Name: Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Präparation schräger Rückenmarkschnitte zur Ventralwurzel-Stimulation bei jungen Mäusen. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Identifizierung von Motoneuronen und die Untersuchung ventraler Zellen.

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Die Autoren danken Marin Manuel und Olivia Goldman-Szwajkajzer für ihre Hilfe in den Fotos zu machen. Die Autoren danken auch Arjun Masukar und Tobias Bock für das Manuskript Korrektur. Finanzielle Unterstützungen wurden von der Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401) zur Verfügung gestellt, das NIH-NINDS (R01NS077863), die Thierry Latran Foundation (OHEX Project), die Französisch Verband für Myopathie ( Grant-Nummer 16026) und Target ALS sind dankbar anerkannt. Felix Leroy war der Empfänger einer &quot;Contrat Doctoral&quot; von der Ecole Normale Supérieure, Cachan.

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Richtlinien (86/609 / CEE und 2010-63-UE) und Französisch Gesetzgebung durchgeführt und wurden von der Universität Paris Descartes Ethikkommission genehmigt. 1. Spinal Cord Scheibe Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen täglich oder einen Tag im Voraus. Wenn über Nacht, Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 gehalten und in fest verschlossenen Flaschen gekühlt halten. <ol><li> Bereiten Low Na + künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (ACSF): 3 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 230 mM Sucrose, 26 mM NaHCO 3, 0,8 mM CaCl 2, 8 mM MgCl 2, 25 mM Glucose, 0,4 mM Ascorbinsäure, 1 mM Na-Kynurenat, 2 mM Na-Pyruvat. Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 (pH 7,4). Da Na-Kynurenat oft schwer zu lösen, stellen Sie sicher, das in der Tabelle aufgeführten Materialien zu kaufen. </li><li> Bereiten K-Gluconat solution: 130 mM K-Gluconat, 15 mM KCl, 0,05 mM EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM Glucose, 1 mM Na-Kynurenat, 2 mM Na-Pyruvat, eingestellt auf pH 7,4 mit KOH. </li><li> Bereiten ACSF: 130 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, 25 mM Glucose, 0,4 mM Ascorbinsäure, 2 mM Na-Pyruvat. Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 (pH 7,4). </li><li> Vor dem Beginn der Dissektion, lösen sich 2% Agar in 80 ml der K-Gluconat-Lösung und halten bei 60 ° C warm. </li></ol></li><li> intrakardialer Perfusion <ol><li> Führen Sie diese Vorbereitung auf die weiblichen und männlichen Mäusen im Alter von P2 bis P11. </li><li> Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 0,1 ml 25 mM Natrium-Pentobarbital (50 mg / kg). </li><li> Mit Nadeln oder Klebeband, immobilisieren die Maus auf dem Rücken auf einer großen Petrischale mit Silikon gefüllt. Verwenden Sie ein Sezieren microscope für den Rest der Präparation. </li><li> Halten Sie die Spitze des Brustbeins, heben Sie die Brust und schneiden Sie die Membran mit einer feinen Schere. Dann öffnen Sie die Brust auf beiden Seiten, indem sie durch die Rippen schneiden das Herz aussetzen. </li><li> Schneiden Sie den rechten Vorhof vor den linken Ventrikel mit einer 27G Nadel Punktierung. </li><li> Perfuse mit eiskaltem niedrigen Na + ACSF. Nach 30 sec, sollte eine niedrige Na + ACSF aus dem Atrium fließen zu sehen. Geringe Mengen an Natrium verhindern, dass die Zellen, die aus Spick und Zelltod bei der Präparation zu reduzieren. </li><li> Halten Sie die Nadel im Herzen unter dem Binokular halten, bis die Leber gelb wird, wenn das Blut abgelassen wird. </li></ol></li><li> Rückenmark Dissektion <ol><li> Enthaupten das Tier und legte es auf seinen Bauch. </li><li> Entfernen Sie schnell , die Haut des Rückens (Abbildung 1A1). Machen Sie zwei Schnitte durch die Schultern und hinunter den Brustkorb (Abbildung 1A2). Dann schneiden Sie die Schnur als low wie möglich in der kaudalen Abschnitt, um die Wirbelsäule mit dem Beginn der Rippen aus dem unteren Teil des Tieres zu isolieren. Drehen Sie das Tier wieder und entfernen Sie die Eingeweide noch an den Rippen befestigt. </li><li> Übertragung der Wirbelsäule zu einer anderen, kleineren Silizium gefüllte Petrischale und benutzen 4 insect pins es dorsalen Seite nach oben (Figur 1A) zu halten. </li><li> Kontinuierlich perfundieren das Tier mit Carbogen blasigen ACSF (bei etwa 4 ° C) , während eine