Name: Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Lernen Sie In-vivo-Klonalanalyse und Fate-Mapping zur Untersuchung der Aortenmorphogenese bei Mäusen. Diese Methoden ermöglichen die Analyse glatter Muskelzellen und liefern Erkenntnisse für vaskuläre Therapien.

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Wir danken für die gemeinsame Nutzung seiner Laborprotokoll für Aorten-SMC Isolierung Dean Li. Unterstützung wurde gefördert durch die National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 und R01HL133016, D.M.G), der American Heart Association (Beihilfe 14GRNT19990019, DMG) und der Yale University (Brown-Coxe Fellowship, Uhr und Start Fonds, DMG).

alle Maus-Protokolle sind durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der Yale University genehmigt.
 1. In Vivo embryonalen Schicksal Mapping und klonale Analyse Hinweis: Wir haben diese Ansätze allgemein verwendet, um die Ursprünge der Zellen und ihrer klonalen Architektur in Entwicklung und Krankheit Modelle bewerten 7 , 8 , 9 , 10. <ol><li>Paarung zwischen Mäuse mit einem CreER und Mäuse mit einem Cre-Reporter einrichten. 
	Hinweis: Eine CreER ist für SMC Kennzeