Co-Kultur des Lebens Microbiome mit mikro humanen intestinalen Villi in ein Gut-on-a-Chip-Mikrofluidik-Vorrichtung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, das Wachstum von Darmzotten menschlicher Darmzellen unter peristaltikähnlichen Bewegungen und Flussbedingungen in einem Darm-auf-einem-Chip-Mikrofluidiksystem zu demonstrieren sowie zu zeigen, wie diese Zellen gemeinsam mit einem lebenden Darmmikrobiom kultiviert werden können. Diese Methode kann daher dabei helfen, zentrale Fragestellungen auf den Gebieten der Gastroenterologie, klinischen Mikrobiologie und pharmazeutischen Wissenschaften zu klären, indem sie zur Aufklärung von Krankheitsmechanismen sowie zur Validierung der Wirksamkeit und Toxizität neuer Wirkstoffverbindungen beiträgt. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass Forschende mittels eines mikrophysiologischen Systems in vitro ein lebensfähiges und funktionales Post-Mikrobiom-Ökosystem des menschlichen Darms etablieren können.

Die Auswirkungen dieser Technik können sich auf Erkrankungen wie Colitis ulcerosa oder Morbus Crohn erstrecken, da die stabile Kokultur der Wirtszellen mit dem Mikrobiom die Komplexität dieser Erkrankungen nachahmen kann. Obwohl diese Methode Einblicke in die komplexen Wechselwirkungen zwischen dem Darmmikrobiom und dem Immunsystem im Darm ermöglicht, kann sie auch auf andere Organsysteme angewendet werden, in denen Wirt-Mikrobe-Interaktionen stattfinden, wie beispielsweise die Haut, der Genitaltrakt oder die Mundhöhle. Beginnen Sie damit, das Darm-auf-einem-Chip-Mikrofluidikgerät gemäß der beigefügten textbasierten Anleitung vorzubereiten.

Die Vorrichtung besteht aus einem transparenten, gasdurchlässigen Silikonpolymer, das zwei parallele Mikrokanäle enthält, die durch eine flexible, poröse PDMS-Membran getrennt sind. Auf jeder Seite der Kanäle befinden sich Vakuumkammern, die zur Aufbringung zyklischer mechanischer Dehnung verwendet werden können. Sterilisieren Sie die Vorrichtung, indem Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze 70 %igen Ethanol durch die Kanäle leiten.

Anschließend das Gerät über Nacht in einem trockenen Ofen bei 60 Grad Celsius trocknen. Am nächsten Tag das Darm-auf-einem-Chip-Mikrosystem zusammen mit den angeschlossenen Schläuchen gleichzeitig 40 Minuten lang UV-Licht und Ozon aussetzen. Das Gerät abkühlen lassen, während es weiterhin 15 Minuten lang im UV-Licht eines Sicherheitswerkbanks steht.

Als Nächstes 100 Mikroliter einer Lösung mit kodierender extrazellulärer Matrix in eine Ein-Milliliter-Spritze aufziehen und in den oberen Mikrokanal des Geräts abgeben. Diesen Vorgang wiederholen, um auch den unteren Mikrokanal zu beschichten. Die gesamte Einrichtung für eine Stunde in einen bei 37 °C befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 stellen.

Während der Inkubation entgasen Sie das vorgewärmte vollständige Kulturmedium, indem Sie es eine Minute lang durch einen 0,45-Mikron-Filter in einem 50-Milliliter-Filtrationssystem leiten. Klopfen Sie vorsichtig eine Minute lang auf das filtrierte Medium, um eventuelle Blasen oder gelöste Gase aus dem Medium zu entfernen. Überführen Sie dann das entgaste, vollständige Medium in zwei Einwegspritzen mit je drei Milliliter und inkubieren Sie die Spritzen eine Stunde lang.

Verbinden Sie als Nächstes die Spritzen mit den oberen und unteren Mikrokanälen des Darm-auf-einem-Chip und spülen Sie die Codierungslösung aus, indem Sie komplettes Medium mit einem sanften Puls in die oberen und unteren Mikrokanäle leiten. Anschließend leiten Sie mit einer Spritzenpumpe entgastes, komplettes Zellkulturmedium in den oberen Mikrokanal des Geräts, während Sie den Chip über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren. Gewinnen Sie Zellen aus einem vollständig konfluenten T75-Fläschchen mit Caco-2-Darmepithelzellen, indem Sie die Zellen zunächst mit 10 Milliliter kalzium- und magnesiumfreier PBS spülen.

Anschließend das PBS abpipettieren und die Spülung noch zweimal wiederholen. Danach ein Milliliter 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und das Kolben für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sobald die Zellen sich gelöst haben, 10 Milliliter vorgewärmtes vollständiges Zellkulturmedium hinzufügen und die Zellsuspension drei bis fünf Mal auf und ab pipettieren, bevor sie in ein Zentrifugenröhrchen überführt wird.

Zentrifugieren Sie die Zellsuspension. Anschließend entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in vorerwärmtem vollständigem Medium bei einer Dichte von 150.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Geben Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension in eine Einwegspritze mit einem Volumen von einem Milliliter, die mit einer 25-Gauge-, 5/8-Zoll-Nadel ausgestattet ist.

Danach 100 Mikroliter der Zellsuspension über die Auslassschlauchleitung in den oberen Mikrokanal geben. Anschließend alle Ein- und Ausgänge, die mit dem oberen und unteren Mikrokanal verbunden sind, mit Büroklammern verschließen. Die gesamte Apparatur eine Stunde lang inkubieren, damit die intestinalen Epithelzellen an der Oberfläche der porösen Membran haften können.

Entfernen Sie dann die Klemmen und verbinden Sie den Schlauch des oberen Kanals mit einer auf einer Spritzenpumpe befestigten Spritze, die mit Kulturmedium gefüllt ist. Setzen Sie den Fluss des Kulturmediums in den oberen Mikrokanal mit 30 Mikrolitern pro Stunde fort, bis die Zellen eine intakte Monolayer bilden. Sobald die Zellen eine Monolayer gebildet haben, verbinden Sie den unteren Kanal mit der zweiten Spritze und perfundieren Sie das Kulturmedium mit derselben Flussrate von 30 Mikrolitern pro Stunde sowohl in den oberen Lumen als auch in die unteren kapillaren Mikrokanäle.

Um eine peristaltische Bewegung im Chip zu erzeugen, schalten Sie zunächst die Vakuumpumpe ein. Verbinden Sie die Vakuumkammern des Geräts über Schläuche mit einem Edelstahlverbinder mit dem Vakuumregler. Stellen Sie anschließend den Regler so ein, dass er eine zyklische Dehnungsbewegung erzeugt, die 10 % der mittleren Zelldehnung bei einer Frequenz von 0,15 Hertz beträgt, und klicken Sie dann auf Start.

Kulturmedium kontinuierlich sowohl in die oberen als auch in die unteren Mikrokanäle bei mechanischen Verformungen für mindestens 80 Stunden leiten, um das Wachstum von Darmzotten zu induzieren. Eine 50/50-Mischung aus autoklaviertem Lactobacilli-MRS-Brühe und verstärktem Clostridial-Medium herstellen. Anschließend eine gefriergetrocknete probiotische Bakterienmischung in 10 Milliliter der Mischung resuspendieren.

Messen Sie die optische Dichte des Gemischs bei 600 Nanometern und stellen Sie die endgültige Zelldichte auf etwa 0,2 optische Dichte-Einheiten ein. Portionieren Sie drei Milliliter der angepassten mikrobiellen Zellsuspension in sterile, wegwerfbare 10-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie die Aliquots in einen anaeroben Behälter und geben Sie zwei Packungen anaerober Gasgenerierungsbeutel in den Behälter.

Schließen Sie den Behälterdeckel fest und inkubieren Sie die Behälteranordnung über Nacht ohne Schütteln in einem Inkubator. Bereiten Sie anschließend entgastes, antibiotikafreies Zellkulturmedium vor und füllen Sie es in Einwegspritzen mit drei Milliliter Fassungsvermögen. Übertragen Sie das Gut-on-a-Chip-Gerät, das mikroengineeringbasierte Darmzotten enthält, in den Sicherheitswerkbank.

Entfernen Sie die Spritzen, die mit den oberen und unteren Mikrokanälen des Geräts verbunden sind, und ersetzen Sie sie durch Spritzen, die entgaste, antibiotikafreie Zellkulturmedien enthalten. Danach stellen Sie das Gerät wieder in den CO2-Inkubator. Lassen Sie anschließend das antibiotikafreie Kulturmedium 12 Stunden lang durch das Gerät fließen, bevor Sie das Mikrobiom einbringen.

Als Nächstes zentrifugieren Sie die vorkultivierte Mischung aus probiotischen Bakterienzellen ab. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Bakterien in antibiotikafreiem DMEM. Geben Sie etwa 100 Mikroliter dieser Zellsuspension in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Gauge-, 5/8-Zoll-Nadel verbunden ist.

Die Bakterien in die Lumen-Seite des Mikrokanals einführen, der zuvor keimfreie Darmzotten enthält. Die mikrobiellen Zellen eineinhalb Stunden lang ohne Fluss durch Klemmen der Schläuche an der apikalen Oberfläche der Darmzotten anhaften lassen. Anschließend das vorerwärmte antibiotikafreie Kulturmedium mit einem zyklischen, rhythmischen Deformationsmuster mit 40 Mikrolitern pro Stunde in beide Mikrokanäle – den oberen und den unteren – perfundieren.

Dieses Kokultivierungsprotokoll ermöglicht die stabile Kolonisation mehrerer Arten probiotischer Bakterien im intervillosen Raum. Lebende bakterielle Mikrokolonien können bis zu zwei Wochen im Kokultiv erhalten bleiben. Dargestellt ist hier ein anderes Kokultiv, das sowohl GFP-markierte E. coli als auch Darmzotten enthält.

Die Vergrößerung mit hoher Leistung zeigt deutlich die Lage bakterieller Mikrokolonien zum Zeitpunkt von 72 Stunden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Kulturmedium vorsichtig und langsam in die mikrofluidischen Kanäle zu injizieren, um die epitheliale Zellschicht in den frühen Phasen der Kultur nicht zu beschädigen. Basierend auf dieser Methode kann eine Kokulturmethode mit menschlichen Immunzellen ebenfalls Hinweise darauf liefern, wie das Mikrobiom mit dem Immunsystem interagiert und die Homöostase sowie die optimale Darmgesundheit beeinflusst.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Mikroumfeld des menschlichen Darms rekonstituiert und nachweist, dass eine Kokultur zwischen dem Mikrobiom und den menschlichen Darmzotten in vitro möglich ist. Das Arbeiten mit pathogenen Bakterien und menschlichen Zellen ist äußerst gefährlich, daher vergessen Sie nicht, in einer Sicherheitswerkbank zu arbeiten.