Laminektomie der dorsalen Seite durchgeführt wird , und Aussetzen des Rückenmarks von der rostralen Ende (1B). Dazu legen Sie die Spitze der feinen Schere zwischen dem Knochen und dem Rückenmark und schneiden den Knochen nach und nach aus dem rostralen Ende, um sicherzustellen, von der weißen Substanz zu bleiben weg. Alternate auf jeder Seite , während mit einer Pinzette die Band von Knochen bereits geschnitten (Abbildung 1B1) fern zu halten. </li><li> Unter Verwendung der kleinsten Feder Schere und Pinzette, heben Sie die Dura und schneidenbeide Seiten auf, während Sie die lose Teil der Dura, um mit der Schere eine Beschädigung des Rückenmarks zu vermeiden. Schneiden Sie entlang der rostro-caudale Achse. HINWEIS: Die Dura ist eine halb transparente kontinuierliche Membran; in diesem Alter ist die pia mater zu zerbrechlich und wird während der Präparation und Slicing (Abbildung 1B2) kommen auseinander. </li><li> Sobald die Dura ein stumpfes Glas oder Kunststoffspitze entfernt verwendet wird vorsichtig auf die Schnur auf der linken Seite des von der Halbschnitt Wirbelsäule gebildet Nut schieben, und schneiden Sie die ventralen und dorsalen Wurzeln auf der rechten Seite, von der rostralen Seite beginnen , am weitesten von wo aus sie die Schnur (wenige mm zumindest Abbildung 1B2) eingeben. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang auf der linken Seite, gehen immer von rostral nach kaudal. Wenn linkshändig, von der linken Seite beginnen und dann auf die rechte Seite zu bewegen. </li></ol></li><li> Die Einbettung in Agar <ol><li> Schieben Sie die Kabel aus der Wirbelsäule. Verwenden Sie einen kleineren Insektenstift festzunagelndie Schnur mit der Rückenfläche nach oben und zart jedes Stück Membran noch daran (Abbildung 1C1) angebracht entfernen. </li><li> Einmal gereinigt, schneiden beide Enden (Abbildung 1C2). Fügen Sie ein gebogener Insektenstift im vorderen Teil der Schnur der Schnur zu manipulieren und beachten Sie seine Ausrichtung (Pfeil in Abbildung 1C2). Dann übertragen das Rückenmark zu einer eiskalten K-Gluconatlösung. HINWEIS: Diese Lösung ahmt die intrazelluläre Zusammensetzung des CSF und die Zellen vor dem Absterben des osmotischen Schock verhindern , sobald die Motoneuronen 26 geschnitten wird. </li><li> Sobald das Rückenmark innerhalb der intrazellulären Lösung ist, nehmen Sie den Becher mit dem Agar aus dem trockenen Bad und kühlen sie auf eine Mischung aus Eis und Wasser. </li><li> Halten Sie Rühren, während die Temperatur zu messen. Wenn die Temperatur 38 ° C erreicht das Rückenmark tauchen, es durch das Insekt Stift halten und legen Sie sie nach unten rostralen Seite. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark ist als straight wie möglich weg von den Wänden, Schwanz- Teil leicht nach oben (Abbildung 1D1). </li><li> Verlassen das Becherglas in das Gemisch aus Eis und Wasser das Agar zu ermöglichen, so schnell wie möglich zu verfestigen. Stellen Sie sicher , dass es an seinem Platz bleibt und dass das Kabel so gerade wie möglich (Abbildung 1D1) ist. </li></ol></li><li> Slicing <ol><li> Nach dem Erstarren schneiden den Agarblock das Rückenmark in der Weise , dass die Basis des Blocks in einem 35 ° Winkel mit dem Lendenteil des Cords (Pfeil in Figur 1D2) enthält. Die dorsale Oberfläche sollte entfernt werden , mit Blick auf von der Basis (Abbildung 1D2). Hinweis: Dies ist ein kritischer Schritt in dem Verfahren zum Aufrechterhalten der Kontinuität der Motoneuron-Pools zu den ventralen Wurzeln, von dem sie zu verlassen. </li><li> Kleben Sie den Block in die Kammer des Vibratom mit Sekundenkleber. Tauchen sie in K-Gluconatlösung und fügen Sie slushed gefrorenen K-Gluconatlösung zu haltendas Bad (unter 2 ° C) gekühlt. </li><li> Schneiden Sie 350 bis 400 &amp; mgr; m dicke Scheiben der Lendengegend (erkennbar durch ihre Krümmung und mit größerem Durchmesser). In der richtigen Ausrichtung (siehe 1.4.1.), Verwenden Sie die Klinge von der dorsalen auf der ventralen Oberfläche zu schneiden und Scheiben kontinuierlich mehr rostral machen. Typischerweise gibt es 4-5 geeignete Scheiben mit ventral Wurzeln erstreckt 2 mm oder mehr. Verwenden Sie die folgenden Parameter: 10 ° Winkel, 70 Hz Schwingungsfrequenz und 10 mm / min Geschwindigkeit des Schneidens. </li></ol></li><li> Die Inkubation <ol><li> Übertragen Sie die Scheiben zu ACSF bei 34 ° C. Nach ca. 30 min, kühlen die Scheiben bis auf RT und die Aufnahme-Session beginnen. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> Abbildung 1. Dissection A1:. Die Entfernung der Haut des Rückens der dorsalen Säule zu belichten A2:Schneiden der Schultern und Rippen der dorsalen Säule frei B1:. Vertebrale Spalte auf die Silizium-gefüllte Petrischale gepinnt (dorsalen Seite nach oben, kaudal links) B2:. Gleiche mit dem Rückenmark ausgesetzt und seziert C1:. Rückenmark isoliert . (rostralen Seite links) C2: Rückenmark bereit eingebettet werden (Bauchseite nach oben, rostralen Seite links). Notieren Sie sich die kleineren Insektenstift an der rostralen Seite D1:.. Rückenmark im Agar - Becher (rostralen Seite dow, Bauchseite gegenüber dem Boden) D2: Cut Agar - Block mit dem eingebetteten Rückenmark. Notieren Sie sich die 35 ° Winkel der Rückenmark bildet mit der Basis des Blocks und der Lendenanschwellung (Pfeil). Maßstabsbalken 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Platzieren der Scheibe in die Kammer HINWEIS: Ventral Wurzeln sind von unterschiedlicher Größe. <ol><li> Bereiten Sie eine Schachtel mit verschiedenen Pipetten mit Spitzendurchmessern von 40 bis 170 &amp; mgr; m im Voraus reichen. Zur Vorbereitung Saugpipetten, bereiten viele Pipetten mit einer langen Verjüngung. Mit einem Diamantmesser, machen einen Schnitt an verschiedenen Positionen. Dann unter einem Binokular, brechen sie durch die Spitze mit einer Pinzette zu schlagen. </li><li> Entfernen Sie die Kammer von der Aufnahme Mikroskop und legen Sie sie unter einem Binokular. </li><li> Wählen einer Scheibe, die einen ventralen Wurzel von ausreichender Länge enthält (2 mm oder mehr) auf eine Nutsche Stimulationselektrode angebracht zu werden. Wählen Sie die richtige Ausrichtung der Scheibe mit den ventralen Wurzeln nach oben (2A) und schneiden Sie vorsichtig die Agar um die ventralen Wurzeln , während der Rest des Agar verlassen um die Scheibe (2B). Hinweis: Da der Agar fester als die Scheibe ist, wird dies die Gewinde des Ankers Scheibe ermöglichen, sich auf dem Agar zu ruhen und nicht auf der Scheibe und damit die anchor wird das Gewebe nicht schädigen. Stellen Sie sicher , dass die Fäden des Ankers Scheibe oberhalb der Motoneuron - Pool (in rot in 2C gezeigt). </li><li> Montieren Sie die Kammer wieder auf das Mikroskop und kontinuierlich die Aufnahmekammer perfuse mit ACSF mit einer Rate von 1 bis 2 ml / min bei RT. Verwendung einer Glaspipette mit ACSF gefüllt und mit einer Spritze verbunden, saugen einen der ventralen Wurzel (Pfeil in Figur 2C). Um eine gute Stimulation des ventralen Wurzel zu erreichen, muss die Pipettenspitze um den ventralen Wurzel dicht sein. Einen Pol sollte in der Stimulationselektrode und die andere in dem Bad (oder mit der patch-Klemmelektrode reference). </li><li> Erreichen patch-clamp Aufzeichnung der gewünschten Zelltyp und notieren Sie die Wirkung der ventralen Wurzel Stimulation als previsouly 10 beschrieben. <ol><li> Hier wird ein Verstärker für die Datenerfassung verwendet werden. Filter Ganzzellableitungen bei 3 kHz. Digitalisieren bei 10 kHz. Compensate Brückenwiderstand in current-Clamp-Modus. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ventralwurzel Vorbereitung A: Lendenwirbelscheibe Rückenmark eingebettet in Agar mit der ventralen Wurzel nach oben . B: lumbalen Rückenmark Scheibe mit den ventralen Wurzeln aus dem Agar befreit . C: lumbalen Rückenmark Scheibe mit einer Stimulationselektrode eng um den ventralen Wurzeln (Pfeil) platziert . Beachten Sie die Position der Renshaw - Zellen, die rote Fluoreszenz im CHRNA2-Cre Maus 28 mit der Maus Reporter gekreuzt R26 Tom 17. Maßstabsbalken 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Oblique slicing des Rückenmarks ist wichtig, da es für die einseitige Stimulation der Motoneuron-Pools und Renshaw Zellen in einer einzigen Wirbelsegments in einer zuverlässigen, umfassende und spezifische Weise ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht es eine schnelle, elegante und eindeutige Identifikation von aufgezeichnetem Motoneurone. Als nächstes werden wir die Vorteile dieser Technik im Vergleich zu anderen Scheibe Zubereitungsmethoden zu markieren, und dann werden wir die häufigsten Fallen stressen zu vermeiden, w...

