Name: Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Lipid-Doppelschichtbildung mit PDMS-Dünnschicht für Membran-Protein-Interaktionen. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht die Bildung innerhalb einer Stunde.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) und National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) von der National Research Foundation of Korea. Diese Arbeit wurde teilweise auch durch das Inha University Research Grant unterstützt.

1. Herstellung der Lösung <ol><li> Herstellung der Pufferlösung: <ol><li> Formulierung Pufferlösung aufzulösen 1 M KCl (Kaliumchlorid), 10 mM Tris-HCl (Tris-Hydrochlorid) und 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) in destilliertem Wasser und pH-Einstellung auf 8,0. </li><li> Filtern Sie die Lösung, die ein 0,20 um-Filter. Zu sterilisieren, autoklaviert die Lösung bei 121 ° C für 15 min. </li></ol></li><li> Herstellung von Lipid-Lösung für Pre-Malerei: <ol><li> Um die Lipidlösung für Vorlackierung formulieren, lösen sich 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn - glycero-3-Phosphatidylcholin) Lipid (w: v) in einer Mischung von 2: 8 n decan und Hexadecan (v: v). Rühre über Nacht einen Rotator verwenden. </li></ol></li><li> Herstellung von Lipid-Lösung für die Membranbildung: <ol><li> Um die Lipidlösung für die Membranbildung zu formulieren, lösen sich 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn - glycero-3-Phosphatidylcholin) Lipid (w: v) in einer Mischung von 2: 8 squalene und Hexadecan (v: v). Rühre über Nacht einen Rotator verwenden. </li></ol></li></ol> 2. Bildung eines PDMS Thin Film <ol><li> Mischungs PDMS und Härter in einem 9: 1 (w / w) -Verhältnis in einem Mischbecher das PDMS-Präpolymer zu bilden. In 5 g PDMS-Präpolymer in eine Petrischale der PDMS-Dünnfilm zu bilden (Dicke von 200 bis 250 &amp; mgr; m). Verbreiten PDMS Vorpolymer einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung bei 800 Upm für 10 sec mit einem dünnen Film zu bilden. </li><li> Platzieren Sie die Petrischale in einem Vakuumexsikkator bei einem Druck von 100 mTorr für 2 h Luftblasen zu entfernen. das Vorpolymer Dünnschicht, bake in einem Ofen für 5 h bei 70 ° C zu polymerisieren. </li><li> Um ein Quadrat PDMS dünnen Film zu machen, schneiden Sie die polymerisierte PDMS - Dünnfilm in 2 x 2 cm 2 Plätzen. Verwenden Sie einen 500 &amp; mgr; m Mikro Stanze eine Öffnung in der Mitte der PDMS dünnen Film zu machen. Pre-Farbe Öffnungen mit 3% DPhPC Lipidlösung gemischt in 2: 8 n- Decan und Hexadecan. </li></ol> 3. Kammer Herstellung und Assembly <ol><li> Zur Herstellung der BLM Kammer, Design zwei symmetrische Blöcke der Kammer mit Hilfe von 3D Zeichensoftware mit Außenabmessungen von 4 cm x 1,5 cm x 1 cm und Innen gut Abmessungen von 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17. </li><li> Craft die Kammer einen PTFE-Block mit einer CNC-Maschine und den Anweisungen des Herstellers folgen. </li></ol> 4. Kammerversammlung <ol><li> Um die Kammer montieren, stellen Sie den vorlackiertes-PDMS-Dünnschicht zwischen den beiden PTFE-Blöcke, so dass die Öffnung auf dem dünnen Film PDMS ist mit dem Loch in der Kammer ausgerichtet ist. </li><li> Verschließen Sie die Außenkanten der Kammer ein Deckglas mit Fett mit (optische Beobachtung zu erleichtern). Unbeweglichkeitseffekt die zusammengesetzte Kammer Muttern und Schrauben verwenden. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kammer gut abgedichtet, so dass es keine Flüssigkeit austritt. </li></ol> 5. Bildung von Membran Precursor mit Beschleunigter Selbstorganisation Formation (MPES) <ol><li> Mit einer Pipette deponieren 0,5ul 0,1% DPhPC Lipid gemischt in 2: 8 n decan: Hexadecan auf die Apertur des dünnen Films PDMS mit der Kammer montiert. </li><li> Vor der Verwendung speichern die Kammer in einem Gefrierschrank oder Kühlschrank unter 10 ° C. </li></ol> 6. Membranbildung und Verifikation <ol><li> Um einen BLM mit MPES bilden, ziehen Sie die Kammer aus dem Kühlschrank und suspendieren 2 ml Pufferlösung in jeder Seite der Kammer. Stellen Sie die Kammer beiseite für &lt;10 min, bis die gefrorene Membran Vorläufer auftaut. </li><li> Platzieren Sie die Kammer auf einen Mikromanipulators genau zu steuern die Höhe in Bezug auf die Lichtquelle und das Mikroskop. Ausleuchten einer Seite der Kammer als eine Lichtquelle eine Halogenfaseroptischen Illuminator mit der Apertur der PDMS-Dünnfilm für eine optische Beobachtung der BLM Bildungsprozesses zu erhellen. </li><li> Auf der anderen Seite, legen Sie ein digitales Mikroskop vertikal in Bezug auf die Lichtquelle BLM Bildung zu beobachten (vergrößern um 200X). </li><li> Um BLM Bildung bestätigen, beachten Sie die Mitte der Öffnung, wo die Farbe heller als der Ringspalt wird. </li></ol> 7. Elektrische Aufnahme <ol><li> Für die elektrische Messung vorbereiten Ag / Cl Elektroden eine 208 um dicke Silberdraht und Bleichmittel in Natriumhypochlorit&gt; 1 min verwendet wird. Platzieren Sie die Ag / Cl Elektroden in jeder Seite der Kammer, tief genug eingetaucht werden in die Pufferlösung. </li><li> Die Elektroden an der Mikroelektrode Verstärker. Mit Elektro Software, wenden Sie einen ± 10 mV Dreieckwellenform über die Membran eine Rechteckwelle zu erwerben. Stellen Sie Anlegen einer Spannung durch die Pfeile auf V_clamp (mV) angegeben klicken. </li><li> Notieren Sie sich die elektrischen Eigenschaften der Membran durch die Record-Taste (roter Punkt-Symbol) klicken. Fahren Sie mit der Aufzeichnung, bis eine einheitliche Rechteckwelle beobachtet wird. Beenden Sie die Aufnahme durch das schwarze Quadrat-Symbol klicken. </li></ol> 8. Ionenkanal-Incorporation NICHTE: Gramicidin A (gA) der Einbau erfolgt spontan bei der Bildung von BLM als gA ist direkt mit der Lipidlösung zugegeben. <ol><li> gA Kanal Aktivitäten gelten 100 mV über die Membran bei einer Abtastrate von 5 kHz zu messen Haltepotential der Membran zu beobachten. Stellen Sie Anlegen einer Spannung durch die Pfeile auf V_clamp (mV) angegeben klicken. </li><li> Notieren Sie sich die elektrischen Eigenschaften des gA-Einbau durch die Record-Taste (roter Punkt-Symbol) klicken. Gehen Sie die Aufzeichnung, bis der Strom Sprünge beobachtet wird. Beenden Sie die Aufnahme durch das schwarze Quadrat-Symbol klicken. </li><li> Nach dem elektrischen Datenerfassung, die Daten filtern, mit einem Tiefpass-Bessel-Filter bei 100 Hz eine Elektro Software. </li><li> Beachten Sie Stromsprünge in der gefilterten Haltepotential Daten (jeder Stromsprung, ~ 0,15 nS, stellt Dimerisierung eines gA Ionenkanal) gA Einbau zu überprüfen. </li></ol>

