelldissoziation und Sortierung gereinigt werden. In diesem Fall wurde die 60S ribosomale Protein L10a an der Oberfläche des Ribosoms mit eGFP 13 markiert. Seit 2008 haben mehrere Studien diese Methode in verschiedenen Arten verwendet werden, die von Mäusen 14-19 bis X laevis 20,21, Zebrafisch 22,23 und Arabidopsis thaliana 24. Die TRAP-Methode wurde auch auf die Drosophila-Modell angepasst und verwendet nach Purify Zelltyp-spezifischen mRNAs von neuronalen Zellen 25 und 26 Astrozyten. Die vielseitige binären GAL4 / UAS-System wurde verwendet, um die GFP-markierten RpL10A in einer gewebespezifischen Weise exprimieren. Leiter der erwachsenen Fliegen wurden seziert, um Polysom ​​Auswahl aus neuronalen Zellen (von pan-neuronalen Elav-Gal4-Treiber gezielte) und isolierten RNAs durchzuführen, wurden sequenziert. Die große Zahl der hochregulierten Genen entsprachen denen bekannt ist, im Nervensystem exprimiert werden, was darauf hinweist, dass der Ansatz eine gute Spezifität und uns eingibt, um es in seltenen Zellpopulationen anzupassen (weniger als 1% der Zellen) vorhanden entwickeln Drosophila-Embryonen . Innerhalb der Drosophila-Modell ist das Embryonalstadium ein Modell der Wahl für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen, wie die molekularen Akteure und Gestaltungsbewegungen sind evolutionär konserviert. Die einzigen Gewebe-spezifische transkriptomischen Ansätze bisher in diesem Modell durchgeführt wurden unter Verwendung von Zellen oder Kern sorting und haben nur einen stabilen Zustand für Transkriptom 27-31 Studie nachgewiesen, wodurch ein Bedarf für Verfahren, um Gewebe / Zell-spezifische translatome Profilierungsfliegenembryo gewidmet. Hier haben wir die erste TRAP-Protokoll, um Drosophila-Embryos gewidmet melden. Mit diesem Verfahren Eingriff-in-Übersetzung mRNA in einer sehr begrenzten Zellpopulation von etwa 100 Muskelzellen pro Embryo wurde erfolgreich mit hoher Qualität und Spezifität isoliert. Der binäre GAL4 / UAS-System wird verwendet, um die Expression von GFP-markierten RpL10A in Subpopulation von Muskeln ohne Toxizität zu fahren, da keine scheinbare Phänotypen oder Entwicklungsverzögerung zuvor. 25 gezeigt Drosophila-Embryos besitzen 30 Muskeln pro hemisegment, die Anlass zu der Muskulatur geben der Larve. Durch Verwendung einer regulatorischen Region in der Nähe der Niete Identität Gen entdeckt, 6 der 30 mehrkernigen Muskeln, werden angezeigt. In diesem Test werden die Ribosomen auf der mRNA unter Verwendung des immobilisierten TranslationselongationInhibitor Cycloheximid. Cytosolische Extrakte werden dann zur Affinitätsreinigung mit GFP Antikörper-beschichteten magnetischen Perlen verwendet. Qualität der gereinigten RNA wurde unter Verwendung Bioanalyzer validiert. Quantitative reverse Transkriptions-PCR (RT-qPCR) wurde verwendet, um die Spezifität und Empfindlichkeit der Isolierung der mRNA zu bestimmen, und gezeigt, dass unsere verbesserte Protokoll ist sehr effizient.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>thermo wissenschaftlich&nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigtes BSA 100X&nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Hefe tRNA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper GFP-Klon N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antikörper Incorporated</td><td>75-132&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lyse-Homogenisierung&nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Angewandtes Biosystem&nbsp;</td><td></td><td></td>AM96406</tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)&nbsp;</td><td>Angewandtes Biosystem&nbsp;</td><td></td><td></td>AM95306</tr><tr><td>Zellulosewatte, ungebleicht&nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siebe 112, 355, 710 um&nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare</td><td></td><td></td>28948964</tr><tr><td>Filterspitzen mit geringer Bindung&nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase freie Tube 1,5 ml&nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Fischer Bioreagenz&nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximid&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Tabletten, Mini-Complete, EDTA-frei&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translating ribosom affinitätsreinigung von rare zellpopulationen<em&gt; drosophila</em&gt; embryos