Historisch gesehen , in vivo an großen Tieren wie Katzen oder Ratten Motoneuron Aufnahmen scharf Elektrode 1 wurden durchgeführt , oder auf einem isolierten ganzen Rückenmark in Mäuse 2. Die Entstehung der Patch-Clamp-Aufnahmetechnik in den 1980er Jahren für den direkten Zugriff auf das Motoneuron genannt somas nach Bedarf Abdichtung unter Sichtführung erreicht werden. Somit wurde das Rückenmark slice Zubereitung leicht seit den frühen 1990ern 3 erreicht. Jedoch oft früh slice Zubereitung nicht für die Stimulation der ventralen Wurzeln ermöglichen. Nach bestem Wissen und Gewissen, haben nur zwei Studien erfolgreich Stimulation der ventralen Wurzeln in Querschnitten berichtet, und keiner wurde von den Mäusen 4,5 erhalten. In diesem Artikel stellen wir eine Technik tragfähige Rückenmarksscheiben neugeborenen Mäusen zu erreichen (P2 - P11) in dem die Motoneuron-Pool seiner ventralen Wurzel abzuweichen Axone beibehält. auslassenral Wurzel Stimulation löst antidromic Aktionspotential aus dem gleichen Ventralwurzel zurück in die Somen des Motoneuron-Pool zu verlassen. Es regt auch die Motoneuron Sicherheiten Ziele, andere Motoneuronen 6-10 und die Renshaw - Zellen 11-13. Da nur Motoneurone ihre Axone die ventralen Wurzeln nach unten senden, verwenden wir die Aufnahme von antidromic Aktionspotentiale als eine einfache und sichere Weg um physiologicaly Motoneuronen 10 identifizieren. Neben der Verwendung von potenziell nicht-inclusive oder irreführende elektrophysiologischen und morphologischen Kriterien , um die Motoneuron Identität, die jüngsten Studien über Rückenmark Motoneurone zu bestätigen stützen sich ebenfalls auf mühsame und zeitraubende Post - hoc - Anfärbungen 16. Eine solche Identifizierung wird in der Regel nur durchgeführt mit einer Probe der aufgezeichneten Zellen. Andere Identifikationsstrategien setzen auf Mauslinien, in denen die Motoneurone endogene Fluoreszenz exprimieren <sup&gt; 17-19. Doch bereits in jungen Jahren mit genetisch kodierten Markierungen kann schwierig sein, wenn Markerexpression noch variabel ist oder wenn die Studie erfordert bereits eine transgene Mauslinie verwendet wird. Alternativ kann antidrome Aktionspotentialaufzeichnungen routinemäßig auf allen Mäusen vom Beginn der Zellaufnahme erfolgen. Experimentatoren arbeiten an intakten Rückenmark Vorbereitungen bei der Katze, Ratte und Maus haben zuverlässig solche Identifikationstechniken seit den 1950er Jahren 1,2,20,21 verwendet. Bei optimalen Bedingungen konnten wir antidromic Aktionspotentiale aus praktisch alle aufgenommenen Motoneurone zu entlocken. Darüber hinaus können Ventralwurzel Stimulation verwendet werden , um zuverlässig andere Motoneurone 22,23 oder ihre Ziele begeistern. die Renshaw Zellen 10,24,25. Wir präsentieren hier Anwendungen der Ventralwurzel Stimulation in Form von antidromic Aktionspotential Aufnahmen von Motoneuron somas sowie Anregung von Renshaw Zellen.

