Name: Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von DRG-Neuronen aus Ratten und deren Kultur auf einem statischen vorgespannten System zur Verbesserung der Axonausrichtung und Myelinisierung durch Ko-Kultur mit Schwann-Zellen.

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Die Autoren möchten sich Eric Vasco für seine Unterstützung bei der Vorbereitung der PDMS-Substrate, Dr. Shiyong Wang in Dr. Marina Mata Labor an der University of Michigan für hilfreiche Anregungen und Ausbildung des DRG-Isolation und Dr. Mark Tuszynski und Dr. danken W. Marie Campana an der UC San Diego. für hilfreiche Anregungen und das Protokoll für die SC-Isolation. Diese Studie wurde teilweise von der National Science Foundation (CBET 0.941.055 und CBET 1.510.895), das National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866 und R01EB014986) unterstützt.

Alle Verfahren zur Isolierung der Zellen wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Michigan State University genehmigt. 1. Herstellung von vorgespannter anisotroper Oberfläche <ol><li> Mischen Sie eine 10: 1-Lösung von Base und Härter und gießen Sie die Mischung in eine Gewebekulturschale (12 cm Durchmesser). Verwenden Sie 4.900 mg Base und 490 mg Mittel für die gesamte Vernetzungs Mischung härtet. </li><li> Halten Sie die Gelmischung unter Vakuum für 20 min Luftblasen zu entfernen. </li><li> Legen Sie das Gel-Gemisch in dem Ofen über Nacht Aushärtung bei 60 ° C. </li><li> Nachdem die Membran aushärtet PDMS, Behandlung der Oberfläche mit Sauerstoffplasma eine Plasmareinigung / Ätzsystem für 3 min bei 165 mTorr und 65 sccm Fluss von O 2 verwendet wird . </li><li> Schneiden Sie ein Stück von rechteckigen Membran (5 × 3,5 cm) von der Schale, während bewusst zu sein, welche Seite mit Sauerstoff behandelt wird, stellen Sie sicher, dass der Sauerstoff behandelte Seite nach oben zeigt und fixieren auf einem Spannrahmen. Platzieren Sie den Rahmen auf ein<html> durch Drehen des Knopfes auf der Bühne Streckstufe und gleichmäßig dehnen , bis sie 10% Dehnung erreicht (oder eine andere vorgegebene Strecke, kann die Dehnung direkt von der Streckstufe gelesen werden) in der längeren Achse 9. Befestigen Sie die Strecke durch die Schrauben am Rahmen befestigen. </li><li> Entfernen Sie den Rahmen von der Bühne. Sicherstellen, dass die Membran-Oberfläche ist trocken und frei von Staub, legen Sie dann eine Silikonkammer auf die Membran der klebrigen Seite der Kammer können an die Membran zu befestigen fest. Hinweis: Die Silikon-Kammer bietet eine gut zum Halten des Zellmedium auf der PDMS-Membran. Die Vorrichtung ist in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Sterilisieren der Oberfläche mit UV für 10 min. </li><li> 1 ml Poly-L-lysin (PLL) (0,01% in phosphatgepufferter Salzlösung) mit der PDMS-Oberfläche innerhalb der Kammer, innerhalb von 6 Stunden der Plasmabehandlung und Inkubation für 2 h bei 37 ° C, bevor die DRG Neurone Animpfen. Dies fördert die Zellhaftung. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Die Isolierung von DRG <ol><li> Bereiten Sie Standard-Wachstumsmedium für die DRG-Neuronen. </li><li> Vor der Isolierung, autoklaviert die Isolations Ausrüstung und Filter Reagenzien. 5 ml Isolationspuffer in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, und legen Sie die Platte auf Eis. Herstellung von 10 ml der Dissoziation Medium durch 1 ml Kollagenase A Zugabe (500 U / ml) zu 9 ml von 0,05% Trypsin-EDTA (1 mg / ml), filtriert die Lösung mit einem 0,22 um-Filter und auf Eis. </li><li> Verwenden Sie zehn bis zwölf fähig 5 - 7 Tage alten Sprague-Dawley Ratten für die Isolierung. Sprühen Sie die Welpen mit 75% Isopropanol und opfern durch Enthauptung. </li><li> Schneiden Sie die Haut über dem Rückenmark von hinten weg und entfernen Sie das überschüssige Gewebe rund um die Wirbelsäule. Unter einem chirurgischen Lupe mit den chirurgischen Scheinwerfer auf, machen den ersten Schnitt aus dem Hals und dann ein Schnitt entlang der Wirbelsäule auf beiden Seiten mit einer Schere. Nehmen Sie die Wirbelsäule aus dem Körper der Welpen und die überschüssigen Muskeln zu entfernen. Dann mit einer Schere entlang der lon zu schneideng Achse der Wirbelsäule und mit Hilfe einer Pinzette die Wirbelsäule vollständig zu öffnen und das Rücken cord.Remove die Spitze aus einer Pipette extrahieren, um eine größere Öffnung für die Übertragung der DRGs mit Isolationspuffer in ein steriles 15 ml Tube. </li><li> Mit einem feinen Pinzette, entfernen Sie das Ganglion aus dem Knochentasche und sammeln etwa 10-16 DRG von beiden Seiten. Schneiden Sie die Nervenwurzeln und übertragen die Ganglien auf dem eiskalten Isolationspuffer. </li><li> Die Spitze aus einer Pipette eine größere Öffnung für die Übertragung der DRGs mit Isolationspuffer in ein steriles 15 ml Tube. Nach der chemischen Dissoziation Zentrifuge die ganglia bei 900 xg und 4 ° C für 5 min. </li><li> Lassen Sie das Gewebe an der Unterseite des Rohres absetzen und sanft den Isolationspuffer oben entfernen und 10 ml Dissoziation Medium in das Röhrchen hinzufügen. </li><li> Inkubieren Sie die sezierten Gewebe im Dissoziation Medium in einem Wasserbad 37 ° C 1 Stunde für während der Schlauch alle 5 Schütteln - mindestens 10. </li><li> Nachdie chemische Dissoziation, zentrifugieren Sie das ganglia bei 900 xg und 4 ° C für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Standardwachstumsmedien und Wirbel. </li><li> Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen, wie in Abschnitt 2.9 noch einmal angezeigt. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 12 ml Standardwachstumsmedien und Wirbel. </li></ol> 3. Kultur der DRG auf vorgespannter Fläche <ol><li> Vor der Zellen Aussaat, die PLL-Lösungen aus der Kammer zu entfernen und die PDMS-Oberfläche mit sterilem Wasser und der Luft trocknen zu spülen. </li><li> Nachdem die Zellen wieder suspendiert, lassen Sie die Suspension Set mit 1 - 2 Minuten die Trümmer zu ermöglichen, auf den Boden des Röhrchens zu begleichen. 1,5 ml der Zellsuspension in jede Streckkammer und Inkubieren bei 37 ° C bei 5% CO 2. </li><li> Gliazellen, die am 1. Tag in vitro (DIV), mit 10 &amp; mgr; l (oder 15 &amp; mgr; l) Mischung aus Fluor-2-deoxy Uridin und Uridin (FDU-U) Lager soluti Zur Beseitigungauf (siehe Tabelle der Materialien) zu gut jeder. Nach 7 Stunden, ersetzen Sie dieses Medium mit frischem Standardwachstumsmedium und legen Sie die vorgestreckten Kulturvorrichtung in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Während der Zellkulturperiode (2 - 3 Wochen), ändern Sie die Medien alle zwei Tage um die Hälfte des verbrauchten Medium durch frisches Medium ersetzt. Anmerkung: Nach Kultivierung auf den gedehnten und ungedehnten Flächen für 2 Wochen, gereinigt SCs werden zu der Kammer und eine weitere Woche kultiviert (Schritt 4.7). </li></ol> 4. Co-Kultur von Schwann-Zellen (SC) mit DRG Neurone auf vorgespannter Fläche <ol><li> Isolieren SCs wie von Dr. Campana Gruppe zuvor 15 beschrieben. <ol><li> Kurz gesagt, die SCs aus einem 1 Tage alten Welpen zu isolieren. Sammeln und die Ischiasnerven distanzieren sowohl chemisch (Trypsin-EDTA und Kollagenase A) und mechanisch (18 - Gauge - Nadel / 10 - ml - Spritze) 15. </li><li> Seed die dissoziierten Zellen in Poly-D-Lysin (PDL) coated T25 - Kolben und die Kultur bei 37 ° C bei 5% CO 2. Am 5. Tag reinigen die Zellen durch Antikörper Auswahl Anti-thy 1,1 Antikörper und Kaninchen-Complement verwenden und die gereinigten Zellen Passage 2 Subkultur - 4. Verwenden Kulturmedium, das Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% fötalem Rinderserum (FBS) , 1% Penicillin / Streptomycin (Penn / Strep), 21 &amp; mgr; g / ml Rinderhypophysenextrakt (BPE) und 4 &amp; mgr; M Forskolin. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium aus der SCs und 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA in den Kolben. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C bei 5% CO 2 für 2 - 3 min. </li><li> Überprüfen Zellen unter dem Lichtmikroskop ein 10X-Objektiv verwendet, um zu sehen, ob sie aus dem Kolben heben, fügen Sie dann 5 ml Kulturmedium und mischen sich mit den Zellen in den Kolben. </li><li> Fügen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei 200 xg und 20 ° C für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 7 ml Standard-DRG Wachstum media. </li><li> Nehmen Sie sich 10 ul Zellsuspension in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, mischen mit 10 ul Trypanblau und dann auf die Zellzahl bestimmen eine Hämozytometer unter der optischen Mikroskopie unter Verwendung eines 10X-Objektiv verwendet wird. Verdünne die Zellsuspension zu 5000 Zellen pro ml durch DRG Wachstumsmedium hinzugefügt wird. </li><li> Entfernen Sie 0,5 ml Medium aus der DRG-Kultur in der gestreckten Kammer und mit 0,5 ml SC Suspension auf die DRG-Kultur. </li><li> Kultur die Zellen für 1 Woche bei 37 ° C und 5% CO 2. Ändern Sie die Medien alle zwei Tage nach der DRG die Hälfte des verbrauchten Mediums mit frischem Standardwachstumsmedium ersetzt. Nach 1 Woche Co-Kultur, verarbeiten die Zellen durch Immunhistochemie 10. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Zur Induktion Axon Ausrichtung auf vorgedehnte Oberfläche gibt es zwei wichtige Schritte: 1) die PDMS-Membran muss flach sein und homogener Dicke; und 2) Gliazellen müssen aus dem DRG entfernt werden. Nach dem Mischen in einem Ofen die PDMS und Vernetzer und der Härtung sollte das vernetzte PDMS Gel sorgfältig ein Verkanten zu vermeiden, auf einer flachen Tischplatte und behandelt gehalten werden. Die Sauerstoffplasmabehandlung der PDMS Membran sollte innerhalb von 6 h von PLL-Beschichtung eingehalten werden, da die Hyd...