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Die Messung des Niveaus von mRNAs während des Translationsprozesses in einzelnen Zellen liefert Informationen über die Proteine, die zu einem bestimmten Zeitpunkt an zellulären Funktionen beteiligt sind. Das Protokoll mit dem Namen Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) ist in der Lage, diesen mRNA-Translationsprozess auf zelltypspezifische Weise zu erfassen. Basierend auf der Affinitätsreinigung von Polysomen, die eine markierte ribosomale Untereinheit tragen, kann TRAP für Translatomanalysen in einzelnen Zellen eingesetzt werden, wodurch es möglich ist, Zelltypen im Verlauf von Entwicklungsprozessen zu vergleichen oder den Fortschritt der Krankheitsentwicklung und die Auswirkungen potenzieller Therapien auf molekularer Ebene zu verfolgen. Hier berichten wir über eine optimierte Version des TRAP-Protokolls, genannt TRAP-rc (rare cells), die sich der Identifizierung von in der Translation engagierten RNAs aus seltenen Zellpopulationen widmet. TRAP-rc wurde unter Verwendung des Gal4/UAS-Targeting-Systems in einer begrenzten Population von Muskelzellen in Drosophila-Embryonen validiert. Dieses neuartige Protokoll ermöglicht die Rückgewinnung von zelltypspezifischer RNA in ausreichenden Mengen für die globale Genexpressionsanalytik wie Microarrays oder RNA-seq. Die Robustheit des Protokolls und die großen Sammlungen von Gal4-Treibern machen TRAP-rc zu einem äußerst vielseitigen Ansatz mit potenziellen Anwendungen in zellspezifischen genomweiten Studien.

