Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, die supramolekulare Organisation photosynthetischer Membranen mit Hilfe der Kryo-Rasterelektronenmikroskopie von gefriergebrochenen Blattgewebeproben zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Zellbiologie zu beantworten, wie z.B. die morphologische Charakterisierung von Zellen und Organellen, die Verteilung von Membran-integralen Proteinkomplexen und die Lokalisierung von Biomineralien. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Gefrierfraktur am Blattgewebe durchgeführt wird, so dass die supramolekulare Organazierung der Thylakoidmembran innerhalb des nativen Organellen- und Zellkontexts untersucht wird.

Während diese Methode hier für eine biologische Probe demonstriert wird, kann sie auch auf Gele, Polymere und Wirkstoffabgabesysteme angewendet werden. Im Allgemeinen sollten sich Personen, die mit diesen Verfahren noch nicht vertraut sind, darüber im Klaren sein, dass nicht alle Proben gut eingefroren oder ordnungsgemäß gebrochen werden. Um die Kryofixierung von Blattgewebe durch Hochdruckgefrieren durchzuführen, beginnen Sie damit, mit der Ecke einer Rasierklinge den Boden des 0,1 Millimeter großen Hohlraums einer 0,1 bis 0,2 Millimeter großen Aluminiumplättchen zu zerkratzen.

Bereiten Sie mindestens ein Dutzend Blutplättchen für sechs Proben vor. Verwenden Sie dann absolutes Ethanol, um die Blutplättchen zu waschen, und bewahren Sie sie in einem sauberen Geschirr auf. Nachdem Sie die Hochdruck-Gefriermaschine vorbereitet haben, füllen Sie die Probenbox mit flüssigem Stickstoff.

Schneide mit einer Rasierklinge ein kleines Stück Blatt von der Pflanze ab und lege das Gewebe mit einer Pinzette in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das zur Hälfte mit einem Hexadecan gefüllt ist. Um die Interzellularräume des Blattgewebes zu infiltrieren, führen Sie die Spitze der Infiltrationsvorrichtung, die wie im Textprotokoll beschrieben vorbereitet ist, in das Loch im Deckel des Mikrozentrifugenröhrchens ein und ziehen Sie den Kolben, um ein Vakuum zu erzeugen. Lassen Sie nach ca. 30 Sekunden den Kolben los.

Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette das Blattstück aus der Tube. Schneide mit der Rasierklinge ein Stück ab, das klein genug ist, um in ein Plättchen zu passen. Und wenn nötig, schneiden Sie das Blatt auf eine Dicke von weniger als 0,2 Millimetern ab.

Um einen Gewebekollaps zu verhindern, werden die Blätter vor dem Hochdruckgefrieren mit Flüssigkeit infiltriert. Die Probendicke wird unter 200 Mikrometern gehalten, um die Chance auf eine vitrifizierte Probe zu maximieren. Legen Sie ein sauberes Plättchen mit der Kratzseite nach oben in die Halterung der Gefriermaschine.

Und dann legen Sie das abgeschnittene Blattstück in das Plättchen. Verwenden Sie ein Hexadekan, um den verbleibenden Raum des Plättchens zu füllen, bevor Sie ein anderes Plättchen verwenden, dessen Kratzer zum Blatt zeigen, um das Sandwich zu schließen. Schließen Sie die Halterung und ziehen Sie sie fest.

Frieren Sie die Probe ein, indem Sie die Düsentaste drücken. Übertragen Sie dann den Halter schnell in flüssigen Stickstoff. Nehmen Sie das Sandwich mit einer Pinzette aus der Halterung und achten Sie darauf, dass es nicht zerbricht.

Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Verfahren: die Gefrierfraktur, die ein zufälliger Prozess ist und dessen Erfolg nur im Kryo-REM beurteilt werden kann, und die Doppelschichtbeschichtung, die erforderlich ist, um Bilder mit hoher Vergrößerung und minimaler Strahlschädigung zu erhalten. Platzieren Sie bei der Vorbereitung und Programmierung der Gefrierbruchmaschine gemäß den Anweisungen des Herstellers die Platinkohlenstoff- oder Pt/C-Pistole in einem Winkel von 45 Grad und die Kohlepistole in einem Winkel von 90 Grad. Kühlen Sie die Stufe des Gefrierbruchsystems auf minus 140 oder minus 160 Grad Celsius ab.