In Nervenverletzungen sind die proximalen und distalen Nervenstümpfe oft von der direkten Neuausrichtung Nervenfaszikel verhindert aufgrund der Läsionsstelle 1-2. Normalerweise werden Axon Striche hoch geordnete und ausgerichtete Bündel von Axonen zusammen, die komplexe Netzwerke von Konnektivität bilden. Allerdings ist die Nervenregeneration ein chaotischer Prozess wegen schlecht organisiert Axon Ausrichtung 3-4. Um daher eine ausreichende Anzahl von regenerierenden Axonen zu erzeugen, das der Läsionsstelle brücken, ist es notwendig, gut organisierte axonalen Ausrichtung zu induzieren. Darüber hinaus begleitet Demyelinisierung Nervenverletzungen durch Tod der myelinisierende Zellen an der Verletzungsstelle. Da Demyelinisierung stark beeinträchtigt die leitende Kapazität Axone zu überleben, Behandlungen Targeting Demyelinisierung oder Remyelinisierung fördern sind bedeutsam für die funktionelle Erholung nach einer Nervenverletzung 5. So ist das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Engineering-Ansatz zu verdeutlichen, die diese beiden Fragen behandeltder Nervenregeneration. Oberflächenanisotropie, die als Differenz definiert, wenn sie entlang verschiedenen Achsen gemessen, in einem Material der physikalischen oder mechanischen Eigenschaften, wurde angewendet Zellausrichtung zu beeinflussen, das Wachstum und die Migration 6-7. Neben Topographie, gibt es andere Methoden Anisotropie zu induzieren. Bisher untersuchten wir Oberflächenanisotropie durch mechanische statische Vorstreckung von Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) Membran induziert. Die Theorie der &quot;kleinen super Verformung auf großen auferlegt&quot; vorausgesagt , daß die effektive Steifigkeit der Zellen in der gedehnten Richtung erfassen von der senkrechten Richtung abweicht, und diese Differenz der effektiven Steifigkeit aufgrund Anisotropie 8 an die Oberfläche. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) , kultiviert auf einem vorgedehnten PDMS - Membran können die Anisotropie zu erfassen , indem aktiv die Oberfläche gezogen und als Ergebnis, richten in der vorgedehnten Richtung 9. In ähnlicher Weise eine anisotrope Oberflächen arising von einer mechanischen Oberflächenvorgedehnten wirkt sich auf die Ausrichtung, 10 Axone sowie das Wachstum und die Myelinisierung von dorsal root ganglion (DRG). Hier stellen wir ein Protokoll zur Induktion Oberflächenanisotropie auf einer statischen vorgedehnten PDMS Substrat 10 Axonregeneration zu verbessern. Zu axon Ausrichtung, topologische Merkmale mit gewünschten Mustern hervorzurufen, berichtet Kontaktführung durch die ausgerichteten Fasern zu schaffen und Kanäle 6,11-12 wurden nachgewiesen axon Ausrichtung 11,13 erleichtern. Jedoch zum Induzieren axon Ausrichtung durch topologische Merkmale Techniken berichtet, wie Fasern, Kanäle und Strukturieren, waren nicht imstande, zu verlängern und um die Dicke der Axone erhöhen. Im Gegensatz dazu Reckung mechanischen graduellen zu axon Ausrichtung in Dehnungsrichtung geführt mit längeren und dickeren Axone , die mit der Größe der Dehnung 14 erhöht. Jedoch ist eine angetriebene Motor Vorrichtung in vivo nicht enthältmöglich. Im Gegensatz dazu ist statisch vorgedehnten induzierte Anisotropie weniger kompliziert und leichter in Zukunft Gerüst Entwürfe für in vivo - Anwendungen integriert