Die Drosophila embryonalen somatischen Muskulatur wird von 30 Muskeln pro hemisegment zusammengesetzt, und jeder Muskel hat einen bestimmten Satz von Eigenschaften: Codeidentitätsgene, Position, Anzahl der Fusionsereignisse, Befestigungsstellen und Innervation. Identifizieren übersetzt mRNA in einer bestimmten Muskeluntergruppe geben Informationen über die erforderlich ist, um diese spezifische Muskel Eigenschaften bilden Proteine. Verwenden des TRAP-basierte Verfahren, RNA aus einer Subpopulation von Muskeln, die Identität Gen slouch exprimiert, wurde gereinigt (1A-B). Ein wichtiges Anliegen für diesen Ansatz ist die Qualität und die Spezifität der isolierten RNA. Die optimierte Protokoll hier berichteten aktiviert systematische Verwertung von hochwertigen RNA mit Bioanalyzer-Analyse beurteilt. Die erhaltenen Profil zeigt keinen Abbau von RNA (Abbildung 1c). In anderen Studien in der Trap-Verfahren entwickelt wurden Fragen über die Spezifität der Daten erhöht. Here we imü ssen die Methode zum Hintergrund nicht-spezifischer Bindung der RNA an die Kügelchen oder die Rohre und durch die Optimierung des Waschpuffers verbunden drücken. Um die Hintergrundebene und Effizienz der Isolierung slouch-exprimierenden Zellen zu bewerten, führten wir RT-qPCR-Studien auf 3 Wiederholungen des gleichen embryonalen Stadium. Fold-Anreicherungen von 4 verschiedenen Genen (MEF2, slouch, Prospero, soxNeuro) wurden im Vergleich zum Ein- und normalisiert gegen die RpL32 Gen (1D) berechnet. Diese Ergebnisse zeigten, 2,3-fache Anreicherung der pan-Muskelgens MEF2 und 5,6-fache Anreicherung der slouch Gens. Dagegen sind die beiden Gene in das Nervensystem exprimiert wurden, verglichen mit abgereichertem Eingang. Sehr ähnlich fache Änderung Werte wurden auf 3 biologischen Replikaten beobachtet, was zeigt, dass das Protokoll ist robust. Mit Slouch-Gal4-Treiber und ausgehend von 1,5 g, rund 1,5x10 ^ 6 Embryonen wurden gewonnen, die 100 GFP Zellen / Embryos (insgesamt 150 x 10 ^ 6 positive enthaltenZellen). Nach dem Ausführen des TRAP Experiment ist die Ausbeute in der Umgebung von 25 bis 45 ng spezifische RNA je auf der Bühne von Interesse. Dieses Material ist genug, um Microarray-Analyse oder RNA-seq Verwendung eines Amplifikationsprotokoll um ein RNA-seq-Bibliothek zu erstellen ausführen. Effizienz wird stark von der Stärke der verwendet wird, um RpL10A-EGFP exprimieren Treiber abhängen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Abbildung 1. Qualität und Spezifität Beurteilung der TRAP-isolierte RNA aus Slouch-GAL4&gt; UASRpL10A-EGFP Embryonen. (AB) Konfokale Bilder von einem Stadium 16-Embryo, welches RpL10A-EGFP-Expression spezifisch in den sechs Slouch Muskelzellen pro hemisegment (A). Co-Lokalisation von RpL10A-EGFP mit dem allgemeinen Muskelmarkierung Beta3tubulin auf Merge-Bild (B) beobachtet. (C) Qualitätskontrolle von RNA Traped ran auf Bioanalyzer zeigt perfekte Integrität rRNA 18S und 28S. (D) RT-qPCR-Analyse, die hohe Spezifität der TRAP-isolierte mRNA Experimente an biologischen 3 Wiederholungen der Stufe-16-Embryonen. Falten Änderung im Vergleich zum Ein- und normalisiert gegen die RpL32 Gens berechnet. In allen Muskelabstammungslinien vorhanden MEF2 Transkripte sind 2,3-fach angereicherte im Vergleich zum Eingang der Erwägung, dass mehr eingeschränkt slouch Transkripte sind 5,6-fach angereicherte. Nervenzellen prospero ausdrücken und soxN Gene sind erschöpft 2,2-fach und 5,5-fach auf. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) ist in der Lage, die zelltypspezifische Translation von mRNA zu erfassen. Hier berichten wir über das erste TRAP-Protokoll, das sich der Isolierung von mRNA in seltenen Zellpopulationen von Drosophila-Embryonen widmet.

TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, in Drosophila-Embryonen RNA, die in der Translation eingebunden ist, zelltypspezifisch zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen aus einer transgenen Fliegenlinie gesammelt werden, die eine gezielte Expression einer mit GFP markierten Ribosomenuntereinheit im gewünschten Zelltyp – in diesem Fall den Slouch-Muskulaturzellen – ermöglicht. Der zweite Schritt besteht darin, ein Lysat herzustellen, um eine Polysomenpräparation zu erhalten, die eine Mischung aus markierten und unmarkierten Ribosomen enthält.Anschließend wird die Proteinkonzentration im Lysat geschätzt und eine Affinitätsreinigung mit an GFP-Antikörper gekoppelten Kügelchen durchgeführt, um Ribosomen-RNA-Komplexe aus dem gewünschten Zelltyp anzureichern. Der letzte Schritt dient der Triol-RNA-Extraktion und -Reinigung. Abschließend erfolgen Qualitäts- und Spezifitätsanalysen mittels Bioanalyzer bzw. R-T-Q-P-C-R.Die RNA kann anschließend für eine globale quantitative Analyse mittels RNA-Sequenzierung oder Mikroarrays verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden, wie der VX-Sortierung, besteht darin, dass kein Laborarbeitsschritt der Zell-Dissociation erforderlich ist. Sie kann am Arbeitsplatz durchgeführt werden.Es ist schnell und ermöglicht die direkte Identifizierung übersetzter RNA in einer sehr kleinen Zellpopulation, was einen messbaren Vorteil für das Verständnis der Erwerbung von Zelleigenschaften darstellt. Auch wenn diese Methode Einblicke in die Myogenese im Josephine-Embryo liefern kann, ist sie ebenso auf anderes Gewebe oder moderne Organismen wie Pflanzen, Zebrabärte, Fische oder Mäuse anwendbar und könnte zudem helfen, die Auswirkungen einer Behandlung auf die Proteinsynthese im Fall einer Pathologie zu verfolgen. Den Ablauf demonstriert Benjamin Berta, ein Doktorand aus meinem Labor. Nach der Erstellung beider transgener Linien gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls und deren Kreuzung zur Erzeugung der doppelt transgenen Trap-Linie, vermehren Sie die Linie, indem Sie zunächst acht große zylindrische Populationskäfige vorbereiten, die jeweils etwa 40 Gramm junge Fliegen enthalten, was etwa 180.000 Fliegen pro Käfig entspricht.Bereiten Sie Petrischalen mit einem Durchmesser von 11 Zentimetern vor, die eine Mischung aus festem Agar und Traubensaft enthalten, wobei ein Drittel der Oberfläche mit frisch hergestellter Hefepaste bedeckt ist, und lassen Sie die Fliegen eine Stunde lang Eier auf diesen Platten ablegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit zwei weiteren Sätzen frischer Traubensaftplatten, um den Fliegen die vollständige Entleerung ihrer Uteri zu ermöglichen. Die gewünschten doppelt transgenen Embryonen aus dem Kreuzungsansatz werden auf der vierten Platte abgelegt.Entfernen Sie die Platten mit den gewünschten Embryonen aus den Käfigen und lassen Sie sie bis zum gewünschten Entwicklungsstadium bei Raumtemperatur inkubieren. Hier wird eine Inkubation von 13 Stunden verwendet. Anschließend resuspendieren Sie den Platteninhalt mit etwa 50 Milliliter Wasser unter Verwendung eines Pinsels.Trennen Sie die Embryonen von den toten Fliegen, indem Sie die Flüssigkeit durch drei Siebe mit Durchmessern von 700, 355 und 112 Mikrometern leiten. Spülen Sie die gesammelten Embryonen im Sieb mit dem kleinsten Durchmesser mit ionisiertem Wasser ab. Behandeln Sie die Embryonen zwei Minuten lang mit 4,5 %iger Bleiche in ionisiertem Wasser und spülen Sie sie anschließend gründlich 30 bis 60 Sekunden lang mit ionisiertem Wasser ab.Die Embryonen in PBS mit 0,01 % T zwischen 20 und 100 Mikrogramm pro Milliliter inkubieren. Cyclo heide fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln. Nach dem Trocknen der Embryonen auf Zellulose-Absorptionsblättern in Mikrozentrifugenröhrchen überführen, dann die Röhrchen wiegen und die Embryonen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff schnell einfrieren.In diesem Stadium können die getrockneten Embryonen mehrere Monate lang bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Überführen Sie 1,5 Gramm der getrockneten Embryonen in vorab gekühlte 15-Milliliter-Röhrchen, die vier Milliliter Polysomen-Extraktionspuffer enthalten, und homogenisieren Sie mit einer sterilen 10-Milliliter-Serologischen Pipette.Verteilen Sie anschließend die homogenisierten Embryonen auf zwei vorgekühlte 2-ml-Röhrchen und zerkleinern die Embryonen in einem schnellen, mehrrichtungs-Bead-Grinder. Stellen Sie den Apparat zweimal für jeweils 10 Sekunden bei 5.000 U/min ein, mit einer 15-sekündigen Pause zwischen den Zyklen. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 2000 ×g überführen Sie das Lysat in ein frisches, vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.Geben Sie 10 % Nonidet P-40 zum S-Supernatant, um eine Endkonzentration von 0,1 % zu erreichen, und mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Umstülpen des Reaktionsgefäßes. Fügen Sie 300 µM DHPC hinzu, um eine Endkonzentration von 30 mM zu erreichen, und mischen Sie erneut vorsichtig durch Umstülpen des Reaktionsgefäßes. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten auf Eis, wobei Sie die Probe während der Inkubation mehrmals durch Umstülpen mischen.Nach der Inkubation auf Eis bereiten Sie das postmitochondriale Überstand durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 20.000 × g vor. Nachdem Sie die Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode gemessen und eine Proteinkonzentration zwischen 60 und 80 Milligramm pro Milliliter erhalten haben, überführen Sie das SNAT in ein frisches, vorab gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen und fahren Sie unverzüglich mit dem Präabsorptionsschritt fort. Resuspendieren Sie die magnetischen Perlen durch vorsichtige Agitation und übertragen Sie anschließend 30 Mikroliter Perlen für jedes Milliliter Lysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen.Sammeln Sie die Kügelchen am Magneten, pipettieren Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie die Kügelchen in 500 Mikroliter Polysom-Extraktionspuffer. Sammeln Sie anschließend die Kügelchen erneut am Magneten. Geben Sie dann embryonales Lysat hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei vier Grad Celsius auf einem Rotator. Entfernen Sie die Kügelchen und stellen Sie das Überstandsmittel auf Eis, bis der Immuno-Reinigungsschritt erfolgt. Heben Sie 100 Mikroliter des Überstandes als globale RNA-Probe zur Gegenüberstellung mit der Probe auf, die nach der Immuno-Reinigung gesammelt wird. Um die Probe zu immunreinigen, geben Sie ein Milliliter präabsorbiertes Lysat in ein RNA-freies Gefäß, das 90 Mikroliter blockierte Kügelchen enthält, die mit GFP-Antikörper gekoppelt sind. Inkubieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius zwei Stunden lang oder über Nacht mit sanfter End-zu-End-Rotation in einem Röhrenrotator. Anschließend an die Inkubation.Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie zuerst die verbleibenden Kügelchen in einer Minizentrifuge abzentrifugieren. Anschließend sammeln Sie die Kügelchen auf einem Magneten, resuspendieren sie in 500 µL Waschpuffer und inkubieren unter leichtem Rühren 10 Minuten im Kühlschrank. Danach sammeln Sie die Kügelchen erneut auf dem Magneten.Überführen Sie die Kügelchen in ein frisches, vor RNA-freien RNS geschütztes Gefäß und waschen Sie sie zwei weitere Male. Schließlich, nachdem die Kügelchen am Magneten gesammelt wurden, fahren Sie mit der RNA-Extraktion fort, indem Sie ein Milliliter TRIOL zu den Kügelchen hinzufügen und die Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durchführen. Anschließend reinigen Sie die RNA unter Verwendung eines RNEZ-Mikro-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.Um die Spezifität der gefangenen RNA zu testen, führen Sie die Reverse Transkription an drei Nanogramm immunpräzipitierter und Input-RNA gemäß Standardverfahren durch. Verwenden Sie anschließend die erhaltene cDNA für eine qPCR mit genspezifischen Primer-Sets. Diese konfokale Aufnahme eines Embryos im Stadium 16 zeigt die Expression von RPL 10 A-E-G-F-P spezifisch in den sechs Slouch-Muskulaturzellen in jedem HEMI-Segment; eine Kolokalisation von RPL 10 A-E-G-F-P mit dem allgemeinen Muskelmarker beta three tubulin ist nachweisbar.Das gefangene RNA-Material wurde zu Qualitätskontrollzwecken auf einem Bioanalyzer laufen gelassen. Beachten Sie die vollständige Integrität der 18S- und 28S-Ribosomen-RNAs. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse einer RT-qPCR-Analyse an drei biologischen Wiederholungen von Embryonen im Stadium 16 und belegt die hohe Spezifität der mittels Trap isolierten mRNA.Die Veränderung der FO wurde im Vergleich zum Input berechnet und gegen das RPL32-Gen-Methylierungsniveau normalisiert. Zwei Transkripte, die in allen Muskel-Linien vorkommen, sind 2,3-fach angereichert im Vergleich zum Input, während stärker eingeschränkte Slouch-Transkripte 5,6-fach angereichert sind. Nervenzellen, die Prospero exprimieren, sowie Socks- und Gene sind jeweils 2,2-fach und 5,5-fach verarmt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern, insbesondere im Bereich der Entwicklungsbiologie, den Weg, um die Selbstverpflichtung und den Erwerb zellulärer Eigenschaften während der Differenzierung von Doof-Embryonen zu untersuchen.