Befestigen Sie dann das Vakuum-Kryo-Transfer-Shuttle an der Maschine und verwenden Sie flüssigen Stickstoff, um die Shuttle-Kammer zu füllen. Setzen Sie einen Gefrierfraktur-Probenhalter in die Ladestation ein und fluten Sie die Kammer der Ladestation mit flüssigem Stickstoff. Legen Sie anschließend mit einer hochpräzisen Pinzette ein gefrorenes Sandwich auf den Halter und ziehen Sie es fest.

Drehen Sie dann den Halter um, um zu überprüfen, ob das Sandwich an Ort und Stelle sitzt, und wiederholen Sie den Vorgang für ein zweites Sandwich. Trennen Sie das gekühlte Shuttle von der Gefrierfrakturmaschine und verbinden Sie es mit der Ladestation. Öffnen Sie dann das Wechselventil, führen Sie den Einzieharm in die Halterung ein, arretieren Sie ihn und setzen Sie den Arm mit der Halterung wieder in das Wendegetriebe ein.

Nach dem Wiederanbringen des Schiffchens an der Gefrierfrakturmaschine führen Sie den Halter mit dem Einzieharm in die Kammer ein. Richten Sie nun das Gefrierbruch-Mikrotommesser so aus, dass es die oberen Blutplättchen der Sandwiches abschlägt. Mit dem Mikrotommesser die Sandwiches schnell aufbrechen.

Heben Sie dann sofort das Messer an, um eine Kontamination der Proben durch Schmutz zu verhindern, der am Messer haftet. Positionieren Sie den gekühlten Verschluss über der neu freigelegten Ebene, um die Proben vor einer möglichen Kontamination durch Wassermoleküle in der Kammer zu schützen. Um die Proben anschließend mit Platin zu beschichten, drücken Sie Setup, um Schicht 1 auf dem Bildschirm anzuzeigen.

Schalten Sie dann die Pt/C-Pistole ein, indem Sie die Taste GUN 1 und dann die Taste ON drücken. Untersuchen Sie die Verdampfungsrate, und sobald sie 0,02 bis 0,04 Nanometer pro Sekunde erreicht, drücken Sie die Messtaste, um die Dicke der abgeschiedenen Schicht zu überwachen und gleichzeitig die Proben freizulegen. Um mit Carbon zu beschichten, wählen Sie GUN 2 und dann die ON-Taste.

Sobald die Verdampfungsrate etwa 0,1 Nanometer pro Sekunde beträgt, drücken Sie die Messtaste und bewegen Sie gleichzeitig den Verschluss, um die Proben zu belichten. Wenn die Beschichtung abgeschlossen ist, erwärmen Sie die Bühne auf minus 120 Grad Celsius. Um das Rasterelektronenmikroskop für die Kryoarbeit vorzubereiten, wählen Sie im Hauptmenü Tisch, Tischinitialisieren und bestätigen Sie.

Klicken Sie auf der Registerkarte Vakuum auf die Schaltfläche Entlüftung, um die Mikroskopkammer zu entlüften. Wählen Sie dann "Werkzeuge", "Gehe zu Bedienfeld" und öffnen Sie das Bedienfeld "Bühnenpunktliste". Wählen Sie die Position CRYO EXCHANGE, um den Tisch auf die richtigen Koordinaten für die Aufnahme des Probenhalters zu bringen.

Öffnen Sie mit einem sauberen Paar Handschuhen die Probenkammer und setzen Sie den Kryotisch auf den Haupttisch des Mikroskops ein. Schließen Sie die Kammer und klicken Sie auf der Registerkarte Vakuum auf die Schaltfläche Pumpe. Kühlen Sie anschließend das Mikroskop, indem Sie das Mikroskop mit flüssigem Stickstoff füllen.

Sobald die Temperatur des Tisches unter minus 120 Grad Celsius fällt, aktivieren Sie die Wärmefunktion an der Kryo-Transfereinheit, um den Tisch auf minus 120 Grad Celsius zu erwärmen. Befestigen Sie nun das Kryo-Transfer-Shuttle am Mikroskop und übertragen Sie den Probenhalter mit Hilfe des Einzieharms in den Kryotisch des Mikroskops. Bewegen Sie den Probenhalter mit dem Joystick vorsichtig in die Nähe der Objektivlinse.