<ol><li>Hanke, W., Schulue, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Planar+lipid+bilayers%3A+methods+and+applications%22">Planar lipid bilayers: methods and applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+planar+lipid+bilayer+membranes+for+rapid+screening+of+membrane+active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds.</a> Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).</li>
<li>Bayley, H., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensors+inspired+by+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensors inspired by biology.</a> Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).</li>
<li>Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+microarrays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).</li>
<li>Majd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+biological+pores+in+nanomedicine%2C+sensing%2C+and+nanoelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).</li>
<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Biomimetic+Membranes+and+Their+Sensor+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications.</a> Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Ion+Channel+Activities+of+Gramicidin+A+in+the+Presence+of+Ionic+Liquids+Using+Model+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamping+by+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Patch clamping by numbers.</a> Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).</li>
<li>Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cell+membrane+structure+in+vitro+and+its+transformation+into+an+excitable+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.</a> Nature. 194, 979-980 (1962).</li>
<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).</li>
<li>Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+microelectrode-cavity+array+for+high-resolution+and+parallel+electrical+recording+of+membrane+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents.</a> Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).</li>
<li>Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+gel-bilayer+channel+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater.+Opt.+Electron%22%5BJournal%5D)">A robust gel-bilayer channel biosensor.</a> Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).</li>
<li>Ide, T., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artificial+lipid+bilayer+formed+on+an+agarose-coated+glass+for+simultaneous+electrical+and+optical+measurement+of+single+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).</li>
<li>Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-encapsulated+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-encapsulated lipid membranes.</a> J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).</li>
<li>Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Lived+Planar+Lipid+Bilayer+Membranes+Anchored+to+an+In+Situ+Polymerized+Hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel.</a> Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storable+and+shippable+lipid+bilayer+membrane+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform.</a> Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Lipid+Membrane+Formation+Using+a+Polydimethylsiloxane+Film+for+Ion+Channel+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements.</a> Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).</li>
<li>Yaws, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYaws%2C+C+%22Chemical+Properties+Handbooks%3A+Physical%2C+Thermodynamic%2C+Environmental%2C+Transport%2C+Safety%2C+and+Health+Related+Properties+for+Organic+and+Inorganic+Chemicals%22">Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals</a>. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).</li>
<li>Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWindholz%2C+M+%22The+Merck+index.+An+encyclopedia+of+chemicals+and+drugs%22">The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs</a>. , Merck & Co. (1976).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+C+%22Ion+Channel+Reconstitution%22">Ion Channel Reconstitution</a>. , Springer Science & Business Media. (1986).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-state+substructure+of+single+chloride+channels+from+Torpedo+electroplax%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).</li>
<li>Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capacity+of+black+lipid+films+and+of+lipid+bilayers+made+from+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).</li>
<li>Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+requirements+for+membrane-glass+adhesion+and+giga+seal+formation+in+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording.</a> Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Unsere BLM-Formationstechnik bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Zellmembranen und Ionenkanälen, im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken, die nur ein begrenztes Potenzial für den industriellen Einsatz haben. Wir entwickelten einen Membranvorläufer unter Verwendung einer PDMS-Dünnschicht und entwickelten einen gefrorenen Membranvorläufer mit beschleunigter Selbstorganisation.
Im Gegensatz zu herkömmlichen Membranbildungsmethoden mit hydrophoben Filmen, bei denen die Me...

