Doppelemulsion Erstellung Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-Axial Flow Fokus Geräte-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein mikrofluidisches Gerät aus Polydimethylsuboxan zu bauen und zu testen, das die koaxiale Strömungsfokussierung zur Erzeugung von Doppelemulsionen nutzt. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in Chemie und Biologie zu beantworten, die ein Ultrahochdurchsatz-Screening erfordern, wie z. B. die gerichtete Evolution von Enzymen und die Identifizierung seltener Phänotypen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die schnelle Herstellung von Doppelemulsionsgeneratoren mittels weicher Lithographie ohne spezielle Oberflächenbehandlungen ermöglicht.

Zu Beginn entwerfen Sie die mikrofluidischen Strukturen für die zweischichtige Herstellung. Lassen Sie die Entwürfe mit AutoCAD-Software auf Leiterplattenfolie mit einer Auflösung von 10 Mikrometern drucken, wie in der hier gezeigten Referenz beschrieben. Tragen Sie ein bis zwei Milliliter SU 8 30 35 in die Mitte eines vorgereinigten Siliziumwafers mit einem Durchmesser von drei Zoll auf, legen Sie es auf einen Spin-Coder und befestigen Sie es am Spannfutter.

20 Sekunden lang bei 500 U/min drehen, gefolgt von 30 Sekunden bei 2000 U/min. Den Wafer herausnehmen und auf einer 135 Grad Celsius heißen Platte 30 Minuten backen. Lassen Sie den Wafer auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.

Setzen Sie nun den beschichteten Wafer für die erste Schicht für 90 Sekunden unter einem magazinierten LED-Licht der Maske aus. Legen Sie den Wafer nach der Belichtung für eine Minute wieder auf die 135 Grad Celsius heiße Platte. Nach dem Abkühlen ein bis zwei Milliliter SUH 2050 in die Mitte des Wafers geben.

Setzen Sie den Wafer wieder auf den Spin-Coder und drehen Sie ihn 20 Sekunden lang mit 500 U/min. Dann 30 Sekunden lang mit 1.375 U/min drehen. Wenn sich der Spin-Coder nicht mehr dreht, entfernen Sie den Wafer und legen Sie ihn für 30 Minuten wieder auf die 135 Grad heiße Platte.

Kühlen Sie den Wafer dann wieder auf Raumtemperatur ab, bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen. Richten Sie die Maske für die zweite Schicht an der Geometrie aus, die in den vorherigen Schritten gemustert wurde, und setzen Sie den beschichteten Wafer nach der Belichtung erneut drei Minuten lang dem UV-Licht aus. Legen Sie den Wafer eine Minute lang auf die 135 Grad Celsius heiße Platte. Nach dem Abkühlen entwickelten sich die Masken, indem der Wafer in ein Rührbad aus Propylenglykol, Monomethyletheracetat, getaucht wurde.

Nach 30 Minuten im Bad entfernen Sie die Waffel und waschen sie in Isopropanol. Anschließend die Waffel auf der 135 Grad Celsius heißen Platte eine Minute lang backen. Kühlen Sie den Wafer ab und legen Sie den entwickelten Master in eine 100-Millimeter-Petrischale.

Bereiten Sie eine Charge PDMS vor, indem Sie 50 Gramm Silikonbasis mit fünf Gramm Härter in einem Plastikbecher kombinieren. Verwenden Sie ein Rotationswerkzeug mit einem Rührstab, um die Komponenten zu mischen, und entgasen Sie die Mischung dann etwa 30 Minuten lang in einem Trockenmittel oder bis alle Luftblasen entfernt sind. Gießen Sie anschließend das PDMS bis zu einer Dicke von drei Millimetern über den Master.

Legen Sie dann die Petrischale zur weiteren Entgasung in die Trockenform. Sobald alle Blasen entfernt sind, backen Sie das Gerät zwei Stunden lang bei 60 Grad Celsius. Schneiden Sie das PDMS-Gerät mit einem Skalpell aus der Form und legen Sie es mit der Musterseite nach oben auf eine saubere Oberfläche.

Schneiden Sie dann das PDMS mit einer Rasierklinge in zwei Hälften, um die beiden Seiten des Geräts auf dem Stück mit der 50-Mikrometer-Geometrie für die Flüssigkeitshandhabung zu trennen, die von Master One aufgedruckt wurde. Stanzen Sie die fluidischen Ein- und Ausgänge mit einem 0,75-Millimeter-Biopsiestanzer. Legen Sie als Nächstes die PDMS-Stücke mit ihren gemusterten Seiten nach oben in ein Plasmakammer-Plasma.