Wählen Sie auf der Registerkarte Blenden die 10-Mikron-Blende aus. Doppelklicken Sie dann auf der Registerkarte "Geschütz" auf das Feld "EHT-Ziel", geben Sie 10 Kilovolt als EHT-Ziel ein, und klicken Sie auf "OK". Um dann die Beschleunigungsspannung zu aktivieren, klicken Sie auf die untere Registerkarte EHT und wählen Sie EHT On.In Registerkarte Detektoren die Option InLens aus der Dropdown-Liste aus. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Scannen und wählen Sie eine Scangeschwindigkeit gleich eins, d. h. einen schnellen Scan, um Strahlschäden zu minimieren, und eine Speicherauflösung von 1024 x 768 Pixeln.

Wählen Sie in der Dropdown-Liste Rauschunterdrückung die Option Liniendurchschnitt aus und passen Sie den Wert von n bis 20 bis 30 Zeilen für die Suche an. Klicken Sie dann auf die Tastenkombination "ctrl" und "Tabulatortaste" auf der Tastatur und verwenden Sie die Mittelpunktfunktion, um das Sample in die gewünschten Bereiche zu verschieben und gleichzeitig zu vergrößern, um Bereiche mit gebrochenen Zellen zu identifizieren. Nachdem Sie Regionen mit frakturierten Zellen identifiziert haben, scannen Sie die Probe während der Vergrößerung, um einen frakturierten Chloroplasten zu finden.

Ändern Sie dann den durchschnittlichen n-Wert der Linie auf mehr als 100, um das Rauschen zu reduzieren. Drücken Sie auf der Registerkarte Scannen die Taste Einfrieren, um den Scanvorgang zu stoppen. Durch Drücken der Strg-Umschalttaste auf der Tastatur wird die Center-Feature-Funktion verwendet, um in interessante Chloroplasten-Frakturflächen zu zoomen. und Bilder mit hoher Vergrößerung werden mit den gleichen Parametern wie zuvor aufgenommen.

Drücken Sie abschließend die Schaltfläche TIFF speichern, um das Bild zu speichern. Führen Sie eine Bildanalyse gemäß dem Textprotokoll durch. Diese Abbildung zeigt ein Kryo-REM-Bild eines Blutplättchens, das ein unter hohem Druck gefrorenes, gefrierfrakturiertes Craterostigma Pumilum-Blattstück mit einer großen Region von gebrochenen Zellen enthält.

In diesem Beispiel fehlt das Blattstück; Es blieb jedoch etwas Blattgewebe übrig, das an den Messerrillen auf dem Blutplättchen haftete. Nachdem eine erfolgreiche Fraktur gefunden wurde, werden Bilder von Zellen mit geringer Vergrößerung aufgenommen, um interessante Regionen, wie z. B. frakturierte Chloroplasten, zu identifizieren. Bilder von einfach gebrochenen Chloroplasten werden aufgenommen, um Frakturflächen der Thylakoidmembran zu identifizieren.

In diesem Beispiel ist ein stark vergrößertes Bild von Thylakoidmembranen in C.Pumilum-Blättern zu sehen. Dabei können die vier verschiedenen Bruchflächen unterschieden werden. Die exoplasmatischen Frakturflächen von gestapelten und ungestapelten Membranen, EFs bzw. EFu, und die protoplasmatischen Flächen von gestapelten und ungestapelten Membranen, PFs bzw. PFu.

Photosystem II oder PS2 befindet sich sowohl in den gestapelten Grana-Membranregionen von EFs als auch in den EFu-Stromalamellar-Membranregionen. Wenn hydratisiert wird, ist die PS2-Dichte in den EFs etwa dreimal höher als in der EFu, was die beiden Flächen unterscheidet. Während der Dehydrierung von C.Pumilum nimmt die Dichte von PS2 in den EFs allmählich ab und erreicht unter hydratisierten Bedingungen etwa die Hälfte ihrer Dichte.

Bemerkenswert ist, dass sich PS2-Komplexe bei weiterer Dehydrierung auf fünf bis 10 % relativen Wassergehalt in Reihen und Arrays organisieren. Die Entwicklung der Gefrierfraktur-Replikationstechnik ebnete den Weg für die Untersuchung der Größe von Membranproteinkomplexen und ihrer Anordnung innerhalb biologischer Membranen. Die Kombination von Gefrierfraktur und Hochdruckgefrieren im Kryo-REM ermöglicht die Untersuchung verschiedener Arten von Proben auf verschiedenen Größenskalen, von der Gewebe- und Zellebene bis hinunter zur makromolekularen Ebene in einem nahezu nativen Zustand.

Neben der hier gezeigten Technik können auch Methoden wie die energiedispersive Röntgenspektroskopie, EDS, im Kryo-REM angewendet werden; Zum Beispiel zur Alkalisierung von Biomineralien.