Name: Vorbereitung der Parasagittale Slices für die Untersuchung von dorsal-ventrale Organisation des medialen entorhinalen Cortex Nager (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie die Präparation parasagittaler Hirnschnitte zur Untersuchung der dorsal-ventralen Organisation des medialen entorhinalen Cortex bei Nagern. Patch-Clamp-Aufnahmen ermöglichen die Analyse synaptischer Eigenschaften.

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Wir bedanken uns bei folgenden sind für ihre Unterstützung: Commonwealth Scholarship Kommission UK Finanzierung (HP), EPSRC (HP), BBSRC (MFN) und die Europäische Union Marie-Curie-Maßnahmen (MFN).

1. Parasagittale Slice-Vorbereitung 1,1 herauspräparieren Gehirnhälften Alle Tierversuche folgen sollten lokale Ethikprüfung und nationalen Vorschriften. Im Fall von den hier beschriebenen Experimenten, entspricht das Werk an die britischen Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Wir verwenden routinemäßig Genickbruch ohne Betäubung, um die Maus vor dem Entfernen des Gehirns einschläfern. Alternativ kann die Maus sein terminal anästhesiert, aber in diesem Fall kann es erforderlich sein, um zu bestimmen, wenn die Wahl der Anästhesie neuronalen Eigenschaften beeinflusst. Entfernen Sie das Gehirn von der Maus und sofort in kaltem (4-8 ° C) Schneiden künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) (siehe Tabelle 1 für Lösung Kompositionen) sprudelte bis zur Sättigung mit Carbogen (95% O 2, 5% CO 2). Nach maximal drei Minuten, entfernen Sie vorsichtig das Gehirn aus dem cUtting ACSF mit einem Spatel und legen Sie sie vorsichtig in eine aufrechte Position (dorsal Seite nach oben) auf ein Filterpapier, das mit dem Schneiden ACSF (Abbildung 1A) angefeuchtet wurde. Zur Erleichterung der Montage genau der Hemisphären, verwenden Sie eine Rasierklinge oder Skalpell, um so viel des Kleinhirns wie möglich, ohne dass der MEC (befindet sich am kaudalen extreme des Großhirns) entfernen und entfernen Sie den rostralen Drittel des Großhirns durch Schnitt in der Frontalebene (Abbildung 1B). Hemisect das Gehirn, wobei darauf geachtet, dass der Abschnitt genau entlang der vertikalen Ebene der Mittellinie (1C) ist. Senden Sie die Halbkugeln zum Schneiden sprudelte ACSF für eineinhalb Minuten. 1,2 Montieren Sie die Halbkugeln auf einem Vibratom Vor der Montage sicherstellen, dass die Schneidkante der Klinge Vibratom bei 20 Grad von der Horizontalen abgewinkelt ist ( <sTrong&gt; 1D). Auf der Montagefläche einen flachen Streifen Sekundenkleber parallel zur Vibratom Klinge, etwa die Breite einer Halbkugel und lang genug, um die beiden Halbkugeln End-to-End-Aufnahme. Die Pflege der körperlichen Auswirkungen zu minimieren, nehmen Sie jede Hemisphäre aus dem Schnittbereich ACSF mit einem Spatel und Position, so dass seine mediale Fläche ruht auf dem Spatel und seiner dorsalen Umfang zugewandt dem Mikrotomklinge. Schieben Sie jeder Hemisphäre auf den Streifen von Sekundenkleber, wobei darauf zu achten, dass die mediale Oberfläche jeder Hemisphäre parallel zur Mikrotomgrundplatte ist. Wir haben festgestellt, dass für die besten Ergebnisse der dorsale Oberfläche jeder Hemisphäre sollten parallel zu und stehen vor der Vibratom Klinge (1D). 1.3 Wartung der Zubereitung während des Schneidens Nach Montage sofort eintauchen in die Hemisphären Kaltschnitt ACSF (4 - 8 ° C). Pflegen Sie die Temperature und Carbogen Sättigung während des Slicing Verfahren. Wenn direkte Kühlung und Sprudeln der Lösung in der Mahlkammer nicht praktikabel ist, in regelmäßigen Abständen wieder aufzufüllen das Schneiden ACSF-Lösung in der Kammer mit Frischwasser gekühlt und sprudelte Lösung. 1,4 Zuschnitte Mit einem Vibratom, zu entfernen Cortex von beiden Hemisphären in der Sagittalebene bis zur seitlichen Ausdehnung der meisten MEC zu identifizieren (typischerweise ~ 1mm unten von der Seitenfläche) (1F). Zwischen den Schnitten heben Sie den Vibratom Klinge bis ~ 200 um zu vermeiden, ziehen Sie die Klinge wieder über und Schäden an der exponierten Gewebes. Gleichzeitig geschnitten 400 um parasagittalen Abschnitten von beiden Halbkugeln (wenn sie wie in 1D gezeigt ausgekleidet sind sie beide zur gleichen Zeit geschnitten werden), bis der medialen Umfang der MEC erreicht ist. Dies kann durch das Fehlen der dicken weißen Band um den ventro-kaudalen Kurve t identifiziert werdener Hippocampus (die äußere Kapsel), die nicht-konvexen Form des rostralen Rand und die Winkelgeschwindigkeit dorso-kaudalen &quot;Ecke&quot;. 