Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die aortale vaskuläre Verkalkung ex vivo sichtbar zu machen und die in vivo vaskuläre Verkalkung mithilfe kultivierter primärer muriner aortaler glatter Muskelzellen zu modellieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biologie vaskulärer Erkrankungen zu beantworten, indem sie ein in-vitro-Modell zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der vaskulären Verkalkung bereitstellt und die Beurteilung der vaskulären Verkalkung sowie der Makrophagenentzündung in vivo ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass eine empfindliche Quantifizierung und eine gleichzeitige Lokalisation der Makrophagenaktivität zusammen mit Kalziumablagerungen in atherosklerotischen Läsionen bereits in frühen Krankheitsstadien möglich ist.

Zusammen mit Caitlin und mir wird Robert Tainsh, ein Techniker in unserem Labor, dieses Verfahren demonstrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, desinfizieren Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer und lokalisieren Sie die seitlich verlaufenden Schwanzvenen. Anschließend üben Sie leichten Vorwärtsdruck auf die Spritze aus, während eine Nadel mit 30 Gauge ohne Widerstand in den Schwanz vorgeschoben wird.

Danach 100 µL Calcium NIR und/oder 100 µL Cathepsin NIR mit konstanter Geschwindigkeit injizieren. Die Nadel nach fünf Sekunden entfernen und die Aorten drei bis 24 Stunden nach der Injektion entnehmen. Unter einem Stereomikroskop das Peritoneum entfernen, um die Bauchorgane freizulegen.

Entfernen Sie anschließend die gastrointestinalen Organe, wobei darauf geachtet werden muss, die Aorta nicht zu durchtrennen. Danach führen Sie einen seitlichen Schnitt im vorderen Zwerchfell durch und verlängern den Schnitt über den Bauchraum. Lösen Sie mithilfe von Dissektions-Scissors den Rippenkorb, indem Sie durch die Seiten der Rippen schneiden und das am oberen Abschnitt des Brustbeins anhaftende Weichgewebe entfernen.

Entfernen Sie dann den Rippenkorb und legen Sie die Lungen frei. Nehmen Sie die Lungen vorsichtig heraus. Entfernen Sie anschließend die Luftröhre und die Speiseröhre, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Aorta intakt bleibt.

Entfernen Sie anschließend das Weichgewebe um die Aorta vom Iliacusbifurkation bis zum Aortenbogen. Seien Sie vorsichtig beim Entfernen des periaortalen Fettgewebes. Danach entfernen Sie das verbleibende Fett- und Weichgewebe um die thorakale Aorta und die großen Seitenäste des Aortenbogens.

Entfernen Sie anschließend den Thymus. Lösen Sie nun vorsichtig das Herz aus der Brusthöhle, indem Sie es von der proximalen Aorta ablösen. Durchtrennen Sie danach die distale Aorta an der Iliacalbifurkation.

Unter Verwendung einer Insulinkanüle normale Kochsalzlösung über den Aortenbogen in die Aorta injizieren, um die verbleibenden Blutzellen auszuwaschen. Die Aorta zusammen mit den Aortenbogengefäßen ablösen und vollständig aus dem Körper entfernen. Die Aorta in normale Kochsalzlösung auf Eis legen, bis sie zur Bildgebung bereit ist.

In diesem Schritt die Aorten in kalte HBSS geben, bis die Präparationen abgeschlossen sind. In einer sterilen Zellkulturhaube die Aorten in die aortische Verdauungslösung in den 35 × 10 Millimeter Zellkulturschalen überführen. Anschließend 30 Minuten bei 37 °C mit sanftem, intermittierendem Schütteln inkubieren.

Nach der Verdauung sollten die Aorten ein gestrecktes oder ausgefranstes Aussehen aufweisen. Unter einem Dissektionsmikroskop entfernen Sie die äußere adventitielle Schicht einer Aorta, wobei die mediale Schicht intakt bleibt. Um dies zu tun, lösen Sie die äußere Schicht der Aorta an einem Ende ab und ziehen sie wie eine Socke von der darunterliegenden medialen Schicht ab.