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein wesentliches Hindernis für biochemische Analysen von Ribosomen, die im Entstehen begriffenen Peptidyl-tRNAs hat das Vorhandensein von anderen Ribosomen in der gleichen Proben, Ribosomen nicht in der Übersetzung der spezifischen mRNA-Sequenz, die analysiert werden beteiligt. Wir entwickelten eine einfache Methode, um zu reinigen, ausschließlich, den Ribosomen, welche die entstehenden Peptidyl-tRNA von Interesse.

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Ziel dieses Protokolls ist es, einen direkten und kostengünstigen Ansatz für die Sammlung von Drosophila- Embryonen im mittleren Maßstab (0,5-1 g) und die Herstellung von Proteinextrakten, die in nachgeschalteten proteomischen Anwendungen verwendet werden können, wie Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS ).

Mittelmaßnahme Vorbereitung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoextrakte für Proteomversuche

Wir präsentieren einen Ansatz zur Reinigung ribossomengebundener mRNA aus vaskulären Endothelzellen (ECs) direkt im Gehirn, der Lunge und im Herzgewebe der Maus über das EC-spezifische genetische Tag des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (EGFP) in Ribosomen in Kombination mit RNA-Reinigung .

Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) bietet die Möglichkeit, Entwicklungsprogramme mit minimaler Verarbeitung von Organen und Geweben zu sezieren. Das Protokoll liefert hochwertige RNA aus Zellen, die mit einem grünen fluoreszierenden Protein (GFP)-markierten ribosomalen Untereinheit begezielt sind. Nachgeschaltete Analysewerkzeuge wie qRT-PCR oder RNA-seq zeigen Gewebe- und zelltypspezifische Expressionsprofile auf.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

Hier beschreiben wir die Immunpräzipitation von Ribosomen und zugehöriger RNA aus ausgewählten Populationen erwachsener männlicher Mauskeimzellen mit dem RiboTag-System. Strategische Züchtung und sorgfältige Immunpräzipitation führen zu sauberen, reproduzierbaren Ergebnissen, die über das Keimzelltranslatom informieren und Einblicke in die Mechanismen mutierter Phänotypen geben.

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

Co-translationale Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei Modifikationen, Targeting-, Faltungs- und Montagepfaden der entstehenden Kette. Hier beschreiben wir Selective Ribosome Profiling, eine Methode zur in vivo, direkten Analyse dieser Wechselwirkungen im Modell Eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Globale Identifizierung von co-translationalen Interaktionsnetzwerken durch selektives Ribosomenprofiling

Dieses Protokoll zielt darauf ab, zelltypspezifisch translatierende ribosomale mRNAs mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren.

Zelltypspezifische RNAs aus eingefrorenen heterogenen Gewebeproben ohne Zellsortierung isolieren

Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde in diesem Protokoll eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen Drosophila TRP-Kanal zu reinigen.

Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen

Die AviTag-spezifische standortbeschränkte Beleuchtungsverstärkte Biotinylierung (ALIBi) ist eine neuartige optogenetetisch aktivierte Methode, die zur Markierung und Affinitätsreinigung subzellulärer Populationen von Ribosomen für die nachgelagerte Sequenzierung und proteomische Analyse entwickelt wurde.

Isolierung subzellulärer Ribosom-Subpopulationen basierend auf rekombinanten, peptid-tag-spezifischer, ortsbeschränkter Beleuchtungsverstärkter Biotinylierung

Das Protokoll beschreibt die SNP-FISH-Methode (Single Nucleotide Polymorphisms) zur Unterscheidung ribosomaler RNA-Transkripte, die vom ribosomalen DNA-Locus des X- oder Y-Chromosoms in Drosophila melanogaster abgeleitet sind.

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

Hier geben wir Details zur Herstellung von Lysaten und zur Durchführung von In-vitro-Übersetzungen mit Drosophila-Embryonen .

Zellfreie in-vitro mRNA-Translation in Drosophila-Lysaten

Erfahren Sie die TRAP-Methode zur Isolierung von mRNA aus seltenen Zellpopulationen in Drosophila-Embryonen. Dieses Protokoll ermöglicht zellspezifische Translationsanalysen ohne Zellauflösung.

TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen

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