1E veranschaulicht die kreisförmiges Erscheinungsbild des Hippocampus in parasagittaler Ebene quer zur MEC. 1F-G zeigen Wie Abschnitte innerhalb des MEC an verschiedenen Positionen lateral-medial erscheinen beim Schneiden. Notieren Sie sich den zunehmend bohnenförmige Aussehen des Hippocampus bei mehr mediale Positionen. Jede Hemisphäre liefert typischerweise zwei oder drei 400 mu m dicke Scheiben schneiden, die das MEC. 1,5 inkubieren Scheiben Nach jedem Schnitt sofort platzieren die Scheiben in Carbogen-gesättigte Standard ACSF in einem Wasserbad bei 35 ° C gehalten Willkommen Scheiben bei 35 ° C für ungefähr 15 Minuten in der ACSF inkubieren nach dem Schneiden abgeschlossen ist. Entfernen Sie das Slice-Halter aus dem Wasserbad und weiterhin sprudeln mit Carbogen bei Raumtemperatur bei lOsten 45 Minuten. 2. Beispiel Parasagittale Slice-Experiment Ein typisches Experiment mit dieser Vorbereitung ist es, elektrophysiologische Ableitungen von Sternzellen in Schicht II des MEC zu machen. 2,1 Optimize Optik Vor der Aufnahme sicher, dass der Kondensator in Fokus auf die Schnittebene (Köhler-Beleuchtung) ist und wird unter der hohen Vergrößerung (zB 40x) Ziel zentriert. 2,2 Identifizieren Zellen von Interesse Verwenden Sie eine geringe Vergrößerung (zB 4x) Ziel, um eine ungefähre Aufzeichnung Region innerhalb des MEC (Abbildung 2A-B) zu identifizieren. Wechseln Sie zu einem hohen Vergrößerung Ziel zu lebensfähigen Zellen innerhalb dieser Region (Abbildung 2C-D) zu identifizieren. Als Beispiel werden putativen Schicht II Sternzellen visuell durch ihre polygonalen oder ovalen Form und mehrere primäre Dendriten mit ähnlichen Durchmesser identifiziertter, und das Fehlen eines einzigen großen Durchmesser apikalen Dendriten 2,13,14. Sie sind zuverlässig auf dem Rand der Schicht I / II Grenze gekennzeichnet, wenn sie reichlich vorhanden und oft in kleinen Gruppen 2,9 (2C-D). Andere Zelltypen, wie Interneuronen und Pyramidenzellen sollte auch erkennbar sein. An diesem Punkt Experimente durchgeführt werden, beispielsweise mit Whole-Cell-Patch-Clamp zu Membranpotential oder Membran Strom von identifizierten Neuronen, und elektrische oder optogenetische Verfahren aufnehmen, um synaptische Eingänge des Neurons aufgezeichnet zu aktivieren. Neuron Identität kann von den elektrophysiologischen Eigenschaften des Neurons aufgezeichnet und durch die Einbeziehung fluoreszierenden Markierungen innerhalb der intrazellulären Lösung überprüft werden. 3. Messen Sie Lage an der dorso-ventrale Achse 3,1 Bild Lage von Interesse und den umliegenden Scheibe Um die Position eines Recor zu bestimmenDED Neuron entlang der dorso-ventralen Achse, verwenden Sie zuerst eine geringe Vergrößerung Ziel, das Bild MEC Region der Scheibe und die umliegenden Gebiete. Markieren Sie die Stelle von Interesse durch, zum Beispiel, einschließlich der Aufnahme-Elektrode in einem Bild (Abbildung 3A) oder durch Rücktritt das Feld Irisblende, um eine helle Kreis um den Ort von Interesse in eine Kopie des Bildes zu verlassen. Um die Aufzeichnung Position innerhalb des Bildes das Duplikat dann auf dem ersten Bild der Aufnahmeort und dessen Umgebung (Abbildung 3B) überlagert werden genau zu bestimmen. Bis zu 3 separate geringer Vergrößerung (4x) Bilder benötigt, um die Fläche aus einer ventralen Aufnahmeort zum dorsalen Rand des MEC gedeckt werden können. Diese Bilder können dann zusammengefügt werden, mit Bildbearbeitungssoftware, um ein Bild, dass Abstandsmessungen aus unternommen werden können (Abbildung 3) bieten. Weitere Überprüfung der Identität und den Aufenthaltsort Neuron kann nach der Aufnahme durchgeführt werden, indeminaktiven Marker wie Biocytin oder Alexa-Farbstoffe in der intrazellulären Lösung und dann mit Hilfe geeigneter Verarbeitung des Gewebes nach der Aufnahme 2. 