<table><tbody><tr><td>Na-Kynurenat</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>löst sich besser auf als andere Marken</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>G Biowissenschaften</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Qualität Biologisch</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>Glukose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-Gluconat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomon</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>Gluconsäure</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cäsiumhydroxid Lösung</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere - 2.5mm&nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>nur zum Schneiden der Dura verwenden, kann beim Schneiden von Knochen beschädigt werden</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>A-M Systems</td><td>Isolierter Impulsstimulator Modell 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden</td><td>Vibrierendes Mikrotom 7000 - Modell 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

die herstellung von oblique spinal cord slices für ventralwurzel stimulation

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Elektrophysiologische Aufnahmen von Rückenmark Scheiben haben sich als wertvolle Technik zu sein, ein breites Spektrum von Fragen zu untersuchen, die von Mobilnetzwerkeigenschaften. Wir zeigen, wie rentabel schräge Scheiben des Rückenmarks von jungen Mäusen herzustellen (P2 - P11). Bei dieser Herstellung behalten die Motoneuronen ihre Axone von den ventralen Wurzel des Rückenmarks kommen aus. Die Stimulation dieser Axone entlockt zurück ausbreitenden Aktionspotentiale der Motoneuron somas und spannend die Motoneuron Kollateralen im Rückenmark eindringen. Aufnahme von antidromic Aktionspotentiale ist eine sofortige, endgültige und elegante Art und Weise Motoneuron Identität zu charakterisieren, die andere Methoden Identifizierung übertrifft. Darüber hinaus ist die Motoneuron Kollateralen stimulierenden eine einfache und sichere Weg, um die Sicherheit Ziele der Motoneuronen im Rückenmark, wie andere Motoneuronen oder R zu erregenenshaw Zellen. In diesem Protokoll stellen wir antidrome Aufnahmen von der Motoneuron somas sowie Renshaw Zellanregung aus ventral root Stimulation.

Bestätigung der Motoneuron Identität Mit antidromen Aktionspotentialen Zell - Targeting Motoneurone sind im ventralen Horn (sichtbar in rot in 2C) gefunden. Starten Sie aus dem Bündel von Axonen der ventralen Wurzel bildet, und gehen bis das Bündel streut voll und man beginnt, große Zellen zu sehen (l...

