Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, schräge Schnitte des Rückenmarks zu präparieren, die die Stimulation der ventralen Wurzeln ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die motoneurale Identifizierung für die ventrale Wurzelstimulation und die Untersuchung der ventralen Zellen ermöglicht, die durch motoneurale Axonkollateralen enerviert werden. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir eine zuverlässige Methode zur Stimulation ventraler Zellen brauchten.

mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, werden Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, die verschiedenen Schritte der Sektion richtig auszuführen. Beginnen Sie mit der Perfusion einer P2- bis P11-Maus mit natriumarmem ACSF. Nachdem Sie die Maus enthauptet und die Haut auf dem Rücken entfernt haben, machen Sie zwei Schnitte durch die Schultern und den Brustkorb hinunter.

Schneiden Sie dann das Rückenmark im kaudalen Bereich so tief wie möglich ab, um die Wirbelsäule und die Rippen vom unteren Teil des Tieres zu isolieren. Drehen Sie die Wirbelsäule um und entfernen Sie die Eingeweide, die noch an den Rippen befestigt sind. Übertragen Sie die Wirbelsäule in eine andere kleinere, mit Silikon gefüllte Petrischale.

Fügen Sie kaltes ACSF hinzu und blasen Sie es mit einem Carbogen und halten Sie das Gewebe mit vier Insektennadeln mit der Rückenseite nach oben. Führen Sie dann eine Laminektomie der dorsalen Seite durch, indem Sie zuerst die Spitze einer feinen Schere zwischen den Knochen und das Rückenmark einführen und den Knochen vom rostralen Ende abschneiden, wobei Sie darauf achten, dass Sie sich von der weißen Substanz fernhalten. Wechseln Sie die Schnitte auf jeder Seite ab, während Sie das bereits abgeschnittene Knochenband mit einer Pinzette festhalten.

Als nächstes heben Sie die Dura mit einer kleinen Pinzette an und schneiden mit einer kleinen Schere entlang des rostralen kaudalen Zugangs auf beiden Seiten. Die Entfernung der Dura ist ein kritischer Schritt. Es lohnt sich, ein paar zusätzliche Minuten zu investieren, um dies gründlich zu tun.

Sobald die Dura entfernt ist, schiebe die Schnur mit einer stumpfen Glasspitze vorsichtig auf die linke Seite der Rinne, die von der halb geschnittenen Wirbelsäule gebildet wird. Schneiden Sie dann die ventralen und dorsalen Wurzeln auf der hellen Seite so weit wie möglich von der Stelle ab, an der sie in die Nabelschnur eintreten. Wiederholen Sie die Operation auf der linken Seite, immer von rostral nach kaudal

Nach der Dissektion schieben Sie das Rückenmark aus der Wirbelsäule. Verwende dann eine kleine Insektennadel, um die Schnur für die Rückenfläche nach oben zu sichern. Entfernen Sie vorsichtig alle Stücke der anhaftenden Membran.

Schneiden Sie nach der Reinigung beide Enden der Nabelschnur ab und führen Sie eine gebogene Insektennadel in den vorderen Teil der Nabelschnur ein, um ihre Ausrichtung zu markieren. Übertragen Sie dann das Rückenmark in eine eiskalte intrazelluläre Lösung. Als nächstes kühlen Sie das zuvor vorbereitete geschmolzene Agar auf einer Mischung aus Eis und Wasser ab.

Rühren Sie den Agar um, während Sie die Temperatur messen. Wenn die Temperatur des Agars 38 Grad Celsius erreicht, halten Sie das Rückenmark am Insektenstift fest und tauchen Sie es mit der rostralen Seite nach unten in den Agar. Achten Sie darauf, dass das Rückenmark so gerade wie möglich ist, weg von den Wänden, mit dem kaudalen Teil leicht nach oben.

Lassen Sie den Becher in der Mischung aus Eis und Wasser, damit sich der Agar so schnell wie möglich um die Schnur herum verfestigen kann. Schneiden Sie nach der Erstarrung den Agarblock, der das Rückenmark enthält, so ab, dass die Basis des Blocks in einem 35-Grad-Winkel zum lumbalen Teil des Rückenmarks steht. Die dorsale Fläche sollte von der Basis abgewandt sein.

Kleben Sie den Block mit Cyanacrylatkleber in die Kammer des Vibratoms. Es ist wichtig, den Block korrekt zu montieren, um die Kontinuität der Fuhrparks mit den ventralen Wurzeln, aus denen sie austreten, zu erhalten. Tauchen Sie den Block in Kaliumgluconatlösung.

Legen Sie die Vibrationsparameter fest. Schneiden Sie anschließend 350 400 Mikrometer dicke Scheiben der Lendenwirbelsäule, die an ihrer Krümmung und ihrem größeren Durchmesser erkennbar ist. Übertragen Sie die geeigneten Scheiben bei 34 Grad Celsius auf ACSF.

