Name: Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Kryo-Rasterelektronenmikroskopie von gefriergebrochenem Blattgewebe zur Untersuchung der supramolekularen Organisation photosynthetischer Membranen in ihrem nativen Zellkontext.

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Wir danken Andres Kaech (Universität Zürich) für seine hilfreiche Ratschläge auf Rasterelektronenmikroskopie Bildgebung. Diese Arbeit wurde von den Vereinigten Staaten und Israel Binationale landwirtschaftliche Forschung und Entwicklung Fonds unterstützt (Förder-Nr. US-4334-10, ZR), der Israel Science Foundation (Grant Nr. 1034/12, ZR) und der Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013 ZR). Die Elektronenmikroskopie-Studien wurden an der Irving und Cherna Moskowitz Center for Nano und Bio-Nano-Imaging am Weizmann Institute of Science durchgeführt.

1. Cryo-Fixierung von Blattgewebe durch Hochdruck-Freezing Hinweis: In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Hochdruck Einfrieren von Blattgewebe durchzuführen für eine Gefrierbruch-Experiment. Für Überlegungen zu Pflanzenproben zu sehen im Zusammenhang mit 29. Dies kann für andere Arten von Geweben oder Proben mit einigen Änderungen angepasst werden. <ol><li> Verwendung der Ecke einer Rasierklinge, kratzen die Unterseite des 0,1 mm Hohlraum einer 0,1 / 0,2 mm Aluminiumplättchen (Abbildung 1). Bereiten Sie mindestens ein Dutzend Plättchen (6 Proben). Seien Sie vorsichtig, nicht Messer Markierungen auf dem Umfang der Scheibe zu schaffen. <ol><li> Nach Kratzen, waschen Scheiben in absolutem Ethanol, trocknen lassen und in einer sauberen Schüssel halten. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Hochdruckgefriermaschine nach den Anweisungen des Herstellers. Füllen Sie den Hochdruckgefrier Alkohol Kammer der Maschine mit Isopropanol. </li><li> Bereiten Sie eine hausgemachte vakuumunterstützten infiltration Gerät Gas in das Blattgewebe ein mit Flüssigkeit gefunden zu ersetzen. <ol><li> Fest verbinden, um das Ende einer 10 ml Spritze mit einer 200 &amp; mgr; l-Pipettenspitze. Cut off ~ 1 cm von der Spitze. Machen Sie ein Loch in der Kappe von einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu dicht die Schnitt Spitze passen. Vakuum kann im Inneren des Rohrs erzeugt werden, indem der Kolben der Spritze gezogen wird. </li></ol></li><li> Schneiden Sie ein kleines Stück Blatt von der Pflanze mit einer Rasierklinge und mit einer Pinzette legen Sie das Blatt in einem Mikrozentrifugenröhrchen zur Hälfte gefüllt mit 1-Hexadecen. Infiltrieren Sie die Interzellularräume des Blattes mit der Flüssigkeit durch den Kolben vorsichtig ziehen Vakuum zu erzeugen, halten Sie für etwa 30 Sekunden, und lassen Sie dann den Kolben langsam. </li><li> Entfernen Sie die Blattstück aus dem Rohr mit einer Pinzette. Schneiden Sie das Blatt mit einer Rasierklinge in Fall dicker als 0,2 mm ist und schneiden Sie ein kleines Stück, das in ein Plättchen passen. </li><li> Ein sauberes Plättchen mit der geritzten Seite nach oben in die Halterung des Gefriermaschine und legen Sie dann das abgeschnittene Stück von leaf in den plättchen. Füllen Sie den verbleibenden Platz für das Blatt mit 1-Hexadecen umgibt. Schließen Sie das Sandwich ein weiteres Plättchen mit, mit den Kratzern das Blatt gegenüber. </li><li> Schließen und den Halter festziehen und setzen Sie sie in die Kammer der Maschine. Drücken Sie dann die &#39;Jet&#39; Taste zum Einfrieren (~ 2.100 Bars für 300 bis 500 ms), und schnell den Halter in flüssigem Stickstoff übertragen. Entfernen Sie vorsichtig die gefrorene Sandwich aus der Halterung mit vorgekühlten Pinzette, dabei nicht das Sandwich zu brechen. Hinweis: Geschlossen gefrorene Sandwiches sofort gebrochen Einfrieren sein kann oder in flüssigem Stickstoff für den späteren Gebrauch aufbewahrt. Verwenden Sie Schutzkleidung und Augen wenn Umgang mit flüssigem Stickstoff. </li></ol> 2. Gefrierbruch und Double-Layer - Beschichtung 27,28 <ol><li> Bereiten Sie die Gefrierbruchmaschine zur Verwendung, einschließlich der beiden Pistolen für die Verdampfung von Platin / Kohlenstoff (Pt / C) und Kohlenstoff, nach den Anweisungen des Herstellers. Legen Sie die Pt / C-Pistole bei 45 Grad einnd die Kohlenstoffpistole bei 90 Grad. <ol><li> Vorprogrammieren ein Beschichtungsschema eines 2-nm-Schicht von Pt / C (Beschichtungsgeschwindigkeit von 0,02 bis 0,04 nm / sec) und einer 6-nm-Schicht aus Kohlenstoff (bei ~ 0,1 nm / sec). <ol><li> Geben Sie das Setup auf der Gefrierbruch-Maschine auf den Bildschirm. Wählen Sie eine Benutzernummer, wo das Beschichtungssystem gespeichert werden. </li><li> Wählen Sie Pt / C für &quot;Layer 1&quot;. Wählen Sie einen Zeitrahmen, z. B. 5 min (zu überschreiten , die notwendige Zeit benötigt , um die Beschichtung zu vervollständigen). Verwenden Sie die Auf-Ab-Pfeile, um eine Dicke von 2 nm zu definieren. </li><li> Drücken Sie die &quot;Ebene&quot;, um sich zu bewegen 2. Wiederholen Sie Schritt 2.1.1.2, mit der Ausnahme wählen Kohlenstoff-Schicht und einer Dicke von 6 nm definieren. </li></ol></li><li> Testen und Pistolenbetrieb einzustellen. <ol><li> Wählen Sie &quot;Layer 1&quot;. Wählen Sie die Pt / C-Waffe durch Drücken der &#39;gun1&#39; Taste und drücken Sie die &quot;ON&quot; Taste auf der Verdampfungssteuereinheit der Gefrierbruch-Maschine. Überwachen Sie die Verdampfungsrate und eine Einstellung mit der Spannung und Emissions Knöpfe until Erreichen einer Geschwindigkeit von 0,02-0,04 nm / s. Drücken Sie &quot;OFF&quot;, um den Pt / C-Pistole ab. </li><li> Wählen Sie &quot;Layer 2&quot;. Wiederholen Sie 2.1.2.1, mit der Ausnahme, wählen Sie &#39;GUN2&#39; und stellen Sie für eine Verdampfungsrate von ~ 0,1 nm / s. </li></ol></li></ol></li><li> Kühlen Sie die Gefrierbruchsystem Stufe bis -140 ° C oder -160 ° C (für hydrierte oder dehydriert Blätter, beziehungsweise). Bringen Sie das Vakuum Kryo-Shuttleservice zur Maschine und füllen seine Kammer mit flüssigem Stickstoff. Druck in der Gefrierbruch Kammer gekühlt liegt üblicherweise zwischen 1 bis 8 x 10 -7 mbar. </li><li> Legen Sie eine Gefriert Fracturing Probenhalter (geeignet für 3-mm-Plättchen) in die Ladestation. Flood die Ladestation Kammer mit flüssigem Stickstoff. </li><li> Legen Sie zwei gefrorene Sandwiches auf den Halter eins nach dem anderen hochpräzisen Grad mit einer Pinzette. Ziehen Sie die erste Sandwich in den Halter und dann den Halter umdrehen um zu überprüfen, dass es sicher an seinem Platz sitzt. Wiederholen Sie dies für das zweite Sandwich. </li><li> DEtach die gekühlte Shuttle von der Maschine Gefrierbruch und schließen Sie es an die Ladestation. Öffnen Sie das Wechselventil, einzuführen, um die zurückziehenden Arm in die Halterung und einrasten. Wieder einführen, den Arm mit dem Halter in das Shuttle und schließen Sie das Wechselventil die Ladestation Knopf. Bringen Sie den Shuttle-Bus zum Gefrierbruch-Maschine und stellen Sie den Halter in die Kammer mit dem eingezogenen Arm. Nehmen Sie den Shuttle-Bus von der Maschine. </li><li> Richten Sie den Gefrierbruch Mikrotommessers zu einer Höhe, dass es die Top-Plättchen der Sandwiches abschlagen wird. </li><li> Mit dem Mikrotom-Messer, brechen schnell die Sandwiches und dann sofort heben es auf Kontamination der Proben durch Trümmer Haften an dem Messer zu verhindern, und drehen Sie die gekühlte Blende oberhalb der neu freigelegten Ebene, die die Proben zu schützen vor einer möglichen Kontamination von Wassermolekülen in die Kammer. </li><li> Bestreichen Sie die Proben mit Platin und Kohlenstoff. <ol><li> Geben Sie &quot;Layer 1&quot; auf der scReen. Schalten Sie den Pt / C-Pistole mit der Taste durch die &#39;ON&#39; Taste gefolgt &#39;gun1&#39; drücken. Untersuchen Sie die Verdampfungsrate und sobald es 0,02 erreicht - 0,04 nm / s, gleichzeitig die Proben aussetzen und drücken Sie die &quot;Maßnahme&quot;, um die Dicke der abgeschiedenen Schicht zu überwachen. Hinweis: Waffe schaltet sich automatisch ab, wenn die Dicke des vorgewählten Wert erreicht hat. </li><li> Decken Sie die Proben mit dem Verschluss, wenn Pt / C Verdampfungs abgeschlossen ist. </li><li> Drücken Sie die &quot;Ebene&quot;, um sich zu bewegen, um &quot;Layer 2&quot;. Wiederholen Sie die Schritte 2.8.1 und 2.8.2, mit Ausnahme der Auswahl &#39;GUN2&#39; (für Kohle) und eine Verdampfungsrate von ~ 0,1 nm / s. </li></ol></li><li> Wärmen Sie das Gefrierbruchsystem Stufe bis -120 ° C. </li></ol> 3. Cryo-Rasterelektronenmikroskopie <ol><li> Bereiten Sie das Rasterelektronenmikroskop für Kryo Arbeit. <ol><li> Wählen Bühne / Bühnen Initialise aus dem Hauptmenü und bestätigen. </li><li> Wählen Sie Extras / GotO-Panel, und öffnen Sie das Bedienfeld &quot;Airlock&quot; indem Sie es aus der Liste auswählen. Klicken Sie auf &#39;Schließen Spalte Kammerventil&#39; Taste. Entlüften Sie das Mikroskop Kammer durch die Vent-Taste unter dem &quot;Vacuum&quot; Registerkarte klicken. </li><li> Wählen Sie Extras / Goto-Panel und öffnen Sie die &quot;Stage-Punkte-Liste &#39;Panel. Wählen Sie die Kryo-Austauschposition die Bühne auf die richtigen Koordinaten für die Annahme des Probenhalters zu bewegen. Anmerkung: Die &quot;Kryo-Wechselposition &#39;voreingestellt ist mit der Position der Vakuumtransfereinheit in Ausrichtung zu sein. </li><li> Öffnen Sie die Probenkammer mit einem sauberen Paar Handschuhe und legen Sie die Kryo-Bühne