Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aortengefäßverkalkung ex vivo sichtbar zu machen und die Gefäßverkalkung in vivo mit kultivierten primären murinen glatten Aortenmuskelzellen zu modellieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Biologie von Gefäßerkrankungen zu beantworten, indem sie ein in vitro-Modell zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der Gefäßverkalkung bereitstellt und die Beurteilung der Gefäßverkalkung und der Makrophagenentzündung in vivo ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die empfindliche Quantifizierung und Co-Lokalisierung der Makrophagenaktivität mit Kalziumablagerungen in atherosklerotischen Läsionen bereits in frühen Krankheitsstadien ermöglicht.

Neben Caitlin und mir wird Robert Tainsh, ein Techniker in unserem Labor, dieses Verfahren demonstrieren. Um diesen Vorgang zu beginnen, desinfizieren Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer und lokalisieren Sie die Schwanzvenen seitlich. Üben Sie anschließend einen leichten Vorwärtsdruck auf die Spritze aus, während eine 30-Gauge-Nadel ohne Widerstand in den Schwanz geschoben wird.

Injizieren Sie dann 100 Mikroliter Calcium-NIR und/oder 100 Mikroliter Cathepsin-NIR mit einer gleichmäßigen Rate. Ziehen Sie die Nadel nach fünf Sekunden zurück und entnehmen Sie die Aorten drei bis 24 Stunden nach der Injektion. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop das Bauchfell, um die Bauchorgane freizulegen.

Entfernen Sie anschließend die Magen-Darm-Organe und achten Sie darauf, die Aorta nicht zu durchtrennen. Machen Sie danach einen seitlichen Schnitt im vorderen Zwerchfell und setzen Sie den Schnitt über den Bauch fort. Lösen Sie mit einer Präparierschere den Brustkorb, indem Sie die Seiten der Rippen durchschneiden und das Weichgewebe entfernen, das am oberen Teil des Brustbeins haftet.

Entfernen Sie dann den Brustkorb und legen Sie die Lunge frei. Entfernen Sie vorsichtig die Lunge. Entfernen Sie anschließend die Luftröhre und die Speiseröhre mit Sorgfalt, wobei Sie darauf achten, dass die Aorta intakt bleibt.

Entfernen Sie anschließend das Weichgewebe, das die Aorta umgibt, von der Beckenbifurkation bis zum Aortenbogen. Seien Sie vorsichtig bei der Entfernung des periaortalen Fettgewebes. Entfernen Sie danach das restliche Fett und Weichgewebe, das die thorakale Aorta und große Äste des Aortenbogens umgibt.

Entfernen Sie anschließend den Thymus. Entfernen Sie nun das Herz aus der Brusthöhle, indem Sie es vorsichtig von der proximalen Aorta lösen. Dann wird die distale Aorta an der Beckenbifurkation durchtrennt.

Injizieren Sie mit einer Insulinnadel normale Kochsalzlösung aus dem Aortenbogen in die Aorta, um die restlichen Blutzellen auszuwaschen. Lösen Sie die Aorta zusammen mit den Aortenbogengefäßen und entfernen Sie sie vollständig aus dem Körper. Legen Sie die Aorta in normale Kochsalzlösung auf Eis, bis sie für die Bildgebung bereit ist.

In diesem Schritt legen Sie die Aorten in kaltes HBSS, bis die Dissektionen abgeschlossen sind. Übertragen Sie die Aorten in einer sterilen Gewebekulturhaube in die Aortenaufschlusslösung in den 35 x 10 Millimeter großen Gewebekulturschalen. Inkubieren Sie sie dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem, intermittierendem Schaukeln.

Nach der Verdauung sollten die Aorten ein gedehntes oder ausgefranstes Aussehen aufweisen. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop die äußere Adventivschicht einer Aorta, während die mediale Schicht intakt bleibt. Schäle dazu an einem Ende die äußere Schicht der Aorta ab und entferne sie wie eine Socke von der darunter liegenden medialen Schicht.

Sobald die zufällige Schicht entfernt wurde, inkubieren Sie die verbleibende Aorta in einer neuen Kulturschale mit Zellkulturmedien bei 37 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden. Schneide anschließend die Aorta in ein bis zwei Millimeter breite Ringe. Übertragen Sie die Ringe in eine neue Gewebekulturschale mit Aortenaufschlusslösung und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius unter sanftem intermittierendem Schaukeln für 120 Minuten.

Pipettieren Sie die Lösung während der Inkubation mehrmals auf und ab, um die Zellen wieder zu suspendieren. Geben Sie anschließend fünf Milliliter warmes Zellkulturmedium in die Aufschlusslösung und überführen Sie es in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 200 g. Aspirieren Sie dann das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in das gewünschte Volumen des Zellkulturmediums.

Um eine Verkalkung in den glatten Gefäßmuskelzellen zu induzieren, übertragen Sie die Zellen auf die Sechs-Well-Kulturplatte und lassen Sie sie anhaften. Anschließend werden die Zellen in Verkalkungsmedien wieder eingespeist. Inkubieren Sie die Zellen mindestens sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius.

Anschließend aspirieren Sie das Medium von der Zellkulturplatte. Waschen Sie die Zellen einmal im ionisierten Wasser. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie 20 Minuten lang in einen Milliliter 10%iges Formalin bei Raumtemperatur legen.

Entfernen Sie dann das Formalin und waschen Sie die fixierten Zellen fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen in einem Milliliter 5%iger Silbernitratlösung unter einer 60- bis 100-Watt-Glühbirne für ein bis zwei Stunden. Anschließend die Silbernitratlösung absaugen und fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser waschen.

Entfernen Sie nach fünf Minuten das nicht umgesetzte Silber, indem Sie die Zellen fünf Minuten lang in einen Milliliter 5%ige Natriumthiosulfatlösung in destilliertem Wasser legen. Spülen Sie anschließend die Zellen fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser. Die mit von Kossa gefärbten Zellen sind nun bereit für die Bildgebung mit der üblichen Inverslichtmikroskopie.

In dieser Abbildung wurden Wildtyp-MGP-Knockout-Mäuse und LDLR-Knockout-Mäuse mittels Schwanzveneninjektion mit Calcium-NIR und Cathepsin-NIR injiziert, und Aorten wurden 24 Stunden später entnommen und mit NIR-Fluoreszenzbildgebung bewertet. Wildtyp-Mäuse weisen praktisch keine Aortenverkalkung oder Makrophagenpräsenz auf. Die Aorten von LDLR-Knockout-Mäusen weisen eine ausgedehnte Verkalkung auf, die mit der Akkumulation von Makrophagen kolokalisiert ist.

Im Gegensatz dazu weisen MGP-Knockout-Mäuse eine Aortenverkalkung auf, die ohne Makrophageninfiltration auftritt. In diesem Experiment wurden kultivierte Aorten-VSMCs aus MGP-Knockout-Mäusen isoliert und mit Adenoviren infiziert, die entweder GFP oder MGP exprimieren. Aorten-VSMCs, die aus Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, wurden entweder mit Kontroll-Scrambled-siRNA oder siRNA, die auf MGP abzielt, transfiziert.

Die Zellen wurden sieben Tage lang in Kalzifizierungsmedium A gezüchtet und anschließend mit von Kossa fixiert und gefärbt. Die Calciumfärbung wurde mit der ImageJ-Software nach Hintergrundsubtraktion quantifiziert. Nach ihrer Entwicklung haben diese Techniken es den Wissenschaftlern ermöglicht, Atherosklerose und Gefäßverkalkung ex vivo abzubilden.

Und um die Gefäßverkalkung in vitro zu modellieren. Das eröffnet die Möglichkeit, die Auswirkungen neuartiger medikamentöser Behandlungen auf Gefäßerkrankungen zu testen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Aorten in primären glatten Muskelzellen der Aorta isoliert, atherosklerotische Plaques mit Nahinfrarot-Fluoreszenzsonden und verkalkte glatte Gefäßmuskeln in vitro visualisiert.