Künstliche Lipiddoppelschichtmembran oder schwarze Lipidmembran (BLM), ist ein wichtiges Werkzeug für die Mechanismen von Zellmembranen und Ionenkanäle, sowie für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Ionenkanälen und Ionen / Moleküle. 1-7 Obwohl der Patch-Clamp - Methode Aufklären künstrekonstruierte Membranen Lipid - Doppelschicht als Alternative Werkzeuge für die Ionenkanal - Studien wird häufig der Goldstandard für die Zellmembran Studien betrachtet, ist es mühsam ist und hoch qualifizierten Operatoren für Ionenkanal - Messungen erfordert. 8 Während entstanden sind, sind 9,10 sie auch mit mühsamen assoziiert Prozesse und spezifisches Know-how. Darüber hinaus sind Membranen auf mechanische Störungen anfällig. Daher Lipid - Doppelschicht - Technologien bisher eingeführt haben nur begrenzte praktische Anwendungen. 11 Um die Robustheit und Langlebigkeit der Lipidmembranen, Costello et al zu verbessern. 12 und Ide und Yanagida <sup&gt; 13 haben eine freistehende Lipid - Doppelschicht von Hydrogelen unterstützt entwickelt. Trotz verbesserte Langlebigkeit jedoch (&lt;24 h) wurde Bilayer Robustheit nicht verbessert. Jeon et al. 14 entwickelt ein Hydrogel verkapselt Membran (HEM) mit intimen Hydrogel-Lipid - Doppelschicht Kontakt, zu einer erhöhten Lebensdauer erreicht wird (bis zu mehrere Tage). Um die Lebensdauer des HEM erhöhen, Malmstadt und Jeon et al. Erstellt ein Hydrogel verkapselt Membran mit Hydrogel-Lipid - Bindung über in-situ kovalente Konjugation (cgHEM). 15 In beiden Systemen Membranlebensdauer deutlich erhöht (&gt; 10 Tage) . Jedoch waren die Membranbildungssysteme nicht ausreichend robust und nicht gespeichert werden könnten oder geliefert, wo der Lipid-Doppelschichten für die Verwendung zu befreien Know-how erforderlich. Die Entwicklung einer Lipid-Doppelschicht-Plattform hat sich um zunehmende Robustheit und Langlebigkeit der BLMs in erster Linie drehte. Obwohl die Langlebigkeit der BLMs hat su gewesenbstantially kürzlich verbessert wurden ihre Anwendungen wegen mangelnder Transportfähigkeit und Lagerbarkeit begrenzt. Um diese Probleme zu überwinden, Jeon et al. Eine speicherbare Membransystem erzeugt und stellte eine Membran Vorläufers (MP). 16 auf einen MP konstruieren, bereiteten sie ein Gemisch aus n- Decan und Hexadecan , enthaltend 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn - glycero-3-Phosphatidylcholin) zur Steuerung des Gefrierpunktes der Lipidlösung , so dass sie bei ~ 14 ° C (unterhalb der Raumtemperatur, oberhalb typischen Kühlschranktemperatur einfrieren würde). In diesem Experiment wurde die MP verteilt auf eine kleine Öffnung auf eine Polytetrafluorethylen (PTFE) -Folie und anschließend in einem Kühlschrank bei 4 ° C eingefroren. Wenn der MP auf Raumtemperatur gebracht wurde, aufgetaut die MP und eine Lipiddoppelschicht automatisch gebildet wurde, die Expertise Eliminieren typischerweise mit Membranbildung verbunden. Allerdings war die Erfolgsquote der BLM vom MP gemacht so günstig wie ~ 27%, und die Membran Formation war inkonsistent (30 min bis 24 h), die Begrenzung der praktischen Anwendungen. In dieser Studie wird ein Polydimethylsiloxan (PDMS) Dünnfilm anstelle einer herkömmlichen hydrophoben dünnen Filmen (PTFE, Polyoxymethylen, Polystyrol) bis (a) Steuerherstellungszeit und (b) erhöhen die Erfolgsrate der BLM Bildung verwendet, wie zuvor von Ryu berichtet et al. 17 Hierin wurde die Membranbildung durch Extraktion von Lösungsmitteln erleichtert aufgrund der porösen Natur des PDMS, und die Zeit für die Membranbildung erforderlich war erfolgreich in dieser Studie kontrolliert. In diesem System, da die Lipidlösung in die PDMS-Dünnfilm, eine konsistente Membranbildungszeit absorbiert wurde, wurde erreicht. Außerdem wurde Membranlebensdauer verlängert durch langsame Absorption von Lösungsmitteln in die PDMS-Dünnfilm, ein Ergebnis der Zugabe von Squalen zu der Lipidlösung. Wir führten optischen und elektrischen Messungen zu überprüfen, dass Membranen mit dieser Technik sind für i geeignet gebildetauf den Kanälen Studien.