3,2 Stellen Sie die dorsale Grenze des MEC Der dorsale Rand des MEC bietet eine bequeme Wahrzeichen, von dem dorsal-ventrale Position zu messen. Der ventrale Rand des MEC ist nicht so gut definiert. Abbildung 4 zeigt, wie die MEC zellulären Orte im Nissl gefärbten Schnitten in verschiedenen medial-lateralen Positionen definiert unter DIC Beleuchtung erscheinen. Abbildung 4 A zeigt die kreisförmige Hippocampus (Abbildung 4 (i)) und das Fehlen einer parasubicular Vorsprung in Schicht I (Abbildung 4 (iv)), die mit parasagittale Scheiben mit lateralen entorhinalen Cortex (LEC). Abbildung 4 v. Chr. zeigen typische Scheiben, die die ME enthaltenC. Der dorsale Teil der prominenten dunklen dorsalen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich in den DIC beleuchteten Scheiben enthält einen Bereich des parasubiculum. Die parasubiculum Bereich ist deutlich von Nissl Färbung in den entsprechenden Bildern in der Spalte (iii) ergab. Die dorsalen der MEC (schwarze Pfeile in 4B und 4C-Säule (iv)) ventral der Gruppe von parasubicular Zellen, die weit herausragt in die Schicht I (roten Pfeile in 4B und 4C-Säule (iv)). Ein Vergleich der Abbildungen 4B und 4C Spalten (ii) und (iii) zeigt, dass die dorsale Grenze des MEC in den Nissl Abschnitten zu einem Ort, der ventralen zum dorsalen Rand der dunklen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich in der DIC Scheibe ist entspricht ( schwarze Pfeile). Die Lage der Grenze kann von DIC Bilder und Vergleich mit Referenz-Bildern geschätzt werden (siehe auch Lit.. 14). Zukünftige Validierung des dorsalen MEC Grenze mit molekularen Markern verbessert die Genauigkeit dieser Schätzung. Wir stellen fest, that gefärbt Referenzabschnitte, und Abschnitte, die für morphologische Identifizierung der markierten Neuronen, verarbeitet werden können, unterliegen beträchtliche Schrumpfung. Der Vergleich von absoluten Entfernungen relativ zum Wahrzeichen an der DIC und Kapiteln zum Nachschlagen daher zunächst erforderlich Messung und Korrektur der Schrumpfung (siehe zB Lit. 2). 3,3 kalibrieren und messen Entfernungen Um eine einfache Messung der Distanz in den Bildern zu erleichtern, verwenden das gleiche Ziel zu geringer Vergrößerung Bild eine Referenz Raster, um ein Pixel zu etablieren: Abstand Umtauschverhältnis. Messen Sie die Pixel-Abstand von der dorsalen Grenze des MEC an die Stelle von Interesse entlang der Kontur des MEC mit einem Grafikprogramm und konvertieren Pixel Abstand zum Abstand in um (5A). Wenn Neuronen mit einem Marker wie Biocytin gefüllt sind, dann Position des aufgezeichneten Neuronen kann dann auch durch entsprechende Verarbeitung gewonnen werden (siehe zB Lit. 2). 4. Repr.esentative Ergebnisse 5A zeigt ein Beispiel mit geringer Vergrößerung (4x) zusammengesetztes Bild eines parasagittale Scheibe nach der Aufnahme, mit den Standorten der aufgezeichneten Neuronen und Messung Führer überlagert. Aufnahmen aus den markierten dorsalen und ventralen Sternzellen sind in 5B gezeigt. Diese Aufnahmen helfen, die Identität der Zellen zu schaffen und zeigen, wie elektrischen Eigenschaften des MEC Schicht II Sternzellen am dorsalen und ventralen Orten unterscheiden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vorbereitung der parasagittale Scheiben schneiden. Eine ganze Gehirn ruht mit dorsalen Seite nach oben auf Filterpapier befeuchtet mit Schneiden ACSF. B </sTrong&gt; Rätsel nach Entfernung des Kleinhirns und des rostralen Drittel des frontalen Kortex. C hemiseziert Gehirn zur Montage bereit. D montiert Hemisphären auf Klebestreifen parallel zur Schneide des Vibratom Klinge vor dem Eintauchen in ACSF Schneiden und Schneiden. E Aussehen der Abschnitt mit LEC während das Aufschneiden Verfahren nach dem Entfernen der seitlichen Gewebe und noch nicht ausreichend medial für eine Standard-parasagittale MEC-Slice. F Aussehen der &quot;lateralen&quot; Teil des MEC nach dem Entfernen eines weiteren 400 um von Gewebe (die Oberfläche ist 400 um medial gezeigt, dass in . (F)) g Aussehen des &#39;medialen&#39; Teil des MEC nach einer 400 um parasagittale Scheibe geschnitten worden HALLO Schematics von EF Werte deuten darauf hin anatomischen Landmarken, c:. Kleinhirn, L: lateralen entorhinalen Cortex (LEC), m: Medial entorhinalen Cortex (MEC), h: Hippocampus, orange: äußere Kapsel, blau: Corpus callosum, Cyan: Gyrus dentatus, gr.EEN: CA3 &amp; CA1. Das Aussehen der rostralen Grenze des Hippocampus in Scheiben schneiden, die LEC enthalten ist konkav (schwarzer Pfeil in H), während in Scheiben, die nur MEC enthalten, die Grenze kann linear (roter Pfeil in I) oder konkav (roter Pfeil in J). Die ungefähren Formen von farbigen anatomischen Landmarken wurden aus den Anmerkungen in der Allen Brain Atlas (erhalten <a href="http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html">http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html</a> ). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig2.jpg" /> Abbildung 2. Identifizieren MEC Schicht II-Zellen unter DIC Beleuchtung. Ein Beispiel zusammengesetztes Bild eines para<html> sagittalen Hirnschnitt bei geringer Vergrößerung (4x). Separate Bilder wurden ausgerichtet und vermischt, um störende Kanten und Vignettierung zu entfernen. Wichtiger Meilenstein Bereichen h: Hippocampus, m:. MEC B Crop von einem individuellen geringer Vergrößerung (4x) Bild, das Schicht II des MEC, sichtbar als dunkle vertikale Streifen in der Nähe des rechten Randes C MEC Schicht II bei hoher Vergrößerung enthält (. 40x) mit DIC-Beleuchtung. Das Bild ist ein ausgerichtetes und gemischt Verbund mehrerer Bilder. Die dichte zentrale &quot;Säule&quot; der Zellen ist Layer II. D Single hoher Vergrößerung DIC Bild zeigt eine Gruppe von gesunden vermeintlichen Sternzellen und Interneuronen in Schicht II. Wie hier gezeigt, Sternzellen treten oft in Gruppen an der Grenze der Schicht I / II. Pyramidenzellen neigen dazu, näher an den Layer II / III-Grenze gefunden werden. Die gestrichelten Linien in AC zeigen das Ausmaß der BD sind. Maßstab: in A-und B 500 um, in C und D 100 um. Abbildung 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Die Messung der dorso-ventralen Position von Orten von Interesse. Ein ausgerichtet geringer Vergrößerung (4x) geben, die die gesamte dorso-ventralen Umfang des MEC zwischen dem Ort von Interesse (gekennzeichnet durch die Spitze eines Aufzeichnungselektrode) und dem dunklen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich Landmarke (verwendet, um die dorsalen Ziele einschließen der MEC - siehe Abbildung 4) B, wie in A, aber auch ein überlagertes Bild mit einem abgeblendet Leuchtfeldblende (überlagert mit reduzierter Deckkraft) statt einer Aufnahme Elektrode, um den Ort von Interesse zu markieren.. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die Schätzung der Dorsalrand des MEC von DIC Bilder von parasagittale Scheiben schneiden. AC Parasagittale Abschnitte (lateral nach medial) aus dem entorhinalen Kortex. DIC und Nissl Abschnitte sind aus verschiedenen mice AC Spalte (i):.. Ganze parasagittale Scheiben (400 um dick) (ausgerichtet und Blended-Komposite aus geringer Vergrößerung (4x) Bilder) AC Spalte (ii): Nahaufnahme der entorhinalen Kortex mit charakteristisch dunklen Entorhinale / Parasubicular im Grenzbereich Der obere Bereich eines jeden Bildes. AC Spalte (iii) Nissl gefärbten Schnitten (40 &amp;mgr; m dick) aus einer anderen Maus mit Bildern in AC (ii) ausgerichtet ist. Je dunkler, dichte Schicht von Zellen ist Schicht II. Vergleich von Spalten (ii) und (iii) zeigt, wie die Nissl gefärbten Zellen an der DIC Bilder erscheinen AC Spalte (iv):. Detail der Nissl gefärbten Schnitten. B-und C-Säule (iv)-Zellen aus dem parasubiculum (dorsalen Teil des dunklen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich in den DIC-Bilder) und Zellen aus dorsalen MEC. In B (iv) und C (iv) die große Rückenflosse Patch von parasubicular Zellen, die tief in die Schicht erstreckt I ist gut sichtbar (rote Pfeile). Die ventralen Rand dieser Patches entspricht der dorsalen border der MEC (schwarze Pfeile). In A (iv) die parasubicular Patch nicht vorhanden ist, der angibt, dass das Segment zu lateral für eine Standard-parasagittalen MEC Hirnschnittpräparat ist. In allen Platten, zeigen schwarze Pfeile die dorsale Grenze des MEC. Graue Pfeile geben die ungefähre ventralen Rand des MEC. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig5.jpg" /> Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse. Ein Blended abgeschnitten und Teil des Bildes in Abbildung 3 A. Die Positionen der Zelle einer dorsalen und einer ventralen Zelle werden durch blaue und grüne Kreise angezeigt bzw. gefüllt. Der schwarze Pfeil markiert den geschätzten Dorsalrand des MEC und wird in die tiefen Schichten durch die weiße gestrichelte Linie verlängert. Das feste weiße Linie ist eine Führung, welche die Kontur entlang der das Pixel Messung des Abstandes von der dorsalen des MEC der ventral gelegene Zelle aufgenommen wurde. Maßstab: B 500 um Electro.physiologische Spuren aus den Zellen angegeben in A. Von links nach rechts - unterschwellige Reaktionen auf aktuelle Schritte zur Eingangswiderstand berechnen, Spiking Antwort auf eine große positive aktuellen Schritt, Spike Detail.