auf der Hauptbühne des Mikroskops. Schließen Sie die Kammer und klicken Sie auf die Pump-Taste unter dem &quot;Vakuum-Registerkarte&quot;. </li><li> Kühlen Sie das Mikroskop auf -120 ° C. Füllen Sie das Mikroskop Dewar mit flüssigem Stickstoff. Aktivieren Sie die Wärme-Funktion auf der Kryo-Übertragungssteuereinheit bis -120 ° C, wenn die Temperatur der Bühne unter -120 ° C sinkt. </li></ol></li><li> Attach der Kryo-Transfer-Shuttle zum Mikroskop und übertragen den Probenhalter der einfahrenden Arm in das Mikroskop Kryo Bühne mit (wie in Schritt 2.5). Nehmen Sie den Shuttle vom Mikroskop. </li><li> Klicken Sie auf das &#39;Open Spalte Kammerventil&#39; Taste in der Airlock-Panel. </li><li> Bewegen Sie vorsichtig den Probenhalter nahe der Objektivlinse (Arbeitsabstand von 1 bis 2 mm) mit dem Joystick. Wählen Sie eine 10-um-Öffnung in der &#39;Apertures&#39; Tab. Doppelklicken Sie auf das EHT-Feld in der Registerkarte &#39;Gun&#39;. Geben Sie 10 (kV) für das EHT Ziel und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf die untere EHT Registerkarte und wählen Sie &quot;EHT On &#39;. </li><li> Wählen Sie &#39;InLens&#39; von den Detektoren der Dropdown-Liste in der Registerkarte &quot;Detektoren&quot;. Optimieren Sie Abbildungsbedingungen (Fokus, Helligkeit und Kontrast, Strahlausrichtung, Astigmatismus) als angemessen. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Scannen&quot;. Wählen Sie einen schnellen Scan ( &quot;Scan-Geschwindigkeit = 1 &#39;, zu einer Verweilzeit von 100 ns pro Pixel entspricht) Strahlenschäden zu minimieren unda &#39;Shop Auflösung &quot;von 1.024 x 768 Pixel. Wählen Sie &#39;Line Avg&#39; in der &#39;Noise Reduction &quot;Drop-Down-Liste. Passen Sie den Wert von N 20 - 30 Zeilen für die Suche. Bewegen Sie die Probe des &quot;Centre Point&quot; Funktion (durch Drücken von Strg-Tab auf der Tastatur) für Regionen mit gebrochenen Zellen und Chloroplasten (2A und 2B) zu suchen. </li><li> Erwerben Sie Bilder von gebrochenen Chloroplasten bei niedrigen Vergrößerungen (50-70 kX) (2C und 2D). Verwenden Sie die Zentrale Funktion &quot;Funktion (durch Drücken von Strg-Umschalt-Tab auf der Tastatur) in interessante Chloroplasten Bruchflächen zu vergrößern und Bilder aufzunehmen , bei hohen Vergrößerungen (100-200 kX, 3 und 4). Verwenden Sie die gleichen Parameter wie in Schritt 3.6 für die Bildaufnahme, sondern ändern Sie die Zeile Avg Wert N&gt; 100 zur Geräuschreduzierung 30. <ol><li> Drücken Sie Freeze auf dem Hauptmikroskop Steuereinheit oder in der Registerkarte &#39;Scannen&#39; das Scannen zu stoppen und speicherndas Bild durch die &#39;Save TIFF&#39; Taste drücken. </li></ol></li></ol> 4. Bildanalyse Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt ein kurzes Verfahren zur Segmentierung von Membranpartikeln aus der Gefrierbruch - REM - Aufnahmen der 31 Fidschi mit Open-Source - Paket. Ähnliche Ergebnisse können mit anderen Bildanalyse-Software erhalten werden. <ol><li> Bild öffnen mit Fidschi durch Image-Datei in das Hauptprogrammfenster ziehen. Wandeln Sie das Bild in 8-Bit durch die Auswahl Bild / Typ / 8-Bit. Wählen Sie Bild / Anpassen / Helligkeit / Kontrast und ggf. einstellen (5A). </li><li> Die gerade Linie Werkzeug verwenden und eine Linie durch die Größe der eingebetteten Bildmaßstabsleiste ziehen. Analysieren Sie Select / Set-Skala. Geben Sie den richtigen Maßstab Informationen (bekannten Abstand und Längeneinheit) und klicken Sie auf OK. Speichern Sie diese angepasst skalierte Bild. </li><li> Wählen Sie Prozess / Filter / Gaußsche Unschärfe (1,5 nm Radius) und klicken Sie auf OK (Abbildung 5B). </li><li> Wählen Sie Bild / Anpassen / Auto Lokale Threshold (unter Verwendung des Niblack - Methode) und klicken Sie auf OK (Abbildung 5C). </li><li> Wählen Sie Bearbeiten / Umkehren und dann Prozess / Binär / Watershed (5D). </li><li> Zeichnen Sie einen Rahmen um den Bereich von Interesse (ROI) mit dem Freihandauswahlwerkzeug. Fügen Sie die Auswahl in die ROI-Manager, indem Sie Bearbeiten / Auswahl / In den Manager oder durch Klicken auf &#39;T&#39;. </li><li> Wählen Sie Bearbeiten / Löschen Outside (5E). </li><li> Analysieren Sie Select / Set Messungen, wählen Sie die entsprechenden Parameter (zB Bereich, fit Ellipse). </li><li> Analysieren Auswahl / Analysieren Partikel. Geben Sie einen geeigneten Bereich für die Größe der Partikel und markieren &#39;Ergebnisse anzeigen&#39;, &#39;In den Managers und, falls erforderlich, die &quot;Ausschließen auf Kanten&#39;, und klicken Sie auf OK. Das Ergebnis ist in Figur 5F gezeigt. </li><li> Öffnen Sie die gespeicherte skaliert abgebildete Datei (Schritt 4.2). Wählen Sie &quot;Alle einblenden&quot; und