<table><tbody><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Für Pufferlösung</td></tr><tr><td>Tris-Hydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td>Für Pufferlösung</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td>Für Pufferlösung</td></tr><tr><td>n-Decan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44074-U</td><td>Für Lipidlösung</td></tr><tr><td>Hexadecan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-76-3</td><td>Für die Lipidlösung</td></tr><tr><td>Squalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3626</td><td>Für die Lipidlösung</td></tr><tr><td>Gramicidin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11029-61-1</td><td>Membranprotein</td></tr><tr><td>1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td>Für die Membrae-Bildung</td></tr><tr><td>Sylgard 184a und 184b Elastromer-Kit</td><td>Dow Corning Asia</td><td></td><td>Zur Herstellung von PDMS-Dünnschichten</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Filter</td><td>Satorius stedim</td><td>16534----------K</td><td>Zum Filtern von Pufferlösung</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FinePCR</td><td>AG</td><td>Zum homogenen Auflösen von Lipiden</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Biofree</td><td>BF-60AC</td><td>Zum Sterilisieren von Pufferlösung</td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Shinu Mst</td><td>SP-60P</td><td>Zum Verteilen des PDMS-Prepolymers</td></tr><tr><td>Vaccum Dessikkator</td><td>Welch</td><td>2042-22</td><td>Zum Entfernen von Luftblasen in PDMS Prepolymer</td></tr><tr><td>500 &mu; M&nbsp; Stanze</td><td>Harris Uni-Core</td><td>0.5</td><td>Zum Erstellen einer Apertur auf der PDMS-Dünnschicht-CNC-Maschine</td></tr><tr><td></td><td>SME Trading</td><td>SME 2518</td><td>Zur Herstellung einer Membranbildungskammer</td></tr><tr><td>Halogenfaseroptischer Strahler</td><td>Motic</td><td>MLC-150C</td><td>Zur Beleuchtung der Apertur des PDMS-Dünnfilms für die optische Betrachtung</td></tr><tr><td>Digitalmikroskop</td><td>Digital blau</td><td>QX-5</td><td>Zur optischen Betrachtung der Lipid-Doppelschichtmembran Bildung</td></tr><tr><td>Elektrode</td><td>A-M Systeme</td><td></td><td>Zur elektrischen Beobachtung der Membranbildung</td></tr><tr><td>Mikroelektrodenverstärker (Axopatch-Verstärker)</td><td>Axon Instruments</td><td>Axopatch 200B Verstärker</td><td>Zur Messung der Kapazität der Membran (im Manuskript als Mikroelektrodenverstärker beschrieben)</td></tr></tbody></table>

automatisierte lipid bilayer membrane formation eines polydimethylsiloxans dünnschicht unter verwendung

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Eine künstliche Lipiddoppelschicht oder schwarze Lipidmembran (BLM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, Ionenkanäle und Protein-Wechselwirkungen, sowie für Biosensor-Anwendungen für die Untersuchung. Jedoch weisen herkömmliche BLM Bildungstechniken mehrere Nachteile, und sie erfordern häufig spezifische Know-how und eine aufwendige Arbeit. Insbesondere leiden herkömmliche BLMs von niedrigen Bildung Erfolgsraten und inkonsistent Membranbildung Zeit. Hier zeigen wir eine speicherbare und transportierbare BLM Erzeugungssystem mit kontrolliertem Ausdünnungs Zeit und verbesserte BLM Bildungsrate von üblicherweise verwendeten Folien ersetzt (Polytetrafluorethylen, Polyoxymethylen, Polystyrol) zu Polydimethylsiloxan (PDMS). In diesem Experiment wird ein poröser strukturierte Polymer wie PDMS-Dünnfilm verwendet. Zusätzlich, im Gegensatz zu konventionell verwendeten Lösungsmitteln mit niedriger Viskosität, erlaubt die Verwendung von Squalen eine kontrollierte Ausdünnungs Zeit über langsame Lösungsmittelabsorption durch PDMS, Membranlebensdauer verlängert wird. In der Werbunghinaus, indem eine Mischung aus Squalen und Hexadecan verwendet wurde, wurde der Gefrierpunkt der Lipidlösung erhöht (~ 16 ° C), außerdem wurden Membranvorläufern hergestellt, die auf unbestimmte Zeit gelagert werden können und ohne weiteres transportiert werden. Diese Membranvorstufen BLM Bildungszeit von reduzierten &lt;1 h und erreicht eine BLM-Bildungsrate von ~ 80%. Außerdem zeigten Ionenkanal Gramicidin A Versuche mit der Durchführbarkeit des Membransystems.