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Nichts zu offenbaren.

Zur Untersuchung des MEC Schaltung Eigenschaften, die eine dorsal-ventrale Organisation, die wir hier im Detail beschrieben ein Verfahren zur Herstellung einer Scheibe parasagittale Vorbereitung, die die dorsal-ventralen Umfang der MEC bewahrt folgen zu erleichtern. Kritische Schritte Entfernung des Gehirns aus dem Tier. Seien Sie besonders vorsichtig, um Druck auf das Gehirn zu vermeiden. Dies ist wichtiger als die schnelle Entfernung des Gehirns. ...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Cutting ACSF (mM) </td><td> Standard-ACSF (mM) </td><td> Interne Lösung (mM) </td><td> CASNumber </td><td> Lieferant Katalognummer </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 86 </td><td> 124 </td><td></td><td> 7647-14-5 </td><td> Sigma S9888 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td></td><td> 13472-35-0 </td><td> Sigma 71505 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 </td><td> 2,5 </td><td> 10 </td><td> 7447-40-7 </td><td> Sigma P3911 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td></td><td> 144-55-8 </td><td> Fischer S/4240 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 25 </td><td> 20 </td><td></td><td> 50-99-7 </td><td> Sigma G5767 </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 75 </td><td></td><td></td><td> 57-50-1 </td><td> Sigma S5016 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 </td><td> 2 </td><td></td><td> 10043-52-4 </td><td> VWR 190464K </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 7 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 7786-30-3 </td><td> Sigma 63020 </td></tr><tr><td> K Gluconat </td><td></td><td></td><td> 130 </td><td> 299-27-4 </td><td> Sigma G4500 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 7365-45-9 </td><td> Sigma H3375 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0,1 </td><td> 67-42-5 </td><td> Sigma E4378 </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td> 34369-07-8 </td><td> Sigma A7699 </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td></td><td></td><td> 0,3 </td><td> 36051-31-7 </td><td> Sigma G8877 </td></tr><tr><td> NaPhospho-Creatin </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 19333-65-4 </td><td> Sigma P7936 </td></tr><tr><td> Biocytin (optional) </td><td></td><td></td><td> 2,7 </td><td> 576-19-2 </td><td&gt; Sigma B4261 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Schneiden ACSF, Standard ACSF und K-Gluconat interne Lösung Rezepten.