werden können. In diesem Protokoll wird eine statische vorgedehnten Zellkultursystem wird verwendet Oberflächenanisotropie ohne topologische Eigenschaften zu induzieren. Die vorgedehnten Kultursystem besteht aus einem PDMS-Membran zusammengesetzt ist, einem dehnbaren Rahmen und einer Streckstufe, wobei die Membran an dem Rahmen befestigt ist und eine vorbestimmte Strecke Größe auf der Streckstufe zugeführt wird. Frisch isolierte DRG auf der vorgedehnten Oberfläche kultivierten Neuronen für bis zu 21 Tage für axon Ausrichtung und Dicke überwacht. Anschließend Schwann-Zellen (SCs) co-kultiviert mit den ausgerichteten Axone werden Myelinisierung überwacht. Vorstreckung induzierte Oberflächenanisotropie Durch die Integration konnten wir Ausrichtung der Zellen-Differenzierung und Axon Ausrichtung Wachstum von MSCs und DRG - Neuronen 9-10 bzw. zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>Neurobasales Medium 1x</td><td>GibcoBRL</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement 50x</td><td>GibcoBRL</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I 100x</td><td>GibcoBRL</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Albumax-I</td><td>GibcoBRL</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>Nervenwachstumsfaktor-7S</td><td>Invitrogen</td><td>13290-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GibcoBRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA/1 mM EDTA</td><td>GibcoBRL</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Trevigen</td><td><a href="http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/">3438-100-01</a></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma</td><td>p-6407</td><td></td></tr><tr><td>Fluor-2-Desoxyuridin</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>Isolationspuffer</td></tr><tr><td>Typ I Kollagenase</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum-Hyklon</td><td></td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Clonetics</td><td>CC-4009</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344270</td><td></td></tr><tr><td>Silikonkammer</td><td>Greiner bio-one</td><td>FlexiPERM ConA</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Reinigungs-/Ätzsystem</td><td>March Instruments</td><td>PX-250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Thy 1.1 Antikörper</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>M7898</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Komplement</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S-7764</td><td></td></tr><tr><td>Standard Wachstumsmedium</td><td></td><td></td><td>Für 500 ml Neurobasales Medium 1x fügen Sie 10 ml B-27 50x, 5 ml Glutamax-I 100x, 2,5 ml Penicillin/Streptomycin (Penn/Streptomycin), 1 ml Albumax-I und 1 &mu; l von NGF-- 7S (50 &mu; g/ml).</td></tr><tr><td>FDU Uridin Stammlösung</td><td></td><td></td><td>FDU 100 mg in 10 ml ddH2O (10 mg/ml), in der Haube filtrieren und aufgeteilt in 500 μm; l aliquotiert und bei -20 μC lagern. Uridin 5 g in 166,7 ml ddH2O (33 mg/ml), in der Haube filtrieren, in 200 μm teilen; l aliquotiert und bei -20 °C lagern.
Nehmen Sie 61,5 &mu; l FDU (10 mg/ml) und 20,5 &mu; l Uridin (33 mg/ml) und fügen Sie 4.918 μm hinzu; l ddH2O zu einer endgültigen Stammkonzentration auffüllen, dann in 1 ml Aliquot dividieren und bei -20 μC lagern.</td></tr></tbody></table>