Wir zeigen, wie schräge Scheiben des Rückenmarks in jungen Mäusen vorzubereiten. Diese Herstellung ermöglicht die Stimulation der ventralen Wurzeln.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, schräge Schnitte des Rückenmarks herzustellen, die eine Stimulation der vorderen Nervenwurzeln ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Identifizierung von Motoneuronen für die Stimulation über die vorderen Wurzeln sowie die Untersuchung der von Motoneuronen-Axonkollateralen versorgten Zellen im Vorderstrang erlaubt. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich aus der Notwendigkeit heraus, eine zuverlässige Möglichkeit zur Stimulation der vorderen Zellen zu finden.Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, werden Schwierigkeiten haben, da die einzelnen Schritte der Dissektion schwer korrekt durchzuführen sind. Beginnen Sie damit, eine P2 bis P11 Maus mit natriumarmer ACSF zu perfundieren. Nachdem die Maus dekapitiert und die Haut am Rücken entfernt wurde, führen Sie zwei Schnitte durch die Schultern und entlang des Rippenbogens nach unten durch.Schneiden Sie dann das Rückenmark so tief wie möglich im kaudalen Bereich durch, um die Wirbelsäule und die Rippen vom unteren Teil des Tieres zu trennen. Drehen Sie die Wirbelsäule um und entfernen Sie die noch an den Rippen anhaftenden Eingeweide. Übertragen Sie die Wirbelsäule in eine andere, kleinere Petrischale, die mit Silikon gefüllt ist.Fügen Sie kaltes ACSF hinzu und sprühen Sie mit Carbogen durch. Halten Sie das Gewebe mit vier Insektennadeln dorsal nach oben. Führen Sie dann eine Laminektomie der dorsalen Seite durch, indem Sie zunächst die Spitze einer feinen Schere zwischen Knochen und Rückenmark einführen und den Knochen vom rostralen Ende aus schneiden, wobei Sie darauf achten, sich vom weißen Mark fernzuhalten. Wechseln Sie abwechselnd die Schnitte auf jeder Seite, während Sie mit einer Pinzette den bereits durchtrennten Knochenstreifen festhalten.Verwenden Sie anschließend kleine Pinzetten, um die Dura zu heben, und kleine Scheren, um entlang der rostrokaudalen Achse auf beiden Seiten zu schneiden. Das Entfernen der Dura ist ein entscheidender Schritt. Es lohnt sich durchaus, einige zusätzliche Minuten aufzuwenden, um dies gründlich durchzuführen.Nachdem die Dura entfernt wurde, verwenden Sie eine stumpfe Glasnadel, um das Rückenmark vorsichtig zur linken Seite der durch die halbierte Wirbelsäule gebildeten Furche zu schieben. Schneiden Sie dann die ventralen und dorsalen Wurzeln auf der hellen Seite so weit wie möglich von ihrem Eintrittspunkt ins Rückenmark entfernt durch. Wiederholen Sie den Vorgang auf der linken Seite, wobei Sie stets von rostral nach kaudal vorgehen.Nach der Dissektion schieben Sie das Rückenmark aus der Wirbelsäule heraus. Befestigen Sie es anschließend mit einer kleinen Insektennadel, sodass die dorsale Seite nach oben zeigt. Entfernen Sie vorsichtig alle anhängenden Membranreste.Nach der Reinigung schneiden Sie beide Enden des Rückenmarks ab und stechen eine gebogene Insektennadel in den vorderen Teil des Rückenmarks, um dessen Orientierung zu markieren. Überführen Sie anschließend das Rückenmark in eiskalte intrazelluläre Lösung. Kühlen Sie danach das zuvor vorbereitete geschmolzene Agar in einer Mischung aus Eis und Wasser ab.Rühren Sie das Agar, während Sie die Temperatur messen. Wenn die Temperatur des Agars 38 Grad Celsius erreicht, halten Sie das Rückenmark mit der Insektennadel fest und tauchen Sie es mit der rostralen Seite nach unten in das Agar ein. Achten Sie darauf, dass das Rückenmark so gerade wie möglich ist, von den Wänden entfernt und das kaudale Ende leicht nach oben zeigt.Den Becher in der Mischung aus Eis und Wasser belassen, um das Agar um das Rückenmark so schnell wie möglich erstarren zu lassen. Nach dem Erstarren den Agarblock, der das Rückenmark enthält, derart schneiden, dass die Unterseite des Blocks einen Winkel von 35 Grad zur Lendenregion des Rückenmarks aufweist. Die dorsale Fläche sollte von der Unterseite weg gerichtet sein.Kleben Sie den Block mit Cyanoacrylat-Kleber in die Kammer des Vibratoms. Es ist entscheidend, den Block korrekt zu befestigen, um die Kontinuität der Motoneuronenkerne mit den ventralen Wurzeln, durch die sie austreten, aufrechtzuerhalten. Tauchen Sie den Block in Kaliumgluconat-Lösung ein.Stellen Sie die Parameter des Vibratoms ein. Schneiden Sie anschließend 350 400&nbsp;Mikrometer dicke Schnitte des Lendenbereichs, der an seiner Krümmung und größerem Durchmesser erkennbar ist. Überführen Sie die geeigneten Schnitte in