Optimierung der MPES Lösung Zusammensetzung Verschiedene Zusammensetzungen von Lipiden und Lösungsmittel wurden getestet, um erfolgreich Lipid-Bilayer-Membranen aus MPES rekonstituieren. Das MP - System mit einem Gemisch aus n- Decan und Hexadecan , enthaltend 3% DPhPC 14 zeigte eine geringe Erfolgsrate der Membranbildung (~ 27%). Zusätzlich kann, wie kontinuierlich Lipidlösung extrahiert die PDMS-Film war es erforderlich, die Lösungsmittelzusa...

Wir zeigen eine speicherbare, transportierbar Lipid-Doppelschicht Bildungssystem. Eine Lipid-Doppelschicht-Membran kann mit mehr als 80% Erfolgsquote innerhalb von 1 h gebildet werden, wenn eine gefrorene Membran Vorläufer auf Umgebungstemperatur gebracht wird. Dieses System wird mühsamen Prozesse reduzieren und Know-how mit Ionenkanälen verbunden.

Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Methode zu beschreiben, die zur Untersuchung der automatisierten Bildung von Lipiddoppelschichten unter Verwendung eines dünnen Polydimethylsiloxan-Films genutzt werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Nanobiosensoren bezüglich der Wechselwirkungen zwischen Membranen und Proteinen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Bildung der Lipiddoppelschicht automatisiert und reproduzierbar ist.Bereiten Sie zunächst die Pufferlösung vor, indem Sie Kaliumchlorid, Tris-Hydrochlorid und EDTA in destilliertem Wasser kombinieren. Danach stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 8,0 ein. Anschließend filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikron-Filter und autoklavieren sie bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Bereiten Sie anschließend die Lipidlösung zur Vorbehandlung vor, indem Sie 3 % des Lipids in einer Mischung aus zwei Teilen Undecan und acht Teilen Hexadecan nach Volumen lösen. Rühren Sie die Lösung über Nacht mit einem Rotator. Bereiten Sie außerdem die Lipidlösung zur Membranbildung vor, indem Sie 0,1 % des Lipids in derselben Mischung aus zwei Teilen Undecan und

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Unterstützten Lipiddoppelschichten und natürlichen Membran Teilchen sind praktisch Systeme, die die Eigenschaften von Zellmembranen annähern kann und in einer Vielzahl von Analysestrategien eingearbeitet werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays der unterstützten Lipiddoppelschicht beschichtete SiO 2-Kugeln, Phospholipid-Vesikel oder natürlichen Membranpartikeln.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Mikrofluidik-Strahl gegen eine Tröpfchen Schnittstelle Lipid-Doppelschicht bietet eine zuverlässige Möglichkeit, die Kontrolle über Vesikel mit Membran-Asymmetrie, die Aufnahme von Transmembranproteinen und Kapselung von Material zu erzeugen. Diese Technik kann angewandt werden, um eine Vielzahl von biologischen Systemen, in denen unterteilte Biomolekülen gewünscht studieren.

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll, um eine unterstützte Lipiddoppelschicht auf festen Substraten ohne Verwendung von Lipidbläschen bilden. Wir zeigen, ein einstufiges Verfahren zur Herstellung einer Lipid-Doppelschicht auf Siliciumdioxid und Gold sowie trägergestützten Membranen mit Cholesterin angereicherten Domäne für verschiedene biologische Anwendungen bilden.