ein ansatz zur verbesserung der ausrichtung und myelinisierung von dorsalwurzelganglion neurons

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Die Axonregeneration ist ein chaotischer Prozess, der hauptsächlich auf eine unorganisierte Axonausrichtung zurückzuführen ist. Damit eine ausreichende Anzahl von regenerierten Axonen die Läsionsstelle überbrücken kann, ist daher eine gut organisierte axonale Ausrichtung erforderlich. Da die Demyelinisierung nach einer Nervenverletzung die Leitfähigkeit der überlebenden Axone stark beeinträchtigt, ist die Remyelinisierung entscheidend für das erfolgreiche Funktionieren der regenerierten Nerven. Zuvor haben wir gezeigt, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs), die sich auf einer vorgedehnten induzierten anisotropen Oberfläche ausrichten, da die Zellen eine größere effektive Steifigkeit in gestreckter Richtung als in senkrechter Richtung wahrnehmen können. Wir zeigten auch, dass eine anisotrope Oberfläche, die aus einer mechanisch vorgedehnten Oberfläche entsteht, die Ausrichtung sowie das Wachstum und die Myelinisierung von Axonen in ähnlicher Weise beeinflusst. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Präparation einer vorgedehnten anisotropen Oberfläche, die Isolierung und Kultivierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG) auf einer vorgedehnten Oberfläche zur Verfügung und zeigen das Myelinisierungsverhalten einer Co-Kultur von DRG-Neuronen mit Schwann-Zellen (SCs) auf einer vorgedehnten Oberfläche.

Die vorgedehnten Zellkultursystem DRG axon Ausrichtung gefördert 10. DRG-Neuronen wurden auf vorgestreckten und ungereckten Oberflächen für 12 Tage. Die Axone wurden für β-III-Tubulin gefärbt ihre Ausrichtung zu zeigen. 2 vergleicht axon Ausrichtung auf den vorgestreckten und ungestreckte PDMS Substrate nach 12 Tagen Kultur. Die DRG Axone parallel zur Streckrichtung ausgerichtet sind, während sie zufällige Ausrichtung zeigte und bildeten ein miteinander verbun...

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG), die aus Ratten isoliert wurden, und die Kultivierung von DRG-Neuronen auf einem statischen, vorgedehnten Zellkultursystem, um die Axonausrichtung zu verbessern, mit anschließender Co-Kultur von Schwann-Zellen (SCs), um die Myelinisierung zu fördern.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Ausrichtung der Axone und die Myelinisierung von Neuronen des Dorsalwurzelganglions mithilfe eines statischen, vorher gedehnten Zellkultursystems zu verbessern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Nervengewebes-Engineering zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Axonausrichtung und des Wachstums der Dicke. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die vorherige Dehnung nicht nur die Axonausrichtung verbessert, sondern auch die Myelinisierung fördert.Um dieses Verfahren zu beginnen, gießen Sie die Mischung aus Basis und Härter in eine Zellkulturschale. Halten Sie die Gel-Mischung 20 Minuten unter Vakuum, um Luftblasen zu entfernen. Anschließend stellen Sie die Gel-Mischung über Nacht zum Aushärten in den Ofen bei 60 Grad Celsius.Nachdem die PDMS-Membran ausgehärtet ist, behandeln Sie die Oberfläche drei Minuten lang im Plasma-Reinigungs- und Ätzsystem mit Sauerstoffplasma. Schneiden Sie anschließend ein rechteckiges Membranstück aus der Schale aus und befestigen Sie es mit der plasmabehandelten Seite nach oben auf einem Dehrrahmen.Platzieren Sie dann den Rahmen auf einer Dehnungsstufe und

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir die Technik der Herstellung und Aufrechterhaltung compartmented Kammern zur Kultivierung von sensorischen Neuronen der Spinalganglien.

