Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode zu beschreiben, mit der die automatisierte Bildung von Lipiddoppelschichten unter Verwendung eines Polydimethylsiloxan-Dünnfilms untersucht werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Nanobiosensoren in Bezug auf Membran-Protein-Wechselwirkungen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bildung von Lipiddoppelschichten automatisiert und reproduzierbar ist.

Bereiten Sie zunächst die Pufferlösung vor, indem Sie Kaliumchlorid, Trishydrochlorid und EDTA in destilliertem Wasser kombinieren. Stellen Sie dann den PH-Wert der Lösung auf 8,0 ein. Filtrieren Sie dann die Lösung mit einem 0,2-Mikron-Filter und autoklavieren Sie die Lösung 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius.

Als nächstes bereiten Sie die Lipidlösung für die Vorlackierung vor, indem Sie 3 % des Lipids in einer Mischung auflösen, die aus zwei Volumenteilen Undecan und acht Volumenteilen Hexadecan besteht. Rühren Sie die Lösung über Nacht mit einem Rotator um. Bereiten Sie außerdem die Lipidlösung für die Membranbildung vor, indem Sie 0,1 % des Lipids in derselben Mischung aus zwei Volumenteilen Undecan und acht Volumenteilen Hexadecan auflösen.

Rühren Sie diese Lösung auch über Nacht auf einem Rotator um. Um einen PDMS-Dünnfilm herzustellen, mischen Sie neun Teile Prepolymer mit einem Teil Härter in einem Mischbecher. Geben Sie fünf Gramm dieser Mischung in eine Petrischale und schleudern Sie die Schale 10 Sekunden lang bei 800 U/min, um einen 200 bis 250 Mikrometer dicken Film zu bilden.

Stellen Sie dann die Petrischale in einen Vakuumexsikkator und ziehen Sie zwei Stunden lang einen Staubsauger von 100 Millitorr, um die restlichen Luftblasen zu entfernen. Dann backen Sie den dünnen Film fünf Stunden lang bei 70 Grad Celsius in einem Ofen, um das PDMS zu polymerisieren. Schneiden Sie nach dem Abkühlen den polymerisierten dünnen Film in zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter große Quadrate und verwenden Sie einen Stempel mit einem Durchmesser von 500 Mikrometern, um eine kleine Öffnung in der Mitte des Quadrats zu erzeugen.

Verwenden Sie dann eine Mikropipette, um die Öffnungen mit einem Mikroliter der 3%igen Lipidlösung vorzulacken. Um die schwarze Lipidmembrankammer zu erstellen, entwerfen Sie mit Hilfe einer 3D-Zeichensoftware zwei symmetrische Blöcke für die Kammer. Stellen Sie dann die Kammer mit einem PTFE-Block und einer CNC-Maschine her.

Um die Kammer zusammenzubauen, legen Sie die vorlackierte PDMS-Dünnschicht zwischen die beiden PTFE-Blöcke, so dass die Öffnung auf der PDMS-Dünnschicht mit dem Loch in der Kammer zentriert ist. Verwenden Sie Deckglas und Vakuumfett, um die Außenkanten der Kammer abzudichten. Nach dem Versiegeln legen Sie die zusammengebaute Kammer mit Schrauben und Muttern still.

Es ist wichtig, dass die Kammer gut abgedichtet ist, damit keine Flüssigkeit austritt. Geben Sie mit einer Pipette 0,5 Mikroliter der 0,1%igen Lipidlösung auf die Öffnung des PDMS-Dünnfilms, der mit der Kammer zusammengesetzt ist. Stellen Sie die Kammer dann in eine gekühlte Umgebung unter 10 Grad Celsius und lagern Sie sie, bis sie benötigt wird.

Um eine schwarze Lipidmembran mit beschleunigter Selbstorganisation zu bilden, nehmen Sie die Kammer aus dem Kühlschrank und geben Sie zwei Milliliter der Pufferlösung in jede Seite der Kammer. Stellen Sie die Kammer 10 Minuten lang beiseite, bis der gefrorene Membranvorläufer auftaut. Platzieren Sie dann die Kammer auf einem Mikromanipulator, um die Höhe in Bezug auf die Lichtquelle und das Mikroskop genau zu steuern.