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

Die Erzeugung von Mikrofluidik-Doppelemulsionen umfasst typischerweise Geräte mit strukturierter Benetzbarkeit oder speziell angefertigte Glaskomponenten. Hier beschreiben wir die Herstellung und Prüfung eines Doppelemulsionsgenerators aus Polydimethylsiloxan (PDMS), der keine Oberflächenbehandlung oder komplizierte Herstellungsprozesse erfordert und in der Lage ist, Doppelemulsionen bis zu 14 μm herzustellen.

Doppelemulsion Erstellung Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-Axial Flow Fokus Geräte-

Solide unterstützt, eiweißfreie, doppelte Phospholipid Bilayer Membranen (DLBM) können in komplexen und dynamischen Lipid Nanotube Netze umgewandelt werden und können als 2D Bottom-up-Modellen von dem endoplasmatischen Retikulum dienen.

Spontane Bildung und Neuordnung der künstlichen Lipid Nanotube Netze als Bottom-Up-Modell für endoplasmatische Retikulum

Wir berichten über ein Protokoll zur Herstellung einer Hybrid-Lipidmembran an der Wasser-Luft-Schnittstelle, indem wir die Lipid-Doppelschicht mit Kupfer (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-Phthalocyanin (CuPc) Molekülen dopen. Die resultierende Hybrid-Lipidmembran hat eine Lipid/CuPc/Lipid-Sandwichstruktur. Dieses Protokoll kann auch auf die Bildung anderer funktioneller Nanomaterialien angewendet werden.

Selbstmontage von Hybrid-Lipidmembranen, dotiert mit hydrophoben organischen Molekülen an der Wasser-Luft-Schnittstelle

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von Zell-imitierenden Uni-Lipid- und Multi-Lipid-Vesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Diese In-vitro-Modelle können angepasst werden, um eine Vielzahl von Lipidtypen zu integrieren und können verwendet werden, um verschiedene Molekül- und Makromolekül-Interaktionen zu untersuchen.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung und Analyse der Bindung, Mobilität und Assemblierung einzelner Moleküle auf künstlichen überfüllten Lipidmembranen unter Verwendung der Einzelmolekül-Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (smTIRF) vorgestellt.

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Hier wird ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem entwickelt, um eine synthetische Membran mit einer definierten Krümmung bereitzustellen, die die Charakterisierung von Proteinen mit Krümmungssensorik in vitro ermöglicht.

Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Oktanol-unterstützte Liposomenassemblierung (OLA), eine mikrofluidische Technik zur Erzeugung biokompatibler Liposomen. OLA produziert monodisperse, mikrometergroße Liposomen mit effizienter Verkapselung, die sofortige On-Chip-Experimente ermöglichen. Dieses Protokoll soll sich besonders für die synthetische Biologie und die synthetische Zellforschung eignen.

On-Chip-Oktanol-gestützte Liposomen-Assemblierung für die Biotechnologie

Dieses Protokoll stellt ein verbessertes Entformungsverfahren für die Doppelgusstechnik von Polydimethylsiloxan (PDMS) dar, indem Silikonöl als nicht-adhäsive Barriere zwischen den PDMS-Schichten eingeführt wird. Im Gegensatz zu Plasma- oder chemischen Methoden zur Oberflächenmodifikation erfordert dieser Ansatz keine spezielle oder kostspielige Ausrüstung, was ihn zu einer zugänglicheren und kostengünstigeren Alternative macht.

Verbesserter Doppelguss von Polydimethylsiloxan (PDMS) durch Silikonölbehandlung für die Replikation dicht gepackter Mikrostrukturen

Erfahren Sie die automatisierte Lipid-Doppelschichtbildung mit PDMS-Dünnschicht für Membran-Protein-Interaktionen. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht die Bildung innerhalb einer Stunde.

Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung

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