Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Axonausrichtung und Myelinisierung von Neuronen der Spinalganglien unter Verwendung eines statischen, vorgedehnten Zellkultursystems zu verbessern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Nervengewebe-Engineerings zu beantworten, wie z. B. die Axonausrichtung und das Dickenwachstum. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass diese vorgedehnte Methode nicht nur die Axonausrichtung verbessert, sondern auch die Myelinisierung fördert.

Um diesen Vorgang zu starten, gießen Sie die Mischung aus Base und Härtungsmittel in eine Gewebekulturschale. Halten Sie die Gelmischung 20 Minuten lang unter Vakuum, um Luftblasen zu entfernen. Gib dann die Gelmischung bei 60 Grad Celsius in den Ofen, um sie über Nacht auszuhärten.

Nachdem die PDMS-Membran ausgehärtet ist, behandeln Sie die Oberfläche drei Minuten lang mit Sauerstoffplasma in der Plasmareinigungs- und Ätzanlage. Schneiden Sie anschließend ein Stück rechteckige Membran aus der Form ab. Befestigen Sie es mit der sauerstoffbehandelten Seite nach oben auf einem Spannrahmen.

Stellen Sie dann den Rahmen auf einen Strecktisch und dehnen Sie ihn gleichmäßig, indem Sie den Knopf auf dem Tisch drehen, bis er in der Längsachse eine Dehnung von 10 % erreicht. Fixieren Sie als Nächstes die Dehnung, indem Sie die Schrauben am Rahmen festziehen. Entfernen Sie danach den Rahmen von der Bühne.

Stellen Sie sicher, dass die Membranoberfläche trocken und staubfrei ist, bevor Sie eine Silikonkammer auf die Membran aufsetzen. Lassen Sie die klebrige Seite der Kammer fest an der Membran haften. Anschließend die Oberfläche 10 Minuten lang mit UV sterilisieren.

Geben Sie anschließend innerhalb von sechs Stunden nach der Plasmabehandlung einen Milliliter PLL auf die PDMS-Oberfläche in der Kammer. Inkubieren Sie es anschließend zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die DRG-Neuronen aussäen, um die Zellanhaftung zu verbessern. Bereiten Sie in diesem Schritt das Standard-Wachstumsmedium für die DRG-Neuronen vor.

Autoklavieren Sie vor der Isolierung die Isolationsausrüstung und die Filterreagenzien. Geben Sie fünf Milliliter Isolationspuffer in eine Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen und stellen Sie die Platte auf Eis. Bereiten Sie dann 10 Milliliter Dissoziationsmedium vor, indem Sie einen Milliliter Kollagenase A zu neun Millilitern 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen.

Die Lösung mit einem 0,22-Mikrometer-Filter filtrieren und auf Eis legen. Opfern Sie danach 10 bis 12 fünf bis sieben Tage alte SD-Ratten und schneiden Sie die Haut über dem Rückenmark von der Rückseite jeder einzelnen ab. Entferne überschüssiges Gewebe um die Wirbelsäule.

Machen Sie unter einer chirurgischen Lupe den ersten Schnitt vom Hals aus und machen Sie dann mit einer Schere einen Schnitt entlang der Wirbelsäule auf beiden Seiten. Löse die Wirbelsäule vom Körper des Welpen und entferne überschüssige Muskeln. Schneiden Sie dann entlang der Längsachse der Wirbelsäule und öffnen Sie die Wirbelsäule mit einer Pinzette vollständig, um das Rückenmark zu extrahieren.

Entfernen Sie als Nächstes das Ganglion aus der Knochentasche. Schneiden Sie die Nervenwurzeln ab und übertragen Sie die Ganglien in den eiskalten Isolationspuffer. Sammle ca. 10 bis 16 DRGs von beiden Seiten.

Wiederholen Sie den Präpariervorgang für den Rest der Welpen. Übertragen Sie nun die DRGs mit Isolationspuffer in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie das Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen und entfernen Sie vorsichtig den Isolationspuffer oben.