Beleuchten Sie mit einer faseroptischen Halogenbeleuchtung eine Seite der Kammer, um die Apertur des PDMS-Dünnfilms aufzuhellen. Platzieren Sie auf der anderen Seite ein 20-fach-Objektiv in einer Linie mit der Blende und beobachten Sie die Mitte, in der die Farbe heller wird als der Ring. Für die elektrische Messung bereiten Sie Silberchlorid-Elektroden vor, indem Sie einen 208 Mikrometer dicken Silberdraht mindestens eine Minute lang in eine Lösung aus Natriumhypochlorit legen.

Verbinden Sie als Nächstes die Elektroden mit einem Mikroelektrodenverstärker. Platzieren Sie dann die Silberchloridelektroden auf jeder Seite der Kammer, so dass sie sich in der Pufferlösung befinden. Wenden Sie mit Hilfe einer Elektrophysiologie-Software eine 10-Millivolt-Dreieckswellenform über die Membran an, um eine Rechteckwelle zu erhalten.

Notieren Sie die elektrischen Eigenschaften der Membran, indem Sie auf die Aufnahmeschaltfläche klicken. Fahren Sie mit der Aufnahme fort, bis eine gleichmäßige Rechteckwelle beobachtet wird. Beenden Sie dann die Aufnahme, indem Sie auf das schwarze Quadratsymbol klicken.

Es können zwei Methoden angewendet werden, um Gramicidin A in die Lipiddoppelschicht einzubauen. Zunächst kann Gramicidin A direkt in die Lipidlösung gegeben werden, bevor die Lipidlösung auf die Öffnung des PDMS-Dünnfilms aufgetragen wird. Zweitens kann der Kammer Gramicidin A-Lösung zugesetzt werden, wenn sich eine Lipiddoppelschicht bildet.

Um die Aktivitäten des Gramicidin A-Kanals zu beobachten, legen Sie 100 Millivolt mit einer Abtastrate von 5 Kilohertz an die Membran an, um das Haltepotenzial der Membran zu messen. Notieren Sie die elektrischen Eigenschaften wie zuvor, indem Sie auf die Aufnahmeschaltfläche klicken. Wenn die Aktivitäten der Ionenkanäle angezeigt werden, setzen Sie die Aufzeichnung fort, bis verschiedene Stromsprünge beobachtet werden, um den Einbau des Ionenkanals zu bestätigen.

Beenden Sie nach der Bestätigung die Aufnahme, indem Sie auf das schwarze Quadrat klicken. Wenn die Aufzeichnung beendet ist, filtern Sie die Daten mit einem Tiefpass-Bessel-Filter bei 100 Hertz unter Verwendung einer Elektrophysiologie-Software. Beobachten Sie die aktuellen Sprünge in den gefilterten Haltepotenzialdaten.

Diese Sprünge stellen die Dimerisierung eines Gramicidin A-Ionenkanals dar. Wenn der gefrorene Membranvorläufer zum Auftauen auf Raumtemperatur gebracht wurde, wird die Bildung von Lipiddoppelschichten durch die Extraktion von hydrophobem Lösungsmittel in den PDMS-Dünnfilm erleichtert. Diese Bildsequenz zeigt die Bildung einer Lipiddoppelschicht, die sich selbst zusammensetzt, wenn sie aus ihrer gefrorenen Form erwärmt wird.

Hier veranschaulicht die elektrische Leitfähigkeit den Einbau und die Dimerisierung von Gramicidin A. Bei der Dimerisierung bildet das Gramicidin A einen Ionenkanal und die Leitwerte springen auf 28 Picosiemen, was mit den Ergebnissen früherer Berichte übereinstimmt und einen sofortigen Einbau dieses Antibiotikums in die Doppelschicht zeigt. Unsere Membranbildungstechnik bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für Zellmembran- und Nanokanalstudien, im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken, die nur ein begrenztes Potenzial für die praktische Anwendung haben. Unser System erfordert weder für die Membranbildung noch für die Integration von Ionenkanälen Fachwissen und eignet sich daher gut für Wirkstoff-Screening- und Biosensorik-Anwendungen.