Doppelemulsion Erstellung Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-Axial Flow Fokus Geräte-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein vollständig aus Polydimethylsiloxan bestehendes mikrofluidisches Gerät zu bauen und zu testen, das eine koaxiale Flussfokussierung nutzt, um Doppel-Emulsionen zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Chemie und Biologie zu beantworten, die ein extrem hohes Durchsatzverfahren erfordern, wie beispielsweise die gerichtete Evolution von Enzymen und die Identifizierung seltener Phänotypen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die schnelle Herstellung von Generatoren für Doppel-Emulsionen mittels Soft-Lithographie ermöglicht, ohne dass spezielle Oberflächenbehandlungen erforderlich sind.

Beginnen Sie mit der Konstruktion der mikrofluidischen Strukturen für die Herstellung in zwei Schichten. Erstellen Sie die Konstruktionen mit der AutoCAD-Software und lassen Sie sie wie in der hier gezeigten Referenz beschrieben auf Schaltkreisplattenfolie mit einer Auflösung von 10 Mikrometern ausdrucken. Geben Sie ein bis zwei Milliliter SU 8 30 35 in die Mitte einer vorher gereinigten Siliziumscheibe mit drei Zoll Durchmesser auf einem Spin-Beschichter auf und befestigen Sie sie am Spannfutter.

20 Sekunden bei 500 U/min zentrifugieren, gefolgt von 30 Sekunden bei 2000 U/min. Das Wafer entfernen und 30 Minuten lang auf einer 135 Grad Celsius heißen Heizplatte aushärten. Das Wafer auf Raumtemperatur abkühlen lassen, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.

Belichten Sie nun den beschichteten Wafer 90 Sekunden lang unter einem kollimierten LED-Licht mit der Maske für die erste Schicht. Nach der Belichtung wird der Wafer für eine Minute auf die 135 Grad Celsius heiße Heizplatte zurückgestellt. Nach dem Abkühlen wird ein bis zwei Milliliter SUH 2050 in der Mitte des Wafers aufgetragen.

Legen Sie den Wafer zurück auf den Spin-Beschichter und zentrifugieren Sie ihn 20 Sekunden lang mit 500 U/min. Anschließend zentrifugieren Sie ihn 30 Sekunden lang mit 1.375 U/min. Wenn der Spin-Beschichter aufhört, sich zu drehen, nehmen Sie den Wafer heraus und stellen Sie ihn für 30 Minuten zurück auf die Heizplatte mit 135 Grad Celsius.

Danach die Wafer wieder auf Raumtemperatur abkühlen lassen, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Die Maske für die zweite Schicht an der Geometrie ausrichten, die in den vorherigen Schritten strukturiert wurde, und den beschichteten Wafer erneut drei Minuten lang UV-Licht aussetzen. Nach der Belichtung den Wafer für eine Minute auf eine 135 Grad Celsius heiße Heizplatte legen. Nach dem Abkühlen die Masken entwickeln, indem der Wafer in ein gerührtes Bad aus Propylenglykol-Monomethyletheracetat eingetaucht wird.

Nach 30 Minuten im Bad nehmen Sie das Wafer heraus und waschen es in Isopropanol. Danach backen Sie das Wafer eine Minute lang auf der 135 Grad Celsius heißen Heizplatte. Kühlen Sie das Wafer ab und stellen Sie dann den entwickelten Master in eine 100 Millimeter große Petrischale.

Stellen Sie eine Charge PDMS her, indem Sie 50 Gramm Silikonbasis mit fünf Gramm Härter in einem Plastikbecher mischen. Mischen Sie die Komponenten mit einem Rührstäbchen, das in ein rotierendes Werkzeug eingespannt ist, und entgasen Sie die Mischung anschließend etwa 30 Minuten lang oder bis alle Luftblasen entfernt sind in einem Trockenkolben. Gießen Sie danach das PDMS in einer Dicke von drei Millimetern auf die Vorlage.

Stellen Sie danach die Petrischale zur weiteren Entgasung in den Exsikkator. Sobald alle Blasen entfernt sind, backen Sie das Gerät zwei Stunden lang bei 60 Grad Celsius. Schneiden Sie das PDMS-Gerät mit einem Skalpell aus der Form und legen Sie es mit der strukturierten Seite nach oben auf eine saubere Oberfläche.

Schneiden Sie dann das PDMS mit einer Rasierklinge in zwei Hälften, um die beiden Seiten des Geräts auf dem Stück mit der 50 Mikrometer-Fluidik-Geometrie, die durch Master eins eingeprägt wurde, zu trennen. Stanzen Sie die Fluidik-Zulauf- und -Ablauföffnungen mit einer 0,75-Millimeter-Biopsiepistole aus. Legen Sie danach die PDMS-Teile mit den strukturierten Seiten nach oben in eine Plasma-Kammer.