Behandeln Sie das Gerät 60 Sekunden lang mit Sauerstoffplasma in einer Millibar Geschwindigkeit von einem Millibar in einem 300-Watt-Plasmareiniger. Entfernen Sie dann die Proben und befeuchten Sie die Oberfläche des nicht abgeschreckten PDMS-Stücks mit einem Tropfen DI-Wasser, das als temporäres Schmiermittel dient, während Sie das Gerät durch ein Stereomikroskop betrachten. Legen Sie die plasmabehandelten Oberflächen zusammen und schieben Sie die Oberflächen, bis eine mechanische Verriegelung erreicht ist.

Wenn die vertieften Rahmen und die hervorstehenden Rahmen zusammenpassen, stellen Sie das Gerät nach dem Zusammenbau in einen 60 Grad Celsius heißen Ofen und backen Sie es zwei Tage lang, um das Wasser zu verdampfen und die Verklebung abzuschließen. Befestigen Sie dann das zusammengebaute Gerät mit mehreren Tropfen ungehärtetem PDMS auf einem Objektträger und backen Sie das Konstrukt eine Stunde lang in einem 60 Grad Celsius heißen Ofen. Um das PDMS zu härten, wird der mikrofluidische Chip auf dem Tisch eines inversen Mikroskops mit einer Digitalkamera gekoppelt, die Verschlusszeiten von mindestens 100 Mikrosekunden erreichen kann.

Montieren Sie als Nächstes drei 10-Milliliter-Spritzen auf Spritzenpumpen und befestigen Sie an jeder von ihnen 27-Gauge-Nadeln. Befestigen Sie etwa 30 Zentimeter PE an jeder der Nadeln zwei Schläuche und führen Sie die losen Enden der Schläuche in die entsprechenden gestanzten Löcher im Gerät ein. Führen Sie dann ein 10 Zentimeter langes PE zwei in die Austrittsöffnung des Geräts ein und legen Sie das andere Ende in einen Abfallsammelbehälter.

Nach der Einrichtung entleeren Sie das Gerät, indem Sie die Spritzenpumpen mit hoher Drehzahl laufen lassen. Stoppen Sie die Pumpen. Sobald die Flüssigkeit in den Schlauchsegmenten die Einlassöffnungen des Geräts erreicht, fokussieren Sie das Mikroskop auf den Bereich des Chips, der eine 50 x 50 Mikrometer große Öffnung enthält, und stellen Sie den Rahmen so ein, dass er den stromabwärts gelegenen Austrittskanal umfasst.

Stellen Sie die Spritzenpumpen so ein, dass sie die Flüssigkeit mit einer Durchflussmenge von 250 Mikrolitern pro Stunde für die innere Phase, 100 Mikrolitern pro Stunde für die mittlere Phase und 700 Mikrolitern pro Stunde an den Doppelemulsionsgenerator fördern. Für die kontinuierliche Phase. Warten Sie 10 Minuten, bis das System ausgeglichen ist.

Erhöhen Sie anschließend die Durchflussrate der äußeren Phase auf 1050 Mikroliter pro Stunde. Warten Sie weitere drei bis fünf Minuten, bis sich die Erzeugung von Doppelemulsionen unter diesen Strömungsbedingungen stabilisiert hat. Nach der Stabilisierung können Sie fünf Sekunden lang Videobilder mit 30 Hertz aufnehmen.

Speichern Sie die Videos für die Offline-Verarbeitung über eine manuelle Bildanalyse. Wiederholen Sie diesen Vorgang, während Sie die Durchflussrate der äußeren Phase mit den Werten in der ersten Tabelle des beigefügten Textprotokolls variieren. Behalten Sie die Raten der inneren und mittleren Phase bei.

Während dieses Prozesses wurde die Doppelemulsionsvorrichtung bei einer Vielzahl von Strömungsbedingungen getestet. Um die Bildung von monodispergierten Doppelemulsionen unterschiedlicher Größe zu demonstrieren, wird über jedem Bild das Verhältnis der kontinuierlichen Phase zur Summe der inneren und mittleren Phase dargestellt. Histogramme von Tröpfchendurchmessern für ausgewählte Durchflussverhältnisse zeigen die relative Gleichmäßigkeit in der Größe der erzeugten Tröpfchen.

Die resultierenden Doppelemulsionen erzeugen eine durchschnittliche Variation des Durchmesserkoeffizienten von 5,2 %. Das Gerät zeigt die Fähigkeit, Doppelemulsionen zu bilden, die deutlich kleiner als die Blendenbreite sind, und zeigt einen deutlichen abnehmenden Trend mit zunehmenden Strömungsverhältnissen. Bei der höchsten Trägerphasenströmung wurden 14 Mikrometer große Doppelemulsionen mit der 50 x 50 Mikrometer großen Blende nach ihrer Entwicklung gebildet. Diese Technik ebnet chemischen und biologischen Forschern den Weg, um Tröpfchen-Mikrofluidik-Experimente durchzuführen, die mit Standard-Durchflusszytometrie-Nachweisplattformen kompatibel sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mikrofluidische Doppelemulsionsgeneratoren herstellt und testet, die einfache PDMS-Konstruktionstechniken verwenden.