Vorbereitung der Parasagittale Slices für die Untersuchung von dorsal-ventrale Organisation des medialen entorhinalen Cortex Nager

Wir beschreiben die Verfahren zur Herstellung und elektrophysiologische Ableitung von Hirnschnitten, die dorso-ventralen Achse des medialen entorhinalen Cortex (MEC) zu halten. Da neuronale Codierung der Lage folgt eine dorsal-ventrale Organisation innerhalb des MEC, erleichtern diese Verfahren Untersuchung der zellulären Mechanismen, die wichtig für die Navigation und das Gedächtnis.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die topographische Organisation der synaptischen und integrativen Eigenschaften von Neuronen im medialen Eingangskortex zu untersuchen. Dies wird durch die Präparation von Schnitten des medialen Eingangskortex erreicht, der in einer dorsalen ventralen Ebene orientiert ist. In einem zweiten Schritt werden Patch-Clamp-Aufzeichnungen von mento RH-Kortex-Neuronen gemacht, um ihre synaptischen und integrativen Eigenschaften zu untersuchen.

Als nächstes wird die Position des aufgezeichneten Neurons bestimmt, um die dorsale ventrale Organisation der elektrophysiologisch gemessenen Eigenschaften zu beurteilen. Es werden Ergebnisse erhalten, die die topographische Organisation der intrinsischen Eigenschaften von Sternzellen in Schicht zwei zeigen, basierend auf den Messungen ihres Eingangswiderstands, ihrer Membranzeitkonstante und ihrer Aktionspotentialschwelle. Das Verfahren wird von Hugh Pastel, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. horizontal ausgerichteten Hirnschnitten, besteht darin, dass die Position des aufgezeichneten Neurons entlang der dorsalen ventralen Achse des interalen Kortex genau aufgezeichnet werden kann.

Um diesen Vorgang zu starten, entfernen Sie das Gehirn von der Maus und legen Sie sie sofort in den Kaltschnitt. Künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit, die mit Karbogen gesprudelt ist. Entfernen Sie nach drei Minuten vorsichtig das Gehirn mit einem Spatel aus dem Schnitt A CSF.

Legen Sie es vorsichtig in aufrechter Position auf das Filterpapier, das mit Cutting A CSF angefeuchtet wurde. Verwenden Sie dann ein Rasiermesser oder Skalpell, um so viel wie möglich vom Kleinhirn zu entfernen, ohne den medialen enteralen Kortex zu beeinträchtigen, der sich am cordalen Ende des Großhirns befindet. Entfernen Sie den rostralen Teil des Großhirns, indem Sie in der koronalen Ebene schneiden.

Als nächstes hemis sec, das Gehirn in der vertikalen Ebene der Mittellinie. Danach legen Sie die Halbkugeln wieder in die Blase und schneiden Sie einen Liquor für eineinhalb Minuten, bevor Sie ihn montieren. Stellen Sie sicher, dass die Schneide der Vibratoklinge um 20 Grad zur Horizontalen abgewinkelt ist. Machen Sie auf der Montagefläche einen flachen Streifen Sekundenkleber parallel zur Vibratoklinge, ungefähr so breit wie eine Halbkugel und lang genug, um die beiden Halbkugeln aneinander zu halten.

Übertragen Sie dann jede Halbkugel aus dem Schneiden eines Liquors auf die Montagefläche, indem Sie die Halbkugel so positionieren, dass ihre mediale Oberfläche auf dem Spatel aufliegt und ihre dorsale Ausdehnung zur Schwingtonklinge zeigt. Schieben Sie die Halbkugel vorsichtig auf den Sekundenkleberstreifen und stellen Sie sicher, dass die mediale Oberfläche jeder Halbkugel parallel zur Vibratobasis ist. Tauchen Sie danach die Halbkugeln sofort in den Kaltschnitt.

Ein Liquor. Halten Sie die Temperatur, die Sättigung und die Sättigung während des gesamten Schneidevorgangs aufrecht. Entfernen Sie mit dem Vibram die Kortikale von beiden Hemisphären in der Sagittalebene, bis der lateralste Teil der medialen enteralen Kortex in jeder Hemisphäre mindestens 600 Mikrometer von der lateralen Oberfläche entfernt identifiziert ist.

Die laterale Ausdehnung des medialen enteralen Kortex wird durch das Fehlen des dicken weißen Bandes um die ventrale kordale Krümmung des Hippocampus gekennzeichnet. Die nicht-konvexe Form seiner rostralen Grenze und die eckige dorsale kordale Ecke schneiden 400 Mikrometer para sagittale Schnitte von beiden Hemisphären, bis die mediale Ausdehnung der medialen enteralen Kortex erreicht ist. Legen Sie die Scheiben sofort nach jedem Schnitt in Carbogen gesättigtes Standard-A-Liquor, das in einem Wasserbad bei 35 Grad Celsius gehalten wird, und inkubieren Sie sie etwa 15 Minuten lang.