Erstellung und Pflege von Spinalganglien Neuronen in Compartmented Kulturen

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

Das Video zeigt die Co-Kultivierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) mit Schwann-Zellen. DRG-Neuronen werden zunächst auf einer vorgedehnten Membran gezüchtet, um das Axonwachstum auszurichten. Dann werden Schwann-Zellen eingeführt, die sich an die Axone anheften, sie isolieren und das Überleben und die Funktion der Nervenzellen fördern.

Co-Kultur von Schwann-Zellen mit DRG-Neuronen auf einer vorgedehnten Membran

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Anreicherung von neuronalen Kulturen aus Spinalganglien durch Immunpanning, wodurch ihre Reinheit und ihr Nutzen für die neurologische Forschung verbessert werden.

Neuronale Anreicherung der Spinalganglien durch Immunpanning

Dieses Video zeigt das Coculturing-Modell eines Explantats aus dem Spinalwurzelganglion und Schwann-Zellen. Unter Kokulturbedingungen fördert Ascorbinsäure die Differenzierung von Schwann-Zellen in myelinisierende Formen. Myelinisierende Schwann-Zellen umhüllen die Axone mehrmals, um eine Myelinscheide zu bilden, die für die Nervenfunktion unerlässlich ist.

Co-Kultivierung eines Explantats eines Spinalganglien-Explantats mit Schwann-Zellen für die Myelinisierung von Neuronen

Quelle: Li, Q. et al. Untersuchung der Axonregeneration von Säugetieren: In vivo Elektroporation des Spinalwurzelganglion einer adulten Maus. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Elektroporations-vermittelte Transfektion von DRG-Neuronen der Maus zur Untersuchung der Axonregeneration. Es beschreibt die Schritte zur Verabreichung von Nukleinsäurekonstrukten an DRG-Neuronen, zur Induktion von Ischiasnervenverletzungen und zur Beurteilung der axonalen Regeneration.

Elektroporations-vermittelte Transfektion von Spinalganglien der Maus zur Förderung der revitalisierten Axon

Spinalganglien (DRG) sind Strukturen, die die sensorischen Neuronen des peripheren Nervensystems. Wenn distanziert, sie co-kultiviert mit SC-wie Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC) sein kann, eine wertvolle Modell zur in-vitro-Nervenregeneration und Myelinisierung zu untersuchen, imitiert die in vivo-Umgebung an der Verletzungsstelle.

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dieses Protokoll stellt die Verwendung einer Injektion eines dorsalen Wurzelganglions (DRG) mit einem viralen Vektor und einer gleichzeitigen Verletzung des dorsalen Wurzelquetsches bei einer erwachsenen Ratte als Modell zur Untersuchung der sensorischen Axonregeneration dar. Dieses Modell eignet sich, um den Einsatz von Gentherapie zur Förderung der sensorischen Axonregeneration zu untersuchen.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Die Singlefaseraufzeichnung ist eine effektive elektrophysiologische Technik, die auf das zentrale und periphere Nervensystem anwendbar ist. Zusammen mit der Vorbereitung der intakten DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv wird der Mechanismus des Leitungsversagens untersucht. Beide Protokolle verbessern das Verständnis der Beziehung des peripheren Nervensystems mit Schmerzen.

Verwendung von In Vivo Single-Faser-Aufnahme und intakten DorsalWurzel Ganglion mit angeschlossenem Ischiasnerv, um den Mechanismus des Leitungsversagens zu untersuchen

Im Kokultursystem von dorsalen Wurzelganglien und Schwann-Zellen kann die Myelinisierung des peripheren Nervensystems untersucht werden. Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten zur Beobachtung und Quantifizierung der peripheren Myelinisierung und zur Untersuchung der Auswirkungen von Wirkstoffen auf die Myelinscheide.

In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung ganzer und dissoziierter Kulturen von dorsalen Wurzelganglien (DRG) der Maus und deren Verwendung zur Beurteilung von Tumor-Nerven-Interaktionen.

Etablierung von In-vitro-Modellen der Kultur der Spinalganglien: Komplementäre Ansätze zur Untersuchung der Krebs-Nerven-Wechselwirkung

Erfahren Sie die Isolierung von DRG-Neuronen aus Ratten und deren Kultur auf einem statischen vorgespannten System zur Verbesserung der Axonausrichtung und Myelinisierung durch Ko-Kultur mit Schwann-Zellen.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

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