ACSF bei 34&nbsp;Grad Celsius.Typischerweise liegen vier bis fünf geeignete Schnitte mit ventralen Wurzeln vor, die zwei Millimeter oder mehr verlängert sind. Nach etwa 30 Minuten bei 34 Grad Celsius kühlen Sie die Schnitte auf Raumtemperatur ab und beginnen anschließend die Aufnahmesitzung. Bereiten Sie im Voraus eine Box mit verschiedenen Pipetten mit Spitzendurchmessern im Bereich von 40 bis 170 Mikron vor.Um die Schnitt-Pipetten vorzubereiten, wählen Sie Pipetten mit einer langen Spitze. Anschließend führen Sie mit einem Diamantmesser Schnitte an verschiedenen Positionen durch und brechen unter einem Stereomikroskop die Spitze jeder Pipette ab, indem Sie mit einer Pinzette dagegen schlagen. Danach entfernen Sie die Kammer vom Aufzeichnungsmikroskop und stellen sie unter ein Stereomikroskop. Wählen Sie eine Scheibe aus, die eine ventrale Wurzel ausreichender Länge enthält, um sie auf einer Sog-Stimulations-Elektrode zu befestigen. Befestigen Sie die Scheibe mit den ventralen Wurzeln nach oben ausgerichtet, schneiden Sie dann vorsichtig das Agar um die ventralen Wurzeln herum, wobei der Rest des Agars um die Scheibe belassen wird, und platzieren Sie das Gitter, um die Probe festzuhalten. Bringen Sie die Kammer wieder am Mikroskop an und perfundieren Sie die Aufzeichnungskammer kontinuierlich mit ACSF mit einer Geschwindigkeit von ein bis zwei Milliliter pro Minute bei Raumtemperatur.Unter Verwendung einer mit ACSF gefüllten Glaspipette, die mit einer Spritze verbunden ist, saugen Sie eine der ventralen Wurzeln an. Um eine gute Stimulation der ventralen Wurzel zu erreichen, muss die Pipettenspitze eng um die ventrale Wurzel angelegt sein. Führen Sie die Patch-Clamp-Aufzeichnung des gewünschten Zelltyps durch und registrieren Sie den Effekt der Stimulation der ventralen Wurzel, wie zuvor beschrieben.Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse einer Spannungs-Klemm-Aufzeichnung. Die Aufzeichnungen der oberen Panels stammen von anderen Motoneuronen als die der unteren Panels. Das obere Panel zeigt die antidromische Antwort eines Motoneurons auf eine Stimulierung mit einem Volt in Rot und eine Stimulierung mit fünf Volt in Schwarz.Die untere Spur zeigt die orthodromische Aktionspotentialantwort auf eine 20-Volt-Reizung in Rot und auf eine 30-Volt-Reizung in Schwarz. Schwarze Punkte kennzeichnen den Zeitpunkt der Reizung. Die Doppelpfeilspitzen verdeutlichen den Unterschied in den Latenzzeiten zwischen ortho- und antidromischen Spikes.Hier werden Aufzeichnungen im Strom-Klemm-Modus gezeigt. Das obere Panel zeigt die antidromische Antwort auf 10-Volt- und 15-Volt-Stimulationen in Rot bzw. Schwarz. Das untere Panel zeigt die orthodromische Antwort auf 25-Volt- und 40-Volt-Stimulationen in Rot bzw. Schwarz.Auch hier sind die Stimuluszeitgebung und die Unterschiede in den Latenzzeiten angegeben. Dieses Bild des Renshaw-Zellpools wurde mit einem schrägen Kondensor und einem 20x-Objektiv aufgenommen. Beachten Sie die Motoneuronen-Axone, die gemäß dem Pfeil in die Ventralkomponente übergehen.Dieses Bild derselben Region wurde mit einem 40x-Objektiv aufgenommen. Mutmaßliche Renshaw-Zellen sind mit Pfeilspitzen markiert. Gezeigt ist hier eine Spannungs-Klammer-Aufnahme einer Renshaw-Zelle nach Stimulation der vorderen Wurzel, die durch den schwarzen Punkt angegeben ist.QX-314 in der intrazellulären Lösung verhinderte, dass die Zelle feuerte, und die Glycin- sowie GABA-Antworten wurden durch jeweils 3 Mikromolar Gabazin bzw. ein Mikromolar Strychnin blockiert. Die rote Spur stellt den Durchschnitt der grauen Spuren dar. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in 20 bis 30 Minuten durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets daran zu denken, die Präparation ständig in kaltem Medium zu halten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man schräge Schnitte des Rückenmarks herstellt, die für die Stimulation der Ventralkommissur geeignet sind. Die Stimulation der Ventralkommissur kann verwendet werden, um die motoneuronale Identität leicht zu bestätigen und, was noch wichtiger ist, um die ventralen Zellen zuverlässig zu stimulieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir beschreiben die Verfahren zur Herstellung und elektrophysiologische Ableitung von Hirnschnitten, die dorso-ventralen Achse des medialen entorhinalen Cortex (MEC) zu halten. Da neuronale Codierung der Lage folgt eine dorsal-ventrale Organisation innerhalb des MEC, erleichtern diese Verfahren Untersuchung der zellulären Mechanismen, die wichtig für die Navigation und das Gedächtnis.