Geben Sie dann 10 Milliliter Dissoziationsmedium in das Röhrchen. Inkubieren Sie das präparierte Gewebe im Dissoziationsmedium in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad für eine Stunde, während Sie das Röhrchen alle fünf bis 10 Minuten schütteln. Nach der chemischen Dissoziation zentrifugieren Sie die Ganglien fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie nach fünf Minuten den Überstand, suspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern Standard-Wachstumsmedium und wirbeln Sie es ein. Zentrifugieren Sie anschließend die dissoziierten Zellen erneut. Entfernen Sie dann den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 12 Millilitern Standard-Wachstumsmedium und wirbeln Sie es ein.

Entfernen Sie vor dem Aussäen der Zellen die PLL-Lösung aus der Kammer. Spülen Sie die PDMS-Oberfläche mit sterilem Wasser ab und trocknen Sie sie an der Luft. Lassen Sie die Suspension nach dem Resuspendieren der Zellen ein bis zwei Minuten einwirken, damit sich die Ablagerungen am Boden des Röhrchens absetzen können.

Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter Zellsuspension in jede gedehnte Kammer und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2. Um Gliazellen an einem Tag in vitro zu eliminieren, geben Sie 10 Mikroliter oder 15 Mikroliter der FDU-U-Mischlösung in jede Vertiefung. Ersetzen Sie dieses Medium nach sieben Stunden durch frisches Standard-Wachstumsmedium und stellen Sie das vorgedehnte Kulturgerät in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2.

Wechseln Sie während der Zellkulturphase das Medium, indem Sie die Hälfte des verbrauchten Mediums durch frisches Medium ersetzen. Bei diesem Verfahren wird das Nährmedium von den Schwann-Zellen entfernt und fünf Milliliter 0,05 %Trypsin-EDTA in den Kolben gegeben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% CO2 für zwei bis drei Minuten.

Überprüfen Sie die Zellen unter dem optischen Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv, um zu sehen, ob sie sich aus dem Kolben abheben. Geben Sie dann fünf Milliliter Kulturmedium zu den Zellen in den Kolben und mischen Sie. Geben Sie anschließend die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 20 Grad Celsius.

Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in sieben Millilitern Standard-DRG-Wachstumsmedium. Anschließend werden 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Mischen Sie es mit 10 Mikrolitern Trypanblau und zählen Sie dann die Zellzahl mit einem Hämozytometer unter Verwendung eines 10X-Objektivs.

Fügen Sie das DRG-Wachstumsmedium hinzu, um die Zellsuspension auf 5.000 Zellen pro Milliliter zu verdünnen. Nehmen Sie anschließend 0,5 Milliliter des Mediums aus der DRG-Kultur in der gestreckten Kammer und geben Sie 0,5 Milliliter Schwann-Zellsuspension in die DRG-Kultur. Kultivieren Sie die Zellen eine Woche lang bei 37 Grad Celsius in 5% CO2.

Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, indem Sie die Hälfte des verbrauchten Mediums durch frisches Standard-Wachstumsmedium ersetzen. Nach zweiwöchiger Kultivierung auf den gedehnten und ungehnten Oberflächen wurden gereinigte Schwann-Zellen in die Kammer gegeben und eine weitere Woche lang kultiviert. Hier ist die Beta-III-Tubulin-Färbung für Axone auf der gestreckten Oberfläche zu sehen.

Und das ist die Überlagerung von Beta-III-Tubulin und P0-Färbung auf der gestreckten Oberfläche, was darauf hindeutet, dass die Schwann-Zellen an die Axone gebunden sind und diese wahrscheinlich myelinisieren. Dieses Bild zeigt die Beta-III-Tubulin-Färbung für Axone auf der ungehnten Oberfläche. Und die Überlagerung von Beta-III-Tubulin- und P0-Färbung auf der ungehnten Oberfläche deutet darauf hin, dass die Schwann-Zellen nicht an die Axone gebunden sind.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die PDMS-Membran flach und von homogener Dicke zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können Zerstäuber wie vorgedehnte Mikrokanäle durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Migration der Axonlinse und der Schwann-Zellen zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Tissue Engineering ebnen, um die Rolle der Oberflächenanisotropie bei der Nervenregeneration im Rückenmark und im Ischiasnerv zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Axonausrichtung und Myelinisierung mit einem vorgedehnten Gerät induzieren können.