Um método simples para o tamanho Síntese controlada de estáveis ​​Oligoméricas Clusters de nanopartículas em condições ambientais

O objetivo geral deste procedimento é produzir aglomerados oligoméricos de nanopartículas de ouro, que são: altamente estáveis, facilmente funcionalizáveis e possuem diâmetros bem controlados, por meio da redução do ácido cloroaurico com tiocianato de sódio. As partículas que examinamos hoje são partículas interessantes porque seus tamanhos são tão bem controlados, e como consequência disso, podem ser usadas para investigar a permeabilidade de membranas a partículas de diferentes tamanhos. Como são muito estáveis em soluções biológicas, essa é uma propriedade muito importante dessas partículas.

A principal vantagem deste método é que ele permite a síntese bem controlada de oligoclusters de ouro de alta qualidade em condições de bancada, podendo ser facilmente realizada com equipamentos de laboratório padrão e um número limitado de reagentes. Após preparar todas as soluções necessárias conforme indicado no protocolo textual, inicie a síntese com tempo de atraso dos oligoclusters de ouro adicionando 7 mililitros da solução de borax a um frasco de vidro limpo de 125 mililitros contendo 59,5 mililitros de água sob agitação. Em seguida, adicione 2,8 mililitros da solução de cloreto de ouro ao frasco, o que inicia o tempo de atraso que determina o tamanho dos oligoclusters.

Adicione 700 microlitros da solução de tiocianato de sódio ao frasco ao final do período de espera. Continue agitando durante a noite para completar a síntese dos oligoclusters. Ao realizar este procedimento, é importante adicionar rapidamente cloreto de ouro e solução de tiocianato de sódio a todos os reagentes em volumes maiores desta solução, utilizando dispensadores de boca larga.

Para o crescimento aditivo, combine 10 mililitros dos oligoclusters de ouro com 60 mililitros da solução de cloreto de ouro hidroxilado. Em seguida, adicione 900 microlitros da solução de tiocianato de sódio com agitação vigorosa. Deixe a mistura sob agitação durante a noite, até que a reação esteja completa.

Antes da derivatização, adicione 70 mililitros dos oligoclusters brutos a um filtro centrífugo com corte de 30 kilodaltons e gire por 15 minutos a 3.000 × g. Recupere a fita de ree-tin invertendo o filtro e centrifugando por 3 minutos a 500 × g. Em seguida, meça o volume recuperado com uma micropipeta.

Em seguida, adicione um volume de GSH equivalente a um nono do volume recuperado dos oligoclusters. Deixe a reação em repouso à temperatura ambiente por não mais de 10 minutos. Dilua os oligoclusters derivatizados em 50 mililitros de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco para interromper a reação.

Em seguida, aplique os oligoclusters derivatizados a um filtro centrífugo com corte de 30 kilodaltons e centrifugue por 15 minutos a 3.000 × g. Por fim, recupere a fita de ree-tin invertendo o filtro e centrifugando por três minutos a 500 × g. Armazene os oligoclusters derivatizados com glutationa a quatro graus Celsius.

Para analisar os oligoclusters brutos por eletroforese em gel, misture-os na proporção de dois para um com tampão de carga. Em seguida, carregue 30 microlitros dos oligoclusters em um gel de gradiente de poliacrilamida pré-moldado. Execute o gel com tampão tris-glicina por 26 minutos a 200 volts.

Para eletroforese em gel de oligoclusters derivatizados, primeiro dilua-os na proporção de um para três com água. Em seguida, dilua ainda mais os clusters na proporção de dois para um com tampão de carregamento. Carregue 10 microlitros da mistura de oligoclusters em um gel de gradiente de poliacrilamida pré-fabricado e, em seguida, execute o gel com tampão tris-glicina por 26 minutos a 200 volts.

Para analisar por microscopia eletrônica de transmissão, lave 20 microlitros de oligoclusters concentrados com 0,5 mililitros de água e carregue-os em um filtro centrífugo com corte de 0,5 mililitro e 30 quilodaltons. Centrifugue a 14.000 × g durante 10 minutos. Em seguida, remova o filtrado do tubo e ressuspenda o retentato em 0,5 mililitros de água.

Repita a lavagem mais duas vezes e, em seguida, dilua os oligoclusters 500 vezes com água. Após descarregar por brilho o seu porta-objetos recoberto com carbono, deposite 0,6 microlitros dos oligoclusters sobre o porta-objetos e deixe secar ao ar por 10 minutos. Por fim, visualize os oligoclusters utilizando uma ampliação de 100.000 vezes a 80 quilovolts no microscópio eletrônico de transmissão.

O tamanho dos oligoclusters de ouro, sintetizados utilizando os procedimentos de tempo de atraso e acréscimo, foi analisado por eletroforese em gel. As pistas de dois a quatro do gel mostraram que o tamanho do cluster aumenta à medida que o tempo de atraso se torna mais longo. As pistas de cinco a oito confirmam que o tamanho dos clusters também aumenta com a quantidade de ouro hidroxilado utilizada durante o procedimento de acréscimo.

A microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para determinar os diâmetros das partículas de oligoclusters. Os diâmetros foram calculados a partir de medições realizadas em imagens de áreas em grade de 50 nanômetros por 50 nanômetros contendo as partículas. A relação entre o tempo de atraso proporcional ao tamanho das partículas e as quantidades acrescentadas de ouro hidroxilado foi representada graficamente.

Esses dados foram então convertidos em equações preditivas para os diâmetros das partículas de cada procedimento. O método de preparação dos aglomerados de ouro, tenho certeza de que você já discutiu, depende da hidroxilação do cloreto de ouro em solução alcalina. Assim, quanto maior a hidroxilação, menor a probabilidade de gerar um aglomerado de ouro.

Meu novo livro aqui é o primeiro que me interessa, porque é a primeira vez que percebo que o elemento temporal de exposição à alcalinidade pode ser usado para controlar o tamanho dos aglomerados. Quando realizado corretamente, aglomerados de ouro com tamanhos entre três e 70 nanômetros podem ser sintetizados em menos de um dia. As nanopartículas resultantes são estáveis em tampões fisiológicos e no plasma, tornando-as adequadas para experimentos in vitro.

Os oligoclusters de ouro descritos aqui apresentam o benefício adicional de poderem ser concentrados sem necessidade de prévia derivatização, permitindo assim que os agentes de radiciação sejam utilizados em volumes menores.