Strategien zur Optimierung der Datenerfassung in der Kryoelektronentomographie
March 19th, 2021
Die steigende Nachfrage nach großflächiger Datenerfassung in der kryogenen Elektronentomographie erfordert Bilderfassungsroutinen mit hohem Durchsatz. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die jüngsten Entwicklungen fortschrittlicher Akquisitionsstrategien implementiert, die darauf abzielen, die Zeiteffizienz und den Durchsatz der tomographischen Datenerfassung zu maximieren.
Der Aufbau einer groß angelegten Datenerfassungssitzung ist ein zeitaufwändiges Verfahren, das die verbleibende Mikroskopzeit, die für die Erfassung von Neigungsreihen zur Verfügung steht, erheblich reduzieren kann. Diese Methode ermöglicht den schnellen Aufbau einer groß angelegten automatisierten Tomographie-Datenerfassung, um die Zeiteffizienz von Tomographie-Experimenten zu maximieren, die eine sorgfältige Auswahl der Erfassungsziele erfordern. Öffnen Sie zunächst eine SerialEM-Dummy-Instanz.
Sobald das erste Rasterquadrat zugeordnet ist, verwenden Sie die SerialEM-Navigator-Menüoption Merge, um die Montage in der SerialEM-Dummy-Instanz anzuzeigen. Doppelklicken Sie auf das Navigatorfenster, um die quadratische Rasterkarte zu öffnen. Durchsuchen Sie die Karte und verwenden Sie die Dummy-SerialEM-Navigatoroption Punkte hinzufügen, um Bilderfassungspunkte auf dem gewünschten Ziel hinzuzufügen.
Nachdem Sie die neuen Quadrate zugeordnet haben, speichern Sie die Navigatordatei und führen Sie den Navigator erneut zusammen. Fahren Sie fort, bis alle Rasterquadrate zugeordnet sind. Führen Sie die Navigatordatei erneut mit der SerialEM-Dummy-Instanz zusammen.
Führen Sie das Pi EM Virtual Maps-Skript über das Dummy-SerialEM-Menü aus. Wählen Sie Werkzeuge und virtuelle Ankerkarten aus. Dies kann je nach Größe und Menge der Rasterquadratkarten sowie dem Binning der Ansichts- und Vorschaukarten einige Zeit in Anspruch nehmen.
Um die richtige Mikroskopleistung zu gewährleisten, verwenden Sie die gleiche Vergrößerung und Strahlgröße für die Datenerfassung in der folgenden Reihenfolge. Führen Sie serialEM komafreie Ausrichtung per CTF aus. Setzen Sie eine Objektivblende ein und zentrieren Sie sie.
Führen Sie SerialEM korrekten Astigmatismus durch CTF und GIF Quick Tune aus. Öffnen Sie in SerialEM die neue Navigatordatei. Deaktivieren Sie alle A-Punkte.
Wählen Sie die Karten der ersten Ansicht aus. Wählen Sie Reduzieren aus. Klicken Sie zweimal auf A und deaktivieren Sie den Ausklappen.
Wählen Sie die erste Kartenposition aus. Drücken Sie Die Umschalttaste T, wählen Sie dann die letzte Kartenposition der Ansicht aus, und drücken Sie erneut die Umschalttaste T. Wählen Sie Einzelbildbilder in den Eigenschaften der Datei aus, um ein Dialogfeld zu öffnen.
Wählen Sie im nächsten Dateieigenschaftendialog die gewünschten Parameter entsprechend den Bildgebungsanforderungen und dem Geräteaufbau aus. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie einen Namen mit einer Nummer ein und klicken Sie auf Speichern. Richten Sie den Controller der Tilt-Serie für die erste TS-Position ein.
Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf OK, um diese Parameter für alle Neigungsreihen nach diesem Erfassungselement festzulegen. Alle Vorschaukarten werden nun als TS mit einem nummerierten Dateinamen ausgewählt. Legen Sie bei Bedarf die Fokus-/Spurentfernung für jedes Ziel fest.
Doppelklicken Sie auf die Ansichtskarte, um sie zu laden. Wählen Sie die Vorschaukarte in der Navigatorliste aus. Wählen Sie dann im Navigatorfenster Bearbeitungsfokus aus.
Deaktivieren Sie im Niedrigdosis-Bedienfeld die Drehachse zwischen den Bereichen, um den Versuch zu positionieren und entlang der Neigungsachse der Bühne zu fokussieren. Klicken Sie auf den gewünschten Bereich in der geladenen Ansichtskarte, um die Fokus-Testposition für diese Neigungsserie festzulegen und sicherzustellen, dass für das Navigatorelement TSP eingestellt ist. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Elemente.
Bearbeiten Sie den Fokusbereich im Skript PreTomo, das vor jeder Neigungsreihe ausgeführt wird. Aktivieren Sie im Menü SerialEM-Neigungsreihe die Option Skript in TS ausführen, und wählen Sie die Skriptnummer des DuringTomo-Skripts während jeder Neigung aus. Überprüfen Sie den Stickstofftankfüllstand und ob der Autolader-Turbo ausgeschaltet ist.
Überprüfen Sie den freien Speicherplatz im Datenspeicher. Deaktivieren Sie im Menü SerialEM-Datei die Option kontinuierliches Speichern für die Protokolldatei. Jede Tilt-Serie erhält eine eigene Protokolldatei.