vorbereitung der parasagittale slices für die untersuchung von dorsal-ventrale organisation des medialen entorhinalen cortex nager

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Rechnen im Gehirn beruht auf Neuronen reagiert angemessen auf ihre synaptische Eingänge. Neuronen unterscheiden sich in ihrer Ergänzung und Verteilung von Ionenkanälen, die Membran, wie sie synaptische Eingänge reagieren zu bestimmen. Allerdings ist die Beziehung zwischen diesen zellulären Eigenschaften und neuronale Funktion im lebenden Tier nicht gut verstanden. Ein Ansatz, dieses Problem ist, topographisch organisierten neuronalen Schaltkreise, in denen die Position der einzelnen Neuronen Karten auf Informationen, die sie kodieren, oder Berechnungen von ihnen durchgeführten 1 zu untersuchen. Experimente mit Hilfe dieses Ansatzes lassen Grundsätze für die Abstimmung der synaptischen Antworten zugrunde liegenden Informationen Codierung in sensorischen und kognitiven Schaltungen 2,3. Die topographische Organisation der räumlichen Darstellung entlang der dorso-ventralen Achse des medialen entorhinalen Cortex (MEC) bietet die Möglichkeit, zwischen zellulären Mechanismen und Berechnungen zu schaffen iW ichtig für die räumliche Wahrnehmung. Neurone in Schicht II des MEC Nagetier kodieren Lage mit gitterartigen Brennen Felder 4-6. Für Neuronen in dorsalen Position in der MEC vor der Abstand zwischen den einzelnen Brennen Bereichen, die ein Raster bilden in der Größenordnung von 30 cm, während für Neuronen in zunehmend ventralen Positionen dieser Abstand erhöht, um größer als 1 m. Mehrere Studien haben zellulären Eigenschaften von Neuronen in Schicht II des MEC, dass, wie der Abstand zwischen Gitter Brennen Felder, unterscheiden sich auch je nach dorsal-ventrale Position enthüllt, was darauf hindeutet, dass diese zellulären Eigenschaften wichtig sind für die räumliche Berechnung 2,7-10. Hier beschreiben wir Verfahren für die Vorbereitung und elektrophysiologische Ableitung von Hirnschnitten, die dorsal-ventralen Umfang der MEC ermöglicht Untersuchung der topographischen Organisation der biophysikalischen und anatomischen Eigenschaften von MEC Neuronen aufrecht zu erhalten. Die dorsal-ventrale Position des identifizierten neurons relativ zu anatomischen Landmarken ist schwierig, genau festzustellen mit Protokollen, die horizontale Scheiben von MEC 7,8,11,12 zu verwenden, da es schwierig, Anhaltspunkte für die genaue dorsal-ventrale Lage der Scheibe zu etablieren. Die Verfahren beschreiben wir ermöglichen präzise und einheitliche Messung der Lage der aufgenommenen Zellen entlang der dorso-ventralen Achse des MEC sowie die Visualisierung molekularer Gradienten 2,10. Die Verfahren wurden für die Verwendung mit erwachsenen Mäusen (&gt; 28 Tage) entwickelt worden und haben sich bislang mit Mäusen bis zu 1,5 Jahre alt beschäftigt. Mit Anpassungen konnten sie mit jüngeren Mäusen oder anderen Nagetieren eingesetzt werden. Ein standardisiertes System der Vorbereitung und Messung helfen werden systematische Untersuchung der zellulären und Mikroschaltung Eigenschaften dieser Gegend.