deaktivieren Sie &quot;Labels&quot; im ROI-Manager. Überprüfen Sie die ausgewählten particles legte auf das Originalbild und manuell hinzufügen oder eine Auswahl zu entfernen, indem Sie die &quot;Hinzufügen&quot; oder &quot;Löschen&quot; Tasten des ROI-Manager. Korrigieren Sie alle Auswahlen erforderlich durch das Freihandauswahlwerkzeug und die &quot;Aktualisieren&quot; Taste des ROI Manager (Figuren 5G und 5H) verwendet wird . </li><li> Analysieren Sie die Daten, die die erhaltenen Messungen verwendet wird. Im Ergebnisfenster, klicken Sie auf Ergebnisse / Summarize zu erhalten, zum Beispiel die mittlere Fläche und mittlere Haupt- und Nebenachsen der Teilchen in dem ROI-Manager aufgelistet. Klicken Sie auf Ergebnisse / Vertrieb, wählen Sie einen Parameter (wie Area) und klicken Sie auf OK, um ein Histogramm für diesen Parameter anzuzeigen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Technik in diesem Papier beschrieben ermöglicht Untersuchung von gefrier frakturiert Membranen im Zusammenhang mit gut erhaltenen Hochdruck eingefroren Pflanzengewebe durch Kryo-Rasterelektronenmikroskopie. Der große Vorteil dieser Verfahren zu verwenden, ist, dass die Probenvorbereitung rein physikalisch ist; keine Stufen Chemikalien oder Dehydrierung sind beteiligt notwendig. Somit ermöglicht es 26,32 biologische Strukturen in einer nahezu nativen Zustand zu studieren. Der Vorteil von Blattgeweben beste...

Oxygenic Photosynthese, mit Ursprung in der alten Cyanobakterien, wurde von Algen und Landpflanzen von endosymbiontischen Ereignisse geerbt, die zur Entwicklung des Chloroplasten Organell geführt. In allen heutigen oxygenic phototrophs, photosynthetischen Elektronentransport und die Erzeugung von Protonen-Antriebskraft und Reduktionskraft innerhalb abgeflachten sackartige Bläschen genannt &#39;thylakoid&#39; Membranen durchgeführt. Diese Membranen beherbergen die Proteinkomplexe, die die lichtgetriebene Reaktionen der Photosynthese durchführen und ein Medium für die Energieübertragung zur Verfügung stellen. Die Thylakoidmembran von Pflanzen und (etwas) Algen sind in zwei verschiedene morphologische Domänen unterschieden: eng anliegend Membranbereiche genannt &quot;grana&quot; und unstacked Membranen, die das Grana miteinander verbinden, &quot;Stroma Lamellen&quot; genannt 1. Verschiedene Gefrierbruch-Studien von Pflanzen- und Algen Thylakoidmembran durchgeführt wurden, in den frühen 1970er Jahren beginnen. Wenn gefrier gebrochen, Membranenaufgeteilt entlang ihrer hydrophoben Kern 2, Erzeugen einer exoplasmic Fläche (EF) und eine protoplasmatische Fläche (PF), in Abhängigkeit von der zellulären Kompartiment der die Halbmembran grenzt, wie ursprünglich von Branton geprägt et al. . 1975 3 Pflanzen- und Algen thylakoids haben vier verschiedene Bruchflächen: EFs, EFU, PFs und PFU, mit &quot;s&quot; und &quot;u&quot; bezeichnet &quot;gestapelt&quot; und &quot;ungestapelt &#39;Membranbereiche sind. Die Membranproteinkomplexe, die nicht gespalten oder gebrochen sind, haben die Tendenz, mit entweder der E- oder P-Seite der Membran zu bleiben. Die anfänglichen Beobachtungen , die die verschiedenen Bruchflächen der Thylakoide Teilchen unterschiedlicher Größen enthalten und Dichten 4 und die zahlreichen Untersuchungen , die folgten, führte zur Identifizierung und Korrelation zwischen den beobachteten Teilchen und den Membranproteinkomplexen, die die Lichtreaktionen durchzuführen 5-13 (siehe auch Bewertungen 14,15). freEze-Bruchversuche von Thylakoidmembran sind in der Regel auf die Vorbereitung von Chloroplasten oder isolierten Thylakoidmembran durchgeführt (siehe aber 16,17), auf die Gefahr einer inhaltlichen Änderung in strukturellen und / oder supramolekulare Organisation , die während des Isolierungsverfahrens auftreten können. Folgende Fraktur werden Repliken durch Verdampfung von Platin / Kohlenstoff (Pt / C) hergestellt, dann mit einer dicken Schicht aus Kohlenstoff (C) und schließlich Verdau des biologischen Materials 18. Replikate werden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sichtbar gemacht. Die traditionelle Gefrierbruch-Replikatechnik weiterhin für die Untersuchung der supramolekulare Organisation von photosynthetischen Membranen und deren Anpassung an verschiedene, z. B. Licht, Bedingungen 19-23 als wichtiges Instrument dienen. In unserer aktuellen Studie der homoiochlorophyllous Auferstehungspflanze Craterostigma 24 pumilum wollten wir die Veränderungen in der Supramolekularen Organisation o zu untersuchenf Thylakoidmembranen sowie in Gesamtzellorganisation während der Dehydratisierung und Rehydratisierung. Die Einzigartigkeit der homoiochlorophyllous Auferstehung Spezies