Nachdem Sie im Navigationsmenü auf Elemente erwerben geklickt haben, führen Sie das Skript PreTomo aus. Wählen Sie primäre Task-Acquire Tilt-Serie und dann Run script nach PostTomo aus. Wählen Sie am Ende Säulenventile schließen und senden Sie am Ende eine E-Mail, dann klicken Sie auf Los.
71 geeignete Quadrate wurden auf der Rasterkarte bei geringerer Vergrößerung ausgewählt. Karten mit mittlerer Vergrößerung wurden mit Einstellungen erfasst, die eine direkte Visualisierung und Identifizierung der interessierende Probe, in diesem Fall Coronaviren, ermöglichen. Die Erfassungszeit betrug drei Minuten pro Quadrat, drei Stunden und insgesamt 45 Minuten.
Als die erste quadratische Karte erstellt wurde, wurde eine Dummy-SerialEM-Instanz auf einem separaten Computer geöffnet, um die quadratische Karte zu visualisieren und Punkte auf Zielen hinzuzufügen, die für die Erfassung von Neigungsserien geeignet sind. SerialEM Low Dose wurde eingerichtet und Referenzansichts- und Vorschaubilder wurden aufgenommen und als Karten gespeichert. Letztere Maps könnten dann sofort auf der Dummy-SerialEM-Instanz verwendet werden, um die virtuelle Ansicht und die virtuelle Vorschau aus den entsprechenden quadratischen Kartenbildern zu generieren.
Die virtuellen Ansichtskarten wurden für eine anfängliche Zentrierung des Ziels verwendet, gefolgt von einer abschließenden Zentrierung, die bei der tatsächlichen Vergrößerung der Neigungsreihe mithilfe der virtuellen Vorschaukarte durchgeführt wurde. Nutzer sollten sich ausreichend Zeit nehmen, um die Musterlandschaft zu erkunden. Nachdem man einige Karten durchsucht hat, entwickelt man ein besseres Gefühl für qualitativ hochwertige Gebiete, aus denen daten gesammelt werden können.
Überblick
Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, das entwickelt wurde, um die Effizienz der kryogenen Elektronentomographie zu verbessern und den Bedarf an großflächiger Datenerfassung zu adressieren. Die Methode konzentriert sich auf die Optimierung der Bildgebungseinrichtung, um einen hohen Durchsatz während der Neigungsreihenerwerbung sicherzustellen und die Mikroskopnutzung erheblich zu verbessern.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Kryogene Elektronentomographie
- Hochdurchsatz-Bilderfassung
- Mikroskopietechniken
Hintergrund
- Steigende Nachfrage nach großflächiger Datenerfassung
- Zeitaufwendige Einrichtungen können die effektive Mikroskopzeit einschränken
- Bedeutung effizienter tomographischer Datenerfassungsmethoden
Verwendete Methoden
- Protokoll für automatisierte Tomographiedatenerfassung
- Nutzung von SerialEM für die Navigation der Gitterquadratzuordnung
- Implementierung virtueller Karten für die Zentrierung des Ziels
Hauptergebnisse
- 71 Gitterquadrate wurden für die Datenerfassung identifiziert
- Effiziente Datenerfassung mit einer Gesamterfassungszeit von 3 Stunden und 45 Minuten
- Nachgewiesene Fähigkeit, Coronavirus-Proben effektiv zu visualisieren
Schlussfolgerungen
- Diese Studie veranschaulicht einen optimierten Ansatz für hochdurchsatzige Bildgebung in der Tomographie
- Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Maximierung der Erfassungseffizienz in der biologischen Forschung
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Efficient cryogenic electron tomography (cryoET) data acquisition is critical for high-resolution structural biology, enabling rapid and reproducible 3D analysis of macromolecular complexes. Automated workflows using SerialEM and PyEM streamline grid mapping and target selection, maximizing microscope utilization and reducing operational bottlenecks. These advances directly impact early discovery and structural validation pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates structural interrogation of biological assemblies in near-native states.
- Supports functional target validation by enabling high-throughput acquisition of tilt series.
- Improves predictive confidence in macromolecular complex analysis for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Enables preparation of validated 3D structural datasets for downstream screening workflows.
- Standardizes acquisition routines, enhancing reproducibility and quantitative output quality.
- Facilitates scalable, automated data collection for reliable compound evaluation platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data acquisition with disease-relevant systems, such as viral particles.
- Ensures continuity from discovery-stage imaging to preclinical structural validation.
- Reduces risk in translational research by supporting robust, high-throughput data generation.
Pipeline & Workflow Integration
This automated cryoET workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting structural hypothesis testing and target de-risking.
- Discovery Biology: Enables rapid hypothesis testing and pathway clarification via high-resolution 3D imaging.
- Screening: Provides reproducible, quantitative tilt series datasets for assay readiness.
- Analytics: Delivers standardized measurements and readouts for comparative structural analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when imaging disease-relevant complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for automated tomography data acquisition across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of data acquisition sessions.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by maximizing instrument time.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM instrumentation and data analysis software.
- Depends on access to high-end transmission electron microscopes and computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters and data management practices.
- May require adaptation for different sample types or grid formats.
- Operational limitations include manual input for initial target selection and quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Selecting the Targets
1:31
Generate Virtual Maps
2:07
Microscope Tuning
2:43
Set up Navigator
4:05
Set the Focus/Track Positions
5:00
Set up Additional Scripts
5:27
Run
6:19
Results: Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition
7:46
Conclusion