Wir beschreiben die Verfahren zur Herstellung und elektrophysiologische Ableitung von Hirnschnitten, die dorso-ventralen Achse des medialen entorhinalen Cortex (MEC) zu halten. Da neuronale Codierung der Lage folgt eine dorsal-ventrale Organisation innerhalb des MEC, erleichtern diese Verfahren Untersuchung der zellulären Mechanismen, die wichtig für die Navigation und das Gedächtnis.

Vorbereitung der Parasagittale Slices für die Untersuchung von dorsal-ventrale Organisation des medialen entorhinalen Cortex Nager

Die Computation im Gehirn beruht darauf, dass Neuronen angemessen auf ihre synaptischen Inputs reagieren. Neuronen unterscheiden sich in ihrer Ausstattung und Verteilung von ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die topographische Organisation der synaptischen und integrativen Eigenschaften von Neuronen im medialen Enter RH-Kortex zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Schnitte des medialen Enter RH-Kortex in einer dorsoventralen Ebene präpariert werden. Als zweiter Schritt erfolgen Patch-Clamp-Aufzeichnungen an Neuronen des mento RH-Kortex, um deren synaptische und integrative Eigenschaften zu untersuchen.Anschließend wird die Lage des aufgezeichneten Neurons bestimmt, um die dorsoventrale Organisation der elektrophysiologisch gemessenen Eigenschaften zu beurteilen. Es werden Ergebnisse erhalten, die die topographische Organisation der intrinsischen Eigenschaften sternförmiger Zellen in Schicht zwei zeigen, basierend auf den Messungen ihres Eingangswiderstands, der Membranzeitkonstante und der Schwelle für das Aktionspotential. Den Ablauf demonstrieren wird Hugh Pastel, ein Doktorand aus meinem Labor. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie horizontal orientierten Gehirnschnitten besteht darin, dass die Position des aufgezeichneten Neurons entlang der dorsoventralen Achse des entorhinalen Kortex genau erfasst werden kann.Um dieses Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie das Gehirn aus der Maus und legen es unverzüglich in kalte Schneid-Lösung. Künstliche zerebrospinale Flüssigkeit, die mit Carbogen durchblubbert wird. Nach drei Minuten entfernen Sie das Gehirn vorsichtig mit einem Spatel aus der Schneid-ACSF.Platzieren Sie es vorsichtig in aufrechter Position auf das mit Schnitt-A-CSF angefeuchtete Filterpapier. Entfernen Sie dann mithilfe eines Rasiermessers oder Skalpells so viel wie möglich vom Kleinhirn, ohne dabei den medialen enteralen Kortex zu beeinträchtigen, der am kordalen Ende des Großhirns liegt. Entfernen Sie den rostralen Teil des Großhirns, indem Sie im koronalen Schnitt vorgehen.Schneiden Sie als Nächstes die Hemisphären entlang der vertikalen Ebene der Mittellinie. Danach bringen Sie die Hemisphären für eineinhalb Minuten in mit Sauerstoff durchperlte ACS zurück, bevor Sie sie montieren. Stellen Sie sicher, dass die Schneidkante der Vibratomsäge um 20 Grad gegenüber der Horizontalen geneigt ist. Tragen Sie auf der Montagefläche einen flachen Streifen Sekundenkleber parallel zur Vibratomsäge auf, etwa so breit wie eine Hemisphäre und lang genug, um die beiden Hemisphären Ende an Ende aufzunehmen.Übertragen Sie anschließend jedes Hemisphärium von der Schnittebene in das CSF auf die Montageoberfläche, indem Sie das Hemisphärium so positionieren, dass seine mediale Fläche auf dem Spatel aufliegt und sein dorsaler Bereich zur Schwingklinge zeigt. Verschieben Sie das Hemisphärium vorsichtig auf den Streifen Sekundenkleber und stellen Sie sicher, dass die mediale Fläche jedes Hemisphäriums parallel zur Schwingbasis liegt. Danach tauchen Sie die Hemisphären unverzüglich in die kalte Schnittlösung ein.Eine CSF. Halten Sie die Temperatur sowie die Sauerstoffversorgung und Sättigung während des gesamten Schneidverfahrens konstant. Entfernen Sie mit dem Vibroschneider die Kortexareale beider Hemisphären in sagittaler Ebene, bis der am weitesten laterale Teil des medialen entorhinalen Kortex in jeder Hemisphäre identifiziert ist, der mindestens 600 Mikrometer von der lateralen Oberfläche entfernt liegt.Das seitliche Ausmaß des medialen enteralen Kortex wird anhand des Fehlens des dicken weißen Bandes um die ventrale kordale Kurve des Hippocampus identifiziert. Aufgrund der nicht konvexen Form seiner rostralen Begrenzung und der eckigen dorsalen kordalen Ecke werden 400 Mikrometer dicke parasagittale Schnitte von beiden Hemisphären durchgeführt, bis das mediale Ausmaß des medialen enteralen Kortex erreicht ist. Nach jedem Schnitt werden die Schnitte sofort in mit Carbogen gesättigtem Standard-A-CSF platziert, das in einem Wasserbad bei 35 Grad Celsius gehalten wird, und für etwa 15 Minuten inkubiert.Nach 15 Minuten den Schneidhalter aus dem Wasserbad nehmen und mindestens 45 Minuten lang bei Raumtemperatur weiterhin mit Carbogen durchblubbern. Eine Schnitte in die Ableitungskammer überführen, die kontinuierlich mit mit Carbogen gesättigter Standard-A-C-S-F-A bei 35 Grad Celsius durchblubbert wird. Anschließend einen ungefähren Ableitungsbereich im medialen entorhinalen Kortex identifizieren.Wechseln Sie dann zu einem Objektiv mit hoher Vergrößerung. Identifizieren Sie lebensfähige Zellen in diesem Bereich. An diesem Punkt können Experimente mit der konventionellen Ganzzell-Patch-Clamp-Technik durchgeführt werden, um das Membranpotenzial oder den Membranstrom der identifizierten Neuronen aufzuzeichnen.Die Identität eines Neurons kann anhand der elektrophysiologischen Eigenschaften des aufgezeichneten Neurons überprüft werden, wobei fluoreszierende Markierungen in der intrazellulären Lösung enthalten sein sollten. Um nach dem Experiment die Position des aufgezeichneten Neurons entlang der dorsoventralen Achse zu bestimmen, wechseln Sie zu einem Objektiv mit niedrigerer Vergrößerung. Kennzeichnen Sie den Bereich von Interesse, indem Sie entweder die Aufnahmeelektrode in eine Aufnahme einbeziehen oder die Blende der Feldiris schrittweise verengen.Um einen hellen Kreis um die Region von Interesse in einem Duplikatbild zu erzeugen, werden der mediale und der RH-Kortex sowie die umgebenden Bereiche der Schnittebene markiert, um den Aufzeichnungsort innerhalb des Bildes genau zu lokalisieren. Das Duplikat kann anschließend mit dem ursprünglichen Bild des Aufzeichnungsorts und seiner Umgebung überlagert werden. Um den Bereich von einer ventralen Aufzeichnungsposition bis zur dorsalen Grenze des medialen entorhinalen Kortex abzudecken, können bis zu drei separate Aufnahmen mit niedriger Vergrößerung erforderlich sein. Diese Bilder können dann mithilfe einer Bildbearbeitungssoftware zusammengesetzt werden.Die dorsale Begrenzung des medialen entorhinalen Kortex stellt eine praktische Orientierungsmarke zur Bestimmung der dorsoventralen Position dar, doch die ventrale Begrenzung des medialen entorhinalen Kortex ist nicht so deutlich ausgeprägt. Die DIC- und NIAL-Parasagittalschnitte zeigen jeweils den kreisförmigen Hippocampus und das Fehlen eines parasphärischen Vorsprungs in Schicht eins des lateralen entorhinalen Kortex. Dies sind Bilder typischer Schnitte, die den medialen entorhinalen Kortex enthalten.Der Paras-Bereich wird deutlich durch die Markierung mit Missile sichtbar. In den entsprechenden Aufnahmen befindet sich die dorsale Grenze des medialen enteralen Kortex, die durch den schwarzen Pfeil angezeigt wird, ventral zur Gruppe der parasphärischen Zellen, die gemäß dem roten Pfeil weit in Schicht eins hineinragt. Hier sehen Sie ein Beispiel eines zusammengesetzten Bildes einer parasagittalen Schnittfläche mit vierfacher Vergrößerung.Die Positionen einer dorsalen Zelle und einer ventralen Zelle sind durch blaue bzw. grüne ausgefüllte Kreise gekennzeichnet. Der schwarze Pfeil markiert die geschätzte dorsale Grenze des medialen interalen Kortex und wird durch die weiße gestrichelte Linie in die tieferen Schichten fortgesetzt. Die durchgezogene weiße Linie dient als Hilfslinie, die den Konturverlauf zeigt, entlang dessen die Pixelmessung des Abstands von der dorsalen Grenze des medialen interalen Kortex zu den ventral gelegenen Zellaufzeichnungen von den markierten dorsal und ventral lokalisierten Stellatzellen dargestellt ist.Diese Aufnahmen helfen dabei, die Identität der Zellen zu bestimmen und zu veranschaulichen, wie sich die elektrischen Eigenschaften des medialen entorhinalen Kortex unterscheiden. Sternzellen der Schicht zwei weisen dorsale und ventrale Unterschiede auf. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist besondere Vorsicht während der Schnittpräparation geboten, da hochwertige Schnitte für erfolgreiche elektrophysiologische Aufnahmen unerlässlich sind.