ist, dass sie in der Lage sind die Bedingungen des Austrocknens, um zu überleben in ihren vegetativen Geweben (Blätter), während ihre Photosyntheseapparat zu halten. Sobald Wasser zur Verfügung steht, stellen sich diese Pflanzen und photosynthetische Aktivität wieder aufzunehmen innerhalb von Stunden bis wenigen Tagen 25. Für diese Studie cryo-scanning EM (SEM) Abbilden von gefrier frakturiert Blattproben wurde in Verbindung mit Hochdruck-Gefrieren für Probe Kryo-Immobilisierung. Diese Verfahren stellen ein Mittel zur Visualisierung tiefgefrorenen biologischen Proben in einem Zustand nahe ihrem nativen Zustand 26. Ein wesentlicher Vorteil ist, dass die Proben untersucht werden direkt nach dem Gefrierbruch und Beschichtung ohne aufeinanderfolgenden Schritten. Dies ist besonders relevant für die Untersuchung der Pflanzen bei unterschiedlichen relativen Wassergehalt (RWC), deren Hydratationszustand während der Herstellung beibehalten wird. Wieje ist ein entscheidender Nachteil, dass gefrorene hydratisierte Proben von Strahlenschäden während der Bebilderung kann leiden, insbesondere wenn sie bei hohen Vergrßerungen abgetastet, um eine genaue Messung der Grße der photo Komplexen erforderlich. Um dies zu überwinden, wird ein Verfahren &#39;Double-Layer - Beschichtung &quot;(DLC) 27,28 kombiniert mit spezifischen Kryo-SEM - Bildgebung Bedingungen wurden verwendet genannt. Diese in Proben ergab , dass deutlich weniger Strahlenempfindlich sind und für die Aufklärung von wertvollen Informationen über die photosynthetische Protein supramolekulare Organisation und andere zelluläre Bestandteile der Auferstehungspflanze erlaubt C. pumilum bei hohen Vergrößerungen in situ.

<table><tbody><tr><td>Ethanol abs</td><td>Bio-Lab</td><td>052505</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Bio-Lab</td><td>162605</td><td></td></tr><tr><td>1-Hexadecen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7009</td><td></td></tr><tr><td>0,1/0,2 Thrombozyten</td><td>Ingenieurbüro M. Wohlwend GmbH, Schweiz</td><td>241</td><td>Thrombozyten haben einen Durchmesser von 3 mm und eine Dicke von 0,5 mm (Typ A) mit 0,1/0,2 mm tiefen Kavitäten (Durchmesser 2 mm). Ähnliche Blutplättchen können von Leica Microsystems bezogen werden.</td></tr><tr><td>Hochpräzise Pinzette</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72706-01</td><td>Dumont (Schweiz) Durostar Style #5 Pinzette; Kann durch andere hochpräzise Pinzetten ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Hochdruck-Gefriermaschine</td><td>Bal-Tec</td><td>HPM 010</td><td>Alternativen zum Hochdruck-Gefrieren: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>Gefrierfraktursystem</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM BAF 060</td><td></td></tr><tr><td>Kryovorbereitung Ladetisch</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770228</td><td></td></tr><tr><td>Probenhalter für die universelle Gefrierfraktur</td><td>Leica Microsystems</td><td>16LZ04746VN</td><td>Klemmhalter für Probenträger mit einem Durchmesser von 3 mm</td></tr><tr><td>Vakuum-Kryotransfer-Shuttle</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM VCT 100</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 055</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-REM-Tisch</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770299905</td><td></td></tr><tr><td>Bilderfassungssoftware</td><td>SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>Fiji/Image J, National Institute of Health</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

die untersuchung der supramolekulare organisation photosynthetic membranen innerhalb gefrier gebrochen blattgewebe von cryo-rasterelektronenmikroskopie

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-Rasterelektronenmikroskopie (SEM) von gefrier gebrochenen Proben ermöglicht Untersuchung biologischer Strukturen mit nahezu nativen Bedingungen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung der supramolekulare Organisation von photo (thylakoid) Membranen innerhalb Blattproben. Dies wird durch die Hochdruck Einfrieren von Blattgewebe erreicht, gefrier Fracturing, Double-Layer-Beschichtung und schließlich Kryo-SEM-Bildgebung. Die Verwendung der Doppelschicht-Beschichtungsverfahren ermöglicht eine hohe Vergrößerung (&gt; 100.000 ·) Bilder mit minimaler Strahlen Schäden an den tiefgefrorenen Proben sowie minimale Aufladungseffekte zu erwerben. Mit den beschriebenen Verfahren untersuchten wir die Veränderungen in der supramolekularen Verteilung des Photosystems und lichtsammelnden Antenne Proteinkomplexe, die während der Dehydratisierung der Auferstehungspflanze Craterostigma pumilum stattfinden, in situ.