Nach 15 Minuten den Scheibenhalter aus dem Wasserbad nehmen und mindestens 45 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Carbogen weitersprudeln. Übertragen Sie eine Scheibe in die Aufnahmekammer, die kontinuierlich mit Carbogen gesättigtem Standard A-C-S-F-A 35 Grad Celsius gefüllt ist. Identifizieren Sie als Nächstes eine ungefähre Aufzeichnungsregion innerhalb des medialen Eingangskortex der rechten Luftfeuchtigkeit.

Wechseln Sie dann zu einem Objektiv mit hoher Vergrößerung. Identifizieren Sie lebensfähige Zellen in dieser Region. An dieser Stelle können Experimente mit der herkömmlichen Ganzzell-Patch-Klemme zur Aufzeichnung des Membranpotentials oder des Membranstroms von den identifizierten Neuronen durchgeführt werden.

Die Identität des Neurons kann anhand der elektrophysiologischen Eigenschaften des aufgezeichneten Neurons und durch den Einschluss von Fluoreszenzmarkierungen in die intrazelluläre Lösung überprüft werden. Wechseln Sie nach dem Experiment, um die Position eines aufgezeichneten Neurons entlang der dorsalen ventralen Achse zu bestimmen, zu einem Objektiv mit geringer Vergrößerung. Markieren Sie die gewünschte Stelle, indem Sie entweder die Aufnahmeelektrode in ein Bild einfügen oder die Irisblende des Feldes verringern.

Um einen hellen Kreis um den Ort von Interesse in einem duplizierten Bildbild, die mediale und die RH-Cortex-Region und die umgebenden Bereiche des Clips zu hinterlassen, um den Aufnahmeort innerhalb des Bildes zu lokalisieren, kann das Duplikat dann über das Anfangsbild des Aufnahmeortes und seiner Umgebung gelegt werden. Bis zu drei separate Bilder mit geringer Vergrößerung können erforderlich sein, um den Bereich von einem ventralen Aufnahmeort bis zur dorsalen Grenze des medialen interalen Kortex abzudecken. Diese Bilder können dann mit Hilfe einer Bildbearbeitungssoftware zusammengefügt werden.

Der dorsale Rand des medialen enteralen Kortex bietet einen bequemen Orientierungspunkt zur Messung der dorsalen ventralen Position, aber der ventrale Rand des medialen enteralen Kortex ist nicht so gut definiert. Hier. Die para-sagittalen Schnitte des DIC und der NIAL zeigen den zirkulären Hippocampus bzw. das Fehlen eines paras-orbikulären Vorsprungs in die erste Schicht des lateralen enteralen Kortex. Dies sind Bilder der typischen Schnitte, die den medialen enteralen Kortex enthalten.

Der Paras-Bereich ist durch Raketenflecken deutlich zu erkennen. In den entsprechenden Bildern ist der dorsale Rand des medialen enteralen Kortex, der durch den schwarzen Pfeil angedeutet ist, ventral zu der Gruppe der parasorbikulären Zellen, die weit in die erste Schicht hinausragt, wie durch den roten Pfeil angedeutet. Hier ist ein Beispiel für ein Kompositbild mit vierfacher Vergrößerung eines para-sagittalen Schnitts.

Die Positionen einer dorsalen Zelle und einer ventralen Zelle sind durch blau bzw. grün gefüllte Kreise gekennzeichnet. Der schwarze Pfeil markiert die geschätzte dorsale Grenze des medialen Interalkortex und wird durch die weiße gestrichelte Linie in die tiefen Schichten verlängert. Die durchgezogene weiße Linie ist eine Orientierungslinie, die den Konturpfad zeigt, entlang dessen hier die Pixelmessung des Abstands vom dorsalen Rand der medialen interalen Rinde zu den ventral gelegenen Zellaufnahmen von den markierten dorsalen und ventralen Sternzellen dargestellt ist.

Diese Aufzeichnungen helfen dabei, die Identität der Zellen festzustellen und veranschaulichen, wie die elektrischen Eigenschaften des medialen Eingangskortex sind. Schicht zwei Sternzellen unterscheiden sich an dorsalen und ventralen Stellen Beim Versuch dieses Verfahrens. Es ist wichtig, bei der Vorbereitung von Schnitten besonders vorsichtig zu sein, da qualitativ hochwertige Schnitte für produktive elektrophysiologische Aufzeichnungen unerlässlich sind.