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Das Video zeigt die Präparation von kollikulo-thalamokortikalen Hirnschnitten aus den Gehirnen von Mäusewelpen. Ein isoliertes Gehirn wird auf einer markierten Folie ausgerichtet und in einem Winkel geschnitten, um das auditorische Mittelhirn und das Vorderhirn in derselben Ebene auszurichten. Das Gehirn wird dann mit einem Vibratom aufgeschnitten, und die Schnitte, die die wichtigsten auditorischen Mittelhirn- und Vorderhirnstrukturen enthalten, werden zur Konservierung in eine Haltekammer...

Präparation von kollikulo-thalamokortikalen Schnitten aus dem Gehirn eines Mäusewelpen

Dieses Video zeigt ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung horizontaler Hippocampus-Hirnschnitte von Mäusen, wobei der Schwerpunkt auf der Erhaltung der Integrität der hippokampalen Faserwege liegt. Der Prozess beinhaltet das sorgfältige Halbieren und Sichern des Gehirns, die Verwendung eines Vibratoms zum Schneiden und die Aufrechterhaltung optimaler Gewebebedingungen mit einer karbogenierten Flüssigkeit, was zu Hippocampus-Gehirnschnitten führt, die für weitere Experimente bereit sind.

Gewinnung horizontaler Schnitte des Hippocampus-Gehirns der Maus

Das Video zeigt die Präparation von Schnitten des medialen Thalamus-anterioren cingulären Kortex (MT-ACC) aus Mäusegehirnen. Das Gehirn einer Maus wird präpariert, es werden Schnitte gemacht, um den MT-ACC-Signalweg freizulegen, und Schnitte werden mit einem Vibratom erzeugt. Die MT-ACC-Schnitte werden dann in sauerstoffhaltiger künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit gehalten.

Erzeugung von Schnitten des medialen Thalamus-anterioren cingulären Kortex aus Mausgehirnen

Das Video beschreibt die elektrophysiologische Aufzeichnung von Retinogenikulat- und Kortikogenikulat-Synapsen in Hirnschnitten von Mäusen. Die Schnitte, die den dorsalen lateralen Nucleus geniculatus (dLGN) enthalten, werden in eine Aufnahmekammer gelegt. Eine stimulierende Pipette wird entweder auf dem Sehtrakt positioniert, um retinale Ganglienzellen (RGCs) zu stimulieren und retinogenikulate Synapsen zu untersuchen, oder auf dem Nucleus reticularis thalami, um kortikale Neuronen zu...

Eine elektrophysiologische Studie von Retinogenikulat- und Kortikogenikulat-Synapsen in Hirnschnitten von Mäusen

Dieses Video zeigt die Induktion von iktalen Ereignissen in koronalen kortikalen Schnitten von einer transgenen Maus, die lichtaktivierte Kationenkanäle in kortikalen exzitatorischen Pyramidenneuronen exprimiert. Die Scheibe wird in eine Aufzeichnungskammer gelegt, und eine Aufzeichnungselektrode wird in die oberflächliche kortikale Schicht eingeführt. Bei der Perfusion mit einem anfallsauslösenden Medikament, das die Kaliumkanäle blockiert, werden die Neuronen übererregbar und erzeugen...

Generierung von spontanen und on-demand iktalen Ereignissen in kortikalen Schnitten des Mausgehirns

Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode abgeflachten tangential Abschnitte von Säugetieren Cortex und kortikalen Module mit histochemische und immunhistochemischen Methoden zu visualisieren.

Visualisierung der kortikalen Module in abgeflachten Säugetier-Rinde

Hier stellen wir Protokolle zur Herstellung von akuten Hirnscheiben vor, die den lateralen Geniculate-Kern enthalten, und die elektrophysiologische Untersuchung der Funktion retinogenes und kortikogener Synapsen. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, Synapsen mit der hohen Freisetzungs- und Low-Release-Wahrscheinlichkeit in den gleichen akuten Gehirnscheiben zu untersuchen.

Elektrophysiologische Untersuchungen der Retinogeneulate und Corticogeniculate Synapse-Funktion

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein systematisches Protokoll zu beschreiben, um horizontale Hippocampus-Gehirnscheiben bei Mäusen zu erhalten. Das Ziel dieser Methode ist es, die Integrität von Hippocampus-Faserwegen zu erhalten, wie dem Perforantenweg und dem moosigen Fasertrakt, um dentate Gyrus-bezogene neurologische Prozesse zu bewerten.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

Wir stellen ein Protokoll zur Vorbereitung von Akutscheiben aus dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus von Mäusen vor. Wir vergleichen dieses transversale Präparat mit koronalen Schnitten in Bezug auf die Qualität der Aufnahmen und die Erhaltung morphologischer Merkmale aufgezeichneter Neuronen.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Lernen Sie die Präparation parasagittaler Hirnschnitte zur Untersuchung der dorsal-ventralen Organisation des medialen entorhinalen Cortex bei Nagern. Patch-Clamp-Aufnahmen ermöglichen die Analyse synaptischer Eigenschaften.

Vorbereitung der Parasagittale Slices für die Untersuchung von dorsal-ventrale Organisation des medialen entorhinalen Cortex Nager (Video) | JoVE Journal

Vorbereitung der Parasagittale Slices für die Untersuchung von dorsal-ventrale Organisation des medialen entorhinalen Cortex Nager

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