Vorbereitung der Parasagittale Slices für die Untersuchung von dorsal-ventrale Organisation des medialen entorhinalen Cortex Nager

Dieses Video beschreibt die in vivo intrazelluläre Aufzeichnung von Rattenmotoneuronen unter transspinaler Gleichstromstimulation. Das Protokoll beschreibt, wie Membraneigenschaften gemessen und das rhythmische Feuern von Motoneuronen vor, während und nach der anodalen oder kathodalen Polarisation des Rückenmarks aufgezeichnet werden.

Transspinale Gleichstromstimulation des spinalen Motoneurons einer Ratte

Dieses Video zeigt einen Mikroelektrodenarray-basierten Assay zur Untersuchung der Aktivität neuronaler Netzwerke in Rückenmarksschnitten von Mäusen. Zunächst wird die elektrophysiologische Aktivität des oberflächlichen Hinterhorns (SDH) der Scheibe erfasst. Dann wird ein Kaliumkanal-Inhibitor eingeführt, um die Depolarisation zu verlängern, was zu einer synchronen rhythmischen Aktivität im gesamten neuronalen Netzwerk führt.

Mikroelektrodenarray-basierte Bewertung neuronaler Netzwerke in Rückenmarksschnitten von Mäusen

Die Aufzeichnung von Ca2+-Strömen an der präsynaptischen Freisetzungsgesichtsmembran ist der Schlüssel zu einem präzisen Verständnis des Ca2+-Eintritts und der Neurotransmitterfreisetzung. Wir präsentieren eine akute Dissoziation des Neunauge-Rückenmarks, die funktionelle isolierte retikulospinale Axone liefert, die eine Aufzeichnung direkt von der Freisetzungsgesichtsmembran einzelner präsynaptischer Endungen ermöglichen.

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Die Wirksamkeit der intramuskulären Aufnahme und des retrograden Transports von Molekülen zu den entsprechenden Motoneuronen hängt von der Lage der Injektionsstellen in Bezug auf die motorischen Endplatten (MEPs) ab. Hier beschreiben wir, wie MEPs auf der Skelettmuskulatur lokalisiert werden können, um den retrograden Transport von Tracern in die Motoneuronen zu optimieren.

Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen

Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Dieses Protokoll sowohl visuell kommuniziert die Hirnstamm Rückenmark Vorbereitung und klärt die Vorbereitung der Hirnstamm quer Scheiben in umfassender Weise Schritt für Schritt. Es wurde entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, und erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Erlangung lebensfähiger, lang anhaltender, rhythmisch aktiv Scheiben für die Aufzeichnung von neuronalen Ausgang aus der Atemwege Regionen der Hirnstamm.

Vorbereitung von rhythmisch-Active In Vitro neonatale Nagetier Hirnstamm-Rückenmark und dünne Scheibe

Dieses Protokoll beschreibt die intrazelluläre In-vivo-Aufzeichnung von Rattenlenden-Motoneuronen mit gleichzeitiger transspinaler Gleichstromstimulation. Die Methode ermöglicht es uns, Membraneigenschaften zu messen und rhythmisches Abfeuern von Motoneuronen vor, während und nach der anodalen oder kathhodalen Polarisation des Rückenmarks aufzuzeichnen.

In Vivo intrazelluläre Aufzeichnung von typidentifizierten Ratten-Spinal-Motoneuronen während der Trans-Spinal-Gleichstromstimulation

Die Integration verschiedener synaptischer Inputs in Neuronen wird am besten in einer Zubereitung gemessen, die alle präsynaptischen Kerne für natürliches Timing und Schaltplastizität bewahrt, aber Gehirnscheiben trennen in der Regel viele Verbindungen. Wir entwickelten eine modifizierte Gehirnscheibe, um die In-vivo-Schaltungsaktivität nachzuahmen und gleichzeitig die In-vitro-Experimentierfähigkeit aufrechtzuerhalten.

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

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Aufzeichnung der Netzwerkaktivität in spinalen nozizeptiven Schaltkreisen unter Verwendung von Mikroelektrodenarrays

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der eine Patch-Clamp verwendet wird, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf die Rückenmarkstimulation (SCS) mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung zu untersuchen, was Forschern helfen kann, ihre Fähigkeiten bei der Trennung des Rückenmarks und der gleichzeitigen Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit zu verbessern.

Die Ex vivo Präparation eines Rückenmarksschnitts für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme in Motoneuronen während der Rückenmarkstimulation

Erfahren Sie die Präparation schräger Rückenmarkschnitte zur Ventralwurzel-Stimulation bei jungen Mäusen. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Identifizierung von Motoneuronen und die Untersuchung ventraler Zellen.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

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