Behandeln Sie das Gerät mit Sauerstoff-Plasma bei einem Millibar für 60 Sekunden in einem 300-Watt-Plasmareiniger. Entfernen Sie anschließend die Proben und benetzen Sie die Oberfläche des nicht ausgehärteten PDMS-Stücks mit einem Tropfen destilliertem Wasser, um als vorübergehende Gleitmittel beim Betrachten des Geräts durch ein Stereomikroskop zu dienen. Bringen Sie die plasmabehandelten Oberflächen zusammen und schieben Sie die Oberflächen so lange gegeneinander, bis eine mechanische Verriegelung erreicht ist.

Wenn die vertieften Rahmen und die hervorstehenden Rahmen zusammengesetzt sind, das Gerät nach dem Zusammenbau in einen Ofen bei 60 Grad Celsius stellen und zwei Tage lang aushärten lassen, um das Wasser zu verdampfen und die Bindung abzuschließen. Anschließend das zusammengebaute Gerät mit mehreren Tropfen ungehärtetem PDMS auf einem Objektträger befestigen und das Konstrukt eine Stunde lang in einem Ofen bei 60 Grad Celsius aushärten lassen. Zum Aushärten des PDMS den mikrofluidischen Chip auf dem Objekttisch eines invertierten Mikroskops platzieren, das mit einer Digitalkamera gekoppelt ist, die Verschlusszeiten von mindestens 100 Mikrosekunden ermöglicht.

Befestigen Sie anschließend drei 10-Milliliter-Spritzen an Spritzenpumpen und setzen Sie 27-Gauge-Nadeln an jede Spritze auf. Verbinden Sie etwa 30 Zentimeter PE-2-Schlauch an jede Nadel und führen Sie die offenen Enden der Schläuche in die entsprechenden eingestanzten Löcher des Geräts ein. Führen Sie danach ein 10 Zentimeter langes Stück PE-2 in die Austrittsöffnung des Geräts ein und platzieren Sie das andere Ende in einem Abfallbehälter.

Bringen Sie das Gerät nach der Einrichtung in Betrieb, indem Sie die Spritzenpumpen mit hohen Geschwindigkeiten laufen lassen. Stoppen Sie die Pumpen. Sobald die Flüssigkeit in den Schlauchabschnitten die Einlassöffnungen des Geräts erreicht hat, fokussieren Sie das Mikroskop auf den Bereich des Chips, der eine 50 mal 50 Mikrometer große Öffnung enthält, und justieren Sie das Bild so, dass der stromabwärts gelegene Ausgangskanal eingeschlossen ist.

Stellen Sie die Spritzenpumpen so ein, dass sie die Flüssigkeit mit einer Durchflussrate von 250 µL/h für die innere Phase, 100 µL/h für die mittlere Phase und 700 µL/h für die kontinuierliche Phase an den Doppelmulsionserzeuger liefern. Warten Sie 10 Minuten, damit sich das System einstellen kann.

Als Nächstes erhöhen Sie die Durchflussrate der äußeren Phase auf 1050 Mikroliter pro Stunde. Warten Sie weitere drei bis fünf Minuten, bis die Erzeugung der Doppel-Emulsionen unter diesen Durchflussbedingungen stabil ist. Sobald die Stabilität erreicht ist, nehmen Sie fünf Sekunden Videobilder mit 30 Hertz auf.

Speichern Sie die Videos zur Offline-Verarbeitung durch manuelle Bildanalyse. Wiederholen Sie diesen Vorgang, während Sie die Strömungsgeschwindigkeit der äußeren Phase unter Verwendung der in Tabelle eins des begleitenden Textprotokolls angegebenen Werte variieren. Halten Sie die Geschwindigkeiten der inneren und mittleren Phase konstant.

Während dieses Prozesses wurde die Doppelmulsionseinrichtung unter verschiedenen Strömungsbedingungen getestet. Um die Bildung von Doppelmulsionen mit unterschiedlichen Größen und mono-disperser Verteilung zu demonstrieren, ist das Verhältnis der kontinuierlichen Phase zur Summe der inneren und mittleren Phase über jedem Bild angegeben. Histogramme der Tröpfchendurchmesser für ausgewählte Strömungsverhältnisse zeigen die relative Gleichförmigkeit der erzeugten Tröpfchengrößen.

Die resultierenden Doppel-Emulsionen weisen eine durchschnittliche Variationskoeffizient des Durchmessers von 5,2 % auf. Die Vorrichtung zeigt die Fähigkeit, Doppel-Emulsionen zu bilden, die deutlich kleiner sind als die Öffnungsweite, und weist einen klaren abnehmenden Trend mit steigenden Durchflussverhältnissen auf. Bei dem höchsten getesteten Trägerphasen-Durchfluss entstanden 14 µm große Doppel-Emulsionen unter Verwendung der 50 mal 50 µm großen Öffnung nach der Entwicklung. Diese Technik eröffnet chemischen und biologischen Forschern den Weg, Tropfen-Mikrofluidik-Experimente durchzuführen, die mit gängigen Detektionsplattformen der Durchflusszytometrie kompatibel sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mikrofluidische Generatoren für Doppel-Emulsionen herstellt und testet, die einfache, ausschließlich aus PDMS bestehende Konstruktionsmethoden verwenden.