Nachdem die adventitielle Schicht entfernt wurde, inkubieren Sie die verbleibende Aorta in einer neuen Kulturschale mit Zellkulturmedium bei 37 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden. Anschließend schneiden Sie die Aorta in Ringe mit einer Breite von ein bis zwei Millimetern. Überführen Sie die Ringe in eine neue Gewebekulturschale mit aortaler Verdauungslösung und inkubieren Sie diese bei 37 Grad Celsius unter leichtem intermittierendem Schütteln für 120 Minuten.

Während der Inkubation die Lösung mehrmals auf- und abpipettieren, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Danach fünf Milliliter warmes Zellkulturmedium zur Verdauungslösung hinzufügen und in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Das Gefäß fünf Minuten bei 200 × g zentrifugieren. Anschließend das Medium abpipettieren und die Zellen in dem gewünschten Volumen an Zellkulturmedium erneut suspendieren.

Um die Verkalkung in vaskulären glatten Muskelzellen zu induzieren, überführen Sie die Zellen in eine 6-Loch-Kulturplatte und lassen Sie sie anhaften. Danach versetzen Sie die Zellen in Kalzifizierungsmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mindestens sieben Tage lang.

Anschließend das Medium von der Zellkulturplatte abpipettieren. Die Zellen einmal mit ionisiertem Wasser waschen. Die Zellen fixieren, indem sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur in einem Milliliter 10 % Formalin platziert werden.

Entfernen Sie anschließend die Formalinlösung und waschen Sie die fixierten Zellen fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser. Inkubieren Sie die Zellen danach in einem Milliliter 5%iger Silbernitratlösung unter einer 60 bis 100 Watt starken Glühbirne für eine bis zwei Stunden. Danach saugen Sie die Silbernitratlösung ab und waschen Sie mit destilliertem Wasser für fünf Minuten.

Nach fünf Minuten das nicht umgesetzte Silber entfernen, indem die Zellen für fünf Minuten in ein Milliliter 5%ige Natriumthiosulfatlösung in destilliertem Wasser gegeben werden. Anschließend die Zellen fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser spülen. Die mit von Kossa gefärbten Zellen sind nun bereit für die Bildaufnahme mittels standardmäßiger invertierter Lichtmikroskopie.

In dieser Abbildung wurden Wildtyp-MGP-Knockout-Mäuse und LDLR-Knockout-Mäuse über eine Schwanzveneninjektion mit Calcium NIR und Cathepsin NIR injiziert, und die Aorten wurden 24 Stunden später entnommen und mittels NIR-Fluoreszenzbildgebung untersucht. Wildtyp-Mäuse weisen praktisch keine Aortenverkalkung oder Makrophagenansammlung auf. Die Aorten von LDLR-Knockout-Mäusen zeigen umfangreiche Verkalkungen, die mit der Ansammlung von Makrophagen räumlich übereinstimmen.

Im Gegensatz dazu weisen MGP-Knockout-Mäuse eine aortale Verkalkung auf, die unabhängig von einer Makrophageninfiltration auftritt. In diesem Experiment wurden aus MGP-Knockout-Mäusen isolierte aortale glatte Muskelzellen (VSMCs) mit einem Adenovirus infiziert, das entweder GFP oder MGP exprimierte. Aortale VSMCs, die aus Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, wurden entweder mit einer kontrollierten, zufällig generierten siRNA oder mit einer siRNA, die gegen MGP gerichtet war, transfiziert.

Die Zellen wurden sieben Tage lang in einem Kalzifizierungsmedium A kultiviert und anschließend fixiert und mit von Kossa angefärbt. Die Kalziumfärbung wurde mithilfe der ImageJ-Software nach Subtraktion des Hintergrunds quantifiziert. Nach ihrer Entwicklung haben diese Techniken es Wissenschaftlern ermöglicht, Atherosklerose und vaskuläre Kalzifizierung ex vivo abzubilden.

Und um die vaskuläre Verkalkung in vitro zu modellieren. Dies eröffnet die Möglichkeit, die Wirkungen neuartiger Arzneimitteltherapien auf Gefäßerkrankungen zu testen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Aorten aus primären murinen vaskulären glatten Muskelzellen isoliert, atherosklerotische Plaques mittels Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebungsproben visualisiert und verknöcherte vaskuläre glatte Muskulatur in vitro darstellt.