Abbildung 1 zeigt Kryo-REM - Aufnahmen von Blutplättchen Hochdruck eingefroren, gefrier gebrochen Craterostigma pumilum Blattstücke enthält. In einigen Proben sind große Regionen von gebrochenen Zellen erhalten (1A). In anderen, bleibt das Blattstück fest an der oberen Scheibe gebunden und zusammen mit ihm (1B) abgeschlagen. Aber auch im zweiten Fall können einige Blattgewebe zum Messer Rillen auf dem Plättchen (1B,</str...

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung von gefrierfrakturiertem Pflanzengewebe. Unter hohem Druck gefrorene Blattproben werden gefriergebrochen und doppelschichtbeschichtet, wodurch gut konservierte gefrorene hydratisierte Proben entstehen, die mit dem Kryo-Rasterelektronenmikroskop bei hohen Vergrößerungen mit minimaler Strahlschädigung abgebildet werden.

Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, die supramolekulare Organisation photosynthetischer Membranen mittels Kryo-Rasterelektronenmikroskopie von gefriergebrochenen Blattgewebeproben zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Zellbiologie zu beantworten, wie beispielsweise die morphologische Charakterisierung von Zellen und Organellen, die Verteilung membranintegrierter Proteinkomplexe sowie die Lokalisation von Biomineralien. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Gefrierbruchpräparation direkt an Blattgeweben durchgeführt wird, sodass die supramolekulare Organisation der Thylakoidmembran im nativen Organellen- und zellulären Kontext untersucht wird.Obwohl diese Methode hier an einer biologischen Probe demonstriert wird, kann sie auch auf Gele, Polymere und Drug-Delivery-Systeme angewendet werden. Im Allgemeinen sollten Personen, die neu in diesen Verfahren sind, bedenken, dass nicht alle Proben gut eingefroren oder ordnungsgemäß gebrochen werden. Um die Kryofixierung von Blattgeweben durch Hochdruckgefriervorgänge durchzuführen, benutzen Sie zunächst die Ecke einer Rasierklinge, um den Boden der 0,1-Millimeter-Höhle einer Aluminiumplatte mit einer Dicke von 0,1 bis 0,2 Millimeter anzukratzen.Bereiten Sie mindestens ein Dutzend Thrombozyten für sechs Proben vor. Waschen Sie anschließend die Thrombozyten mit absolutem Ethanol und bewahren Sie sie in einer sauberen Schale auf. Nachdem Sie das Hochdruckgefriermikroskop vorbereitet haben, füllen Sie die Probenschachtel mit flüssigem Stickstoff.Mit einer Rasierklinge wird ein kleines Stück Blatt von der Pflanze abgeschnitten und mit einer Pinzette in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das zur Hälfte mit einem Hexadecan gefüllt ist. Um die interzellulären Räume des Blattgewebes zu infiltrieren, wird die Spitze des Infiltrationsgeräts, das gemäß der schriftlichen Anleitung vorbereitet wurde, in das Loch im Deckel des Mikrozentrifugenröhrchens eingeführt, und der Kolben wird gezogen, um ein Vakuum zu erzeugen. Nach etwa 30 Sekunden wird der Kolben losgelassen.Danach mit einer Pinzette das Blattstück aus dem Röhrchen entnehmen. Mit der Rasierklinge ein Stück abschneiden, das klein genug ist, um in eine Plättchenform zu passen. Gegebenenfalls das Blatt auf eine Dicke von weniger als 0,2 Millimetern zuschneiden.Um einen Gewebeeinsturz zu verhindern, werden Blätter vor dem Hochdruckgefrieren mit Flüssigkeit infiltriert. Die Probendicke wird unter 200 Mikrometern gehalten, um die Wahrscheinlichkeit für eine vitrifizierte Probe zu maximieren. Legen Sie eine saubere Plättchen mit der kratzigen Seite nach oben in den Halter der Gefrieranlage.Legen Sie dann das ausgeschnittene Blattstück in die Kammer. Füllen Sie den verbleibenden Raum in der Kammer mit einem Tropfen Hexadecan, bevor Sie eine weitere Kammerplatte mit den Kratzern zur Blattoberfläche hin verwenden, um das Sandwich zu schließen. Schließen und festigen Sie den Halter.Frieren Sie die Probe ein, indem Sie den Jet-Knopf drücken. Überführen Sie den Halter anschließend schnell in flüssigen Stickstoff. Entfernen Sie das Sandwich mit vorgekühlten Pinzetten aus dem Halter, wobei darauf geachtet werden muss, es nicht zu brechen.Es gibt zwei kritische Schritte im Verfahren: das Freeze-Fracture, ein zufälliger Prozess, dessen