Ein neuer Ansatz, die Handhabung für ein Studium Aggression Eliminiert und die "Loser" Effect in
30. Dezember 2015
Während Fruchtfliege Kämpfe, die Verhaltensmuster beobachtet, kämpfen Dynamik, und die damit verbundenen Lern- und Gedächtnis werden von experimentellen Bedingungen beeinflusst. Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt ein neues Verfahren, das vollständig eliminiert Handhabung von Fliegen während der Experimente. Dies verbessert Kampf Dynamik und ermöglicht die Bildung von starken "Verlierer" Effekte.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die Entstehung von Verlierer- und Gewinnereffekten bei Drosophila melanogaster einzuführen, indem der Umgang mit den Fliegen im Verhaltensprotokoll eliminiert wird. Die meisten tierverhaltenswissenschaftlichen Studien, die unter Laborbedingungen durchgeführt werden, beinhalten den Umgang mit den Tieren. Dieser Umgang verursacht in der Regel Stress bei den Tieren, und Stress kann die durchzuführenden Verhaltensstudien beeinträchtigen. Daher soll der belastende Umgang mit den Tieren vermieden werden.
Wir haben eine neue Kammer für unsere Aggressionsstudien an Fruchtfliegen entwickelt, die den Umgang mit den Tieren vor, während oder nach den Experimenten vollständig eliminiert. Mithilfe dieser neuen Kammern haben sich alle gemessenen Verhaltensparameter als verbessert erwiesen. Mit dieser Methode minimieren wir die Variabilität des Verhaltens zwischen Individuen.
Wir verkürzen die Zeit, die notwendig ist, um klare Dominanzverhältnisse zu erzeugen, und konnten starke Verlierer- und Gewinner-Mentalitäten hervorrufen. Diese Kammern sind einfach zu bedienen und können vielseitig zur Untersuchung unterschiedlichen Fruchtfliegenverhaltens eingesetzt werden. Um das Experiment zu beginnen, ziehen und pflegen Sie die Fliegenstämme in einem Inkubator mit einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 Grad Celsius und 50 % relativer Luftfeuchtigkeit.
Bereiten Sie als Nächstes Isolationsgefäße vor, indem Sie frisches Fliegenfutter erhitzen, bis es geschmolzen ist. Übertragen Sie mit einer Pasteurpipette etwa 1,5 Milliliter geschmolzenes Fliegenfutter in einzelne leere Glasreagenzgläser und lassen Sie das Futter mit einem feinen Pinsel erstarren. Entnehmen Sie vorsichtig ein männliches Puppe im späten Entwicklungsstadium aus dem Stammprobegefäß und platzieren Sie es an der Seite eines Reagenzglases, das frisch zubereitetes Futter enthält.
Schließen Sie die Isolationsgefäße mit Watte ab und stellen Sie die Isolationsgefäße in den Inkubator. Nach der Isolation sind die Fliegen bereit zum Bemalen. Betäuben Sie die Fliege mit Kohlendioxid und anschließend mit einem feinen Zahnstocher.
Bringen Sie einen kleinen Punkt Acrylfarbe auf dem Thorax an und vermeiden Sie es, den Kopf, die Flügel, den Hinterleib oder die Beine zu bemalen. Lassen Sie die Farbe etwa 10 Sekunden trocknen und überführen Sie die Fliegen vorsichtig in ihre ursprünglichen Isolationsgefäße zurück. Stellen Sie die Isolationsgefäße zurück in den Inkubator.
Fahren Sie mit der Vorbereitung der Apparatur fort, indem Sie frisches Fliegenfutter erhitzen, bis es geschmolzen ist. Verwenden Sie eine hintere Pipette, um 0,8 Milliliter Nahrung in den Deckel des Schraubglasröhrchens zu überführen, und lassen Sie die Nahrung abkühlen. Sobald die Nahrung abgekühlt ist.
Tragen Sie einen kleinen Tropfen frische Hefe-Paste in die Mitte der Oberfläche des Futterbehälters auf. Spülen Sie die Apparatur und die einzelnen Kampfkammern vor jedem Gebrauch mit Wasser und trocknen Sie sie mit einem Papiertuch ab. Anschließend geben Sie einen Tropfen Knetmasse auf den Futterbehälter und platzieren Sie ihn in die Mitte jeder Kampfkammer.
Bedecken Sie die Kampfkammern mit dem Apparatedeckel. Stellen Sie den abgedeckten Apparat unter eine Lichtquelle und installieren Sie eine Videokamera über der Struktur. Beginnen Sie die Verhaltensversuche, indem Sie Kunststofftrennwände in jede Kampfkammer einführen.
Entfernen Sie den Wattepfropfen aus dem Isolationsröhrchen und positionieren Sie das Röhrchen unter einer offenen Öffnung an der Seite der Apparatur. Lassen Sie die Fliege durch negativen Geotaxis in die Kampfkammer eintreten. Schließen Sie danach die Schiebewand, nachdem die Fliege die Kammer betreten hat, und wiederholen Sie den Vorgang, um die zweite Fliege auf der anderen Seite der Apparatur in die Kampfkammer einzuführen.
Als Nächstes bringen Sie die Apparatur wieder in die beleuchtete Videoaufnahmeposition. Beginnen Sie mit der Videoaufnahme und entfernen Sie die Kunststofftrennwand, damit die Fliegen für die Verlierereffekt-Experimente interagieren können. Zeichnen Sie die ersten Kämpfe 20 Minuten lang auf, um sicherzustellen, dass sich starke Dominanzbeziehungen ausbilden.
Nach 20 Minuten vorsichtig den Kunststofftrenner wieder in die Kampfkammern einsetzen, um die Fliegen zu trennen und die Videoaufnahme zu beenden. Um eine starke Verlierer-Mentalität hervorzurufen, sicherstellen, dass die Fliegen während des ersten Kampfes eine Dominanzbeziehung aufbauen und aufrechterhalten, und die Tiere beim Einsetzen der Trennwände so wenig wie möglich stören. Nach einer Ruhephase von 10 Minuten die Aufnahme starten und den Kunststofftrenner vorsichtig entfernen.
Lassen Sie die Fliegen weitere 20 Minuten interagieren. Beenden Sie die Aufnahme nach 20 Minuten, um das Experiment abzuschließen. Entfernen Sie die Fliegen aus den Verhaltenskammern durch negativen geotaktischen Achswechsel, indem Sie die zuvor beschriebene Prozedur umkehren, bevor die neue Methode verwendet wurde, um erstmals Kämpfe zu beobachten.
Im Durchschnitt wird die erste Begegnung nach zwei Minuten beobachtet. Der erste Sturzflug erfolgt nach vier Minuten, und die Fliegen etablieren eine Dominanzbeziehung nach acht Minuten. Während der verbleibenden 12 Minuten wird die Dominanzbeziehung verstärkt.
Während Gewinner immer stärker nach vorne drängen und Verlierer sich zunehmend zurückziehen, wurde der neue Ansatz verwendet, um den Verlierereffekt zu quantifizieren – den Prozentsatz der Verlierer, die auch ihre zweiten Kämpfe verlieren. Ein signifikanter Effekt zeigt sich, wenn frühere Verlierer bei ihren zweiten Kämpfen entweder mit bekannten Gewinnern oder mit unbekannten Gewinnern gepaart wurden.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Aggressionsassay mit sechs bis sieben Tage alten männlichen Fliegen durchzuführen, die in sozialer Isolation aufgezogen wurden. Sobald man mit diesen Kammern vertraut ist, ermöglichen sie eine einfache Einführung, Beobachtung, Interaktion und Trennung der Fliegen, und zwar vollständig ohne manuelles Handling, wodurch ein starker Verlierereffekt induziert wird. Die Verwendung von Trennwänden zur Isolierung der Fliegen nach dem ersten Kampf erlaubt Variationen im experimentellen Protokoll.
Wir können die Gewinner behalten und sie im zweiten Kampf mit unterschiedlichen Gegnern paaren, um einen Gewinnereffekt hervorzurufen. Mit geringen Anpassungen können dieselben Kammern verwendet werden, um das Balzverhalten, die Lokomotion und andere soziale Verhaltensweisen der Fruchtfliege zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Aggressionsassays durchführt und wie man den Verlierereffekt induziert, ohne die Fliegen vor oder während der Experimente zu manipulieren.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine neuartige Methode zur Untersuchung von Aggression bei Fruchtfliegen vor, bei der der Umgang mit den Tieren entfällt, was den Stress reduziert und das Verhalten verbessert. Die neue Kammerkonstruktion erhöht die Zuverlässigkeit bei der Messung von Gewinner- und Verlierereffekten in Drosophila melanogaster.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensbiologie
- Tierverhalten
Hintergrund
- Die Handhabung von Tieren kann Stress verursachen, der Verhaltensstudien beeinflusst.
- Herkömmliche Methoden beinhalten häufig die Handhabung, was zu variablen Ergebnissen führt.
- Das Verständnis von Aggression bei Drosophila kann Einblicke in die Verhaltensdynamik liefern.
- Das Verzichten auf die Handhabung kann zu genaueren Verhaltensbeurteilungen führen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Minimierung von Stress bei Taufliegen während Aggressionsstudien.
- Untersuchung der Auswirkungen von Handhabung auf das Verhalten.
- Verbesserung der Zuverlässigkeit bei der Messung aggressionsbezogener Verhaltensweisen.
Verwendete Methoden
- Entwicklung einer neuen Kammer für Aggressionsstudien.
- Vermeidung von Handhabung vor, während und nach Experimenten.
- Bestimmung verschiedener verhaltensbezogener Parameter bei Drosophila.
- Vergleich der Ergebnisse mit herkömmlichen Handhabungsmethoden.
Hauptergebnisse
- Die Verhaltensparameter zeigten eine Verbesserung mit der neuen Methode.
- Die geringere Variabilität zwischen Individuen wurde beobachtet.
- Stärkere Verlierereffekte wurden bei fehlender Handhabung festgestellt.
- Die allgemeinen Kampfdynamiken wurden verbessert.
Schlussfolgerungen
- Das neue Kammerdesign reduziert effektiv den Stress bei Fruchtfliegen.
- Die Eliminierung von manuellem Umgang führt zu zuverlässigeren Verhaltensdaten.
- Diese Methode kann auf weitere Studien im Bereich des Tierverhaltens angewandt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode begegnet einer zentralen Herausforderung der Verhaltensneurowissenschaften: der Minimierung experimenteller Störfaktoren, die durch das Handling von Tieren verursacht werden. Durch den Verzicht auf manuelle Eingriffe verbessert der Ansatz die Datenzuverlässigkeit bei der Untersuchung erfahrungsabhängiger Verhaltensänderungen wie Verlierer- und Gewinnereffekten. Dies trägt zu einer genaueren Zielvalidierung in neuroverhaltensbezogenen Entdeckungsverfahren bei, bei denen Verhaltensauslesungen mechanistische Hypothesen leiten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung genetischer und umweltbedingter Einflüsse auf aggressionsrelevante Signalwege, ohne störende Einflüsse durch Handhabungsstress.
- Operativer Wert: Verringert die Verhaltensvariabilität zwischen Individuen und verbessert so die Empfindlichkeit von Assays zur Detektion subtiler phänotypischer Veränderungen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Risikominimierung bei Zielstrukturen, die an Lernen, Gedächtnis und sozialem Verhalten beteiligt sind, indem klarere Verhaltensauslesungen bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine standardisierte, reproduzierbare Plattform zur Quantifizierung von Aggressionsdynamiken und der Entstehung sozialer Hierarchien.
- Operationaler Wert: Ermöglicht hochdurchsatzfähige Arbeitsabläufe durch automatisierten Flugeintritt mittels Geotaxis und Kammertrennung mithilfe von Schiebern.
- Eignung für Assays: Erzeugt quantitative Ausgaben wie Kampf-Latenz, Häufigkeit von Vorstößen und Zeitverlauf dominanter Beziehungen für Anwendungen im Wirkstoffscreening.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Relevanz: Ermöglicht die Untersuchung erfahrungsbezogener Verhaltensänderungen, die Aspekte psychiatrischer Störungen modellieren, die mit sozialem Defeat und Stressreaktivität verknüpft sind.
- Mechanistische Entlastung: Ermöglicht die Isolierung spezifischer neuronaler Schaltkreise oder molekularer Signalwege, die zur Ausbildung des Verlierereffekts beitragen, ohne durch Handhabung verursachte Störgrößen.
- Präklinische Kontinuität: Unterstützt die longitudinale Verhaltensbeobachtung über mehrere Kampfrunden hinweg, um adaptive oder maladaptive Verhaltensplastizität zu bewerten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in frühe Entdeckungsworkflows, bei denen Verhaltensphänotypen verwendet werden, um Zielstrukturen zu validieren, die die Funktion neuronaler Schaltkreise und die Verhaltensregulation beeinflussen. Sie ermöglicht eine konsistente Phänotypanalyse vor dem Übergang zu mechanistischen oder therapeutischen Interventionsstudien.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung hinsichtlich Gene oder Wirkstoffe, die Aggression, soziales Gedächtnis und Stressreaktionswege beeinflussen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Verhaltensmetriken, die zum Vergleich genetischer oder pharmakologischer Bedingungen unerlässlich sind.
- Analytik: Ermöglicht die Messung zeitlicher Verhaltensparameter (z. B. Beginn des Kampfes, Häufigkeit von Vorstößen, Etablierung von Dominanz), um Dosis-Wirkungs- oder Genotyp-Phänotyp-Korrelationen abzuleiten.
- Translationale Forschung: Schließt an präklinische Modelle an, indem ethologisch relevante soziale Verhaltensweisen erfasst werden, die konservierte Mechanismen von Stress und Lernen widerspiegeln.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Kammerdesign lässt sich an andere soziale Verhaltensweisen von Drosophila anpassen und erhöht so die Nützlichkeit über mehrere Entdeckungsprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei Verhaltensassays, indem der Einfluss von Handhabung als störender Faktor eliminiert wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte, handhabungsfreie Arbeitsabläufe.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung bei der Zielvalidierung, indem falsch-positive Ergebnisse durch stressbedingte Verhaltensstörungen reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine genauere Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf verlässlichen verhaltensbezogenen Phänotypen in krankheitsrelevanten Systemen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Haltung von Drosophila, der Verhaltensbeobachtung und der phänotypischen Analyse mittels Videoaufzeichnung.
- Setzt den Zugang zu Verhaltensverfolgungssystemen und Umweltkontrollen (Licht-Dunkel-Zyklen, Temperatur, Luftfeuchtigkeit) voraus.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren hinsichtlich des Aufbaus der Versuchskammern, der Fliegenisolation und der zeitlichen Abfolge der Verhaltensabschnitte.
- Die Anpassung an andere Modellsysteme könnte eine Modifikation der auf Geotaxis basierenden Eintragsmechanismen erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die begrenzte Kammengröße sowie die Abhängigkeit von der Beweglichkeit der Fliegen, um sich selbst in die Versuchsarenen zu begeben.