Typischerweise gibt es vier bis fünf geeignete Scheiben mit ventralen Wurzeln, die sich über zwei Millimeter oder mehr erstrecken. Nach ca. 30 Minuten bei 34 Grad Celsius kühlen Sie die Scheiben auf Raumtemperatur ab und beginnen Sie dann mit der Aufnahmesitzung. Bereiten Sie im Voraus eine Schachtel mit verschiedenen Pipetten mit Spitzendurchmessern von 40 bis 170 Mikrometern vor.

Um die Schnittpipetten vorzubereiten, wählen Sie Pipetten mit einer langen Tapure. Machen Sie dann mit einem Diamantmesser Schnitte an verschiedenen Positionen und brechen Sie unter einem Präpariermikroskop jede Pipette, indem Sie mit einer Pinzette auf die Spitze schlagen. Nehmen Sie anschließend die Kammer aus dem Aufnahmemikroskop und legen Sie sie unter ein Präpariermikroskop.

Wählen Sie eine Scheibe, die eine ventrale Wurzel enthält, die lang genug ist, um auf eine Saug- und Stimulationselektrode montiert zu werden. Montieren Sie die Scheibe, richten Sie sie mit den ventralen Wurzeln nach oben aus, schneiden Sie dann den Agar vorsichtig um die ventralen Wurzeln herum, während Sie den Rest des Agars um die Scheibe herum belassen, und platzieren Sie das Gitter, um die Probe nach unten zu halten. Montieren Sie die Kammer wieder auf das Mikroskop und perfundieren Sie die Aufnahmekammer kontinuierlich mit ACSF mit einer Geschwindigkeit von ein bis zwei Millilitern pro Minute bei Raumtemperatur.

Saugen Sie mit einer Glaspipette, die mit ACSF gefüllt und mit einer Spritze verbunden ist, an einer der ventralen Wurzeln. Um eine gute Stimulation der ventralen Wurzel zu erreichen, muss die Pipettenspitze eng um die ventrale Wurzel herum liegen. Erzielen Sie eine Patch-Clamp-Aufzeichnung des gewünschten Zelltyps und erfassen Sie die Wirkung der ventralen Wurzelstimulation, wie zuvor beschrieben.

Dieses Bild zeigt die Ergebnisse der Voltage-Clamp-Aufnahme. Die Aufnahmen der oberen Panels stammen von anderen Motoneuronen als die in den unteren Panels. Das obere Bild zeigt die antidrome Reaktion eines Motoneurons auf eine Ein-Volt-Stimulation in Rot und eine Fünf-Volt-Stimulation in Schwarz.

Die untere Spur zeigt die Reaktion des orthodromischen Aktionspotentials auf eine 20-Volt-Stimulation in rot und eine 30-Volt-Stimulation in schwarz. Schwarze Punkte zeigen das Timing des Stimulus an. Die doppelten Pfeilspitzen betonen den Unterschied in den Latenzen zwischen ortho- und antidromen Spikes.

Hier werden Aufzeichnungen von Stromzangen gezeigt. Das obere Feld zeigt die antidrome Reaktion auf 10-Volt- und 15-Volt-Stimulationen in Rot bzw. Schwarz. Das untere Feld zeigt die orthodrome Reaktion auf 25- und 40-Volt-Stimulationen in Rot bzw. Schwarz.

Auch hier werden der Zeitpunkt des Stimulus und die Unterschiede in den Latenzen angegeben. Dieses Bild des Renshaw-Zellenpools wurde mit einem schrägen Kondensator und einem 20-fach-Objektiv aufgenommen. Beachten Sie die Motoneuron-Axone, die in die ventrale Wurzel übergehen, wie durch den Pfeil dargestellt.

Dieses Bild der gleichen Region wurde mit einem 40-fach-Objektiv aufgenommen. Mutmaßliche Renshaw-Zellen sind mit Pfeilspitzen gekennzeichnet. Hier ist eine Voltage-Clamp-Aufnahme einer Renshaw-Zelle nach Stimulation der ventralen Wurzel zu sehen, gekennzeichnet durch den schwarzen Punkt.

QX-314 in der intrazellulären Lösung verhinderte das Feuern der Zelle und die Glycin- und Gaba-Reaktionen wurden durch 3 mikromolare Gabazin bzw. ein mikromolares Strychnin blockiert. Die rote Spur ist der Durchschnitt der grauen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 oder 30 Minuten durchgeführt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Präparat immer in kaltem Medium aufzubewahren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie schräge Schnitte des Rückenmarks vorbereiten, die für die ventrale Wurzelstimulation geeignet sind. Die ventrale Wurzelstimulation kann verwendet werden, um die motoneurale Identität leicht zu bestätigen und, was noch wichtiger ist, um die ventralen Zellen zuverlässig zu stimulieren.