Erfolg erst im Kryo-REM beurteilt werden kann, und die Doppelschichtbeschichtung, die erforderlich ist, um Aufnahmen mit hoher Vergr&ouml;&szlig;erung und minimaler Strahlsch&auml;digung zu erhalten. W&auml;hrend der Vorbereitung und Programmierung der Freeze-Fracture-Anlage gem&auml;&szlig; den Herstelleranweisungen sollte die Platin-Kohlenstoff- oder Pt/C-Kanone unter 45 Grad und die Kohlenstoffkanone unter 90 Grad positioniert werden. K&uuml;hlen Sie die Probehalterstufe des Freeze-Fracture-Systems auf minus 140 oder minus 160 Grad Celsius ab.Dann befestigen Sie die Vakuum-Kryo-Transfer-Schleuse an der Maschine und füllen Sie die Schleusenkammer mit flüssigem Stickstoff. Setzen Sie einen Gefribruch-Probenhalter in die Ladeeinheit ein und fluten Sie die Kammer der Ladeeinheit mit flüssigem Stickstoff. Laden Sie anschließend mit hochpräzisen Pinzetten ein gefrorenes Sandwich auf den Halter und befestigen Sie es fest.Drehen Sie dann den Halter um, um zu überprüfen, ob das Sandwich sicher befestigt ist, und wiederholen Sie den Vorgang für ein zweites Sandwich. Trennen Sie die abgekühlte Shuttle-Einheit von der Gefriergalvanik-Maschine und verbinden Sie sie mit der Ladeeinheit. Öffnen Sie dann das Shuttle-Ventil, führen Sie den Rückzugsarm in den Halter ein, verriegeln Sie ihn und führen Sie den Arm mit dem Halter erneut in das Shuttle ein.Nachdem die Shuttle wieder an der Gefriergarationsanlage befestigt wurde, führen Sie den Halter mithilfe des Auszieharmes in die Kammer ein. Richten Sie nun das Mikrotom-Messer der Gefriergaration so in der Höhe aus, dass es die oberen Plättchen der Sandwiches abstoßen wird. Brechen Sie mit dem Mikrotommesser die Sandwiches schnell auf.Heben Sie dann sofort das Messer an, um eine Kontamination der Proben durch anhaftende Rückstände am Messer zu vermeiden. Positionieren Sie den gekühlten Verschluss über der neu freigelegten Ebene, um die Proben vor einer möglichen Kontamination durch Wassermoleküle in der Kammer zu schützen. Drücken Sie anschließend Setup, um Schicht 1 auf dem Bildschirm anzuzeigen, um die Proben mit Platin zu beschichten.Schalten Sie dann die Pt/C-Pistole ein, indem Sie zuerst die GUN-1-Taste und anschließend die ON-Taste drücken. Überprüfen Sie die Verdampfungsrate und drücken Sie, sobald sie 0,02 bis 0,04 Nanometer pro Sekunde erreicht hat, die Measure-Taste, um die Dicke der abgeschiedenen Schicht zu überwachen, während gleichzeitig die Proben belichtet werden. Um mit Kohlenstoff zu beschichten, wählen Sie GUN 2 und danach die ON-Taste.Sobald die Verdampfungsrate etwa 0,1 Nanometer pro Sekunde beträgt, drücken Sie die Schaltfläche „Measure“ und bewegen gleichzeitig den Verschluss, um die Proben freizulegen. Wenn die Beschichtung abgeschlossen ist, erwärmen Sie den Probentisch auf minus 120 Grad Celsius. Um das Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Arbeit vorzubereiten, wählen Sie im Hauptmenü „Stage“, „Stage Initialize“ und bestätigen Sie die Auswahl.Wählen Sie unter der Registerkarte „Vacuum“ die Schaltfläche „Vent“, um die Mikroskophöhle zu entlüften. Wählen Sie anschließend „Tools“, „Goto Panel“ und öffnen Sie das Fenster „Stage Points List“. Wählen Sie die Position „CRYO EXCHANGE“, um den Probentisch zu den richtigen Koordinaten zu bewegen, an denen er den Probenhalter aufnehmen kann.Öffnen Sie unter Verwendung eines sauberen Handschuhpaars die Probekammer und setzen Sie die Kryostufe auf die Hauptstufe des Mikroskops ein. Schließen Sie die Kammer und klicken Sie unter der Registerkarte „Vacuum“ auf die Schaltfläche „Pump“. Kühlen Sie anschließend das Mikroskop, indem Sie den Duor des Mikroskops mit flüssigem Stickstoff füllen.Sobald die Temperatur des Stages unter minus 120 Grad Celsius fällt, aktivieren Sie die Heizfunktion an der Kryo-Transfer-Einheit, um den Stage auf minus 120 Grad Celsius aufzuwärmen. Befestigen Sie nun den Kryo-Transfer-Shuttle am Mikroskop und übertragen Sie den Probenhalter mithilfe des einziehbaren Arms in den Kryo-Stage des Mikroskops. Bewegen Sie den Probenträger mit Hilfe des Joysticks vorsichtig in die Nähe der Objektivlinse.Wählen Sie im Reiter „Apertures“ die 10-Mikrometer-Apertur aus. Gehen Sie dann im Reiter „Gun“ zum Feld EHT-Ziel, doppelklicken Sie darauf, geben Sie 10 Kilovolt als EHT-Ziel ein und klicken Sie auf „OK“. Schalten Sie anschließend die Beschleunigungsspannung ein, indem Sie auf den unteren EHT-Reiter klicken und „EHT ein“ auswählen. Im Reiter „Detectors“ wählen Sie aus der Dropdown-Liste „InLens“. Klicken Sie dann auf den Reiter „Scanning“ und wählen Sie eine Scan-Geschwindigkeit von eins, was einer schnellen Abtastung zur Minimierung von Strahlschäden entspricht, sowie eine Speicherungsauflösung von 1024 mal 768 Pixeln.Wählen Sie in der Dropdown-Liste „Noise Reduction“ die Option „Line Average“ aus, und stellen Sie den Wert von n auf 20 bis 30 Zeilen zum Suchen ein. Bewegen Sie dann mithilfe der Tasten „Control“ und „Tab“ auf der Tastatur mit der Mittelpunktfunktion die Probe in interessierende Bereiche, während Sie gleichzeitig vergrößern, um Regionen mit gebrochenen Zellen zu identifizieren. Nachdem Sie Regionen mit gebrochenen Zellen identifiziert haben, scannen Sie die Probe unter Vergrößerung, um einen gebrochenen Chloroplasten zu finden.Danach den Mittelwert n der Zeilen auf einen Wert über 100 zur Rauschunterdrückung einstellen. Im Reiter „Scanning“ die Taste „Freeze“ drücken, um das Scannen zu stoppen. Durch Drücken von Strg+Umschalt+Tab auf der Tastatur wird die Zentrierfunktion verwendet, um in interessante Chloroplasten-Frakturflächen hineinzuzoomen; anschließend werden Hochvergrößerungsaufnahmen mit denselben Parametern wie zuvor aufgenommen.Drücken Sie abschließend die Schaltfläche „TIFF speichern“, um das Bild zu speichern. Führen Sie die Bildanalyse gemäß dem Textprotokoll durch. Diese Abbildung zeigt ein Kryo-REM-Bild eines Thrombozyten, der ein hochdruckgefrorenes, gefracturtes Blattstück von Craterostigma pumilum mit einem großen Bereich frakturierter Zellen enthält.In diesem Beispiel fehlt das Blattstück; jedoch verblieb etwas Blattgewebe, das an den Messerrillen auf der Plättchenoberfläche haftet. Nachdem eine erfolgreiche Fraktur gefunden wurde, werden Aufnahmen mit niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung von Zellen angefertigt, um interessierende Bereiche wie frakturierte Chloroplasten zu identifizieren. Es werden Bilder einzelner frakturierter Chloroplasten aufgenommen, um die Frakturfl&auml;chen der Thylakoidmembran zu identifizieren.Im Beispiel gezeigt ist ein Bild mit hoher Vergr&ouml;&szlig;erung der Thylakoidmembranen in Bl&auml;ttern von C. pumilum. Die vier verschiedenen Bruchfl&auml;chen k&ouml;nnen unterschieden werden. Die exoplasmatischen Bruchfl&auml;chen der gestapelten und ungefalteten Membranen, EFs bzw. EFu, und die protoplasmatischen Fl&auml;chen der gestapelten und ungefalteten Membranen, PFs bzw. PFu.Photosystem II, oder PS2, befindet sich sowohl in den gestapelten Grana-Membranbereichen der EFs als auch in den stromalamellaren Membranbereichen der EFu. Im hydratisierten Zustand ist die Dichte von PS2 in den EFs ungefähr dreimal höher als in den EFu, was die beiden Flächen unterscheidet. Während der Dehydratation von C. pumilum nimmt die Dichte von PS2 in den EFs allmählich ab und erreicht etwa die Hälfte ihres Werts unter hydratisierten Bedingungen.Bemerkenswerterweise ordnen sich PS2-Komplexe bei weiterer Dehydrierung auf fünf bis 10 % relativen Wassergehalt in Reihen und Arrays an. Die Entwicklung der Gefrißbruch-Replikat-Technik ebnete den Weg zur Untersuchung der Größe von Membranproteinkomplexen und ihrer Anordnung in biologischen Membranen. Die Kombination von Gefrißbruch mit Hochdruckgefrierung in der Kryo-SEM ermöglicht die Untersuchung verschiedener Probenarten auf mehreren Größenskalen, von Gewebe- und Zellebene bis hin zur makromolekularen Ebene in einem nahezu nativen Zustand.Neben der hier gezeigten Technik können Methoden wie die energiedispersive Röntgenspektroskopie, EDS, ebenfalls im Kryo-REM angewendet werden; beispielsweise zur Alkalisierung von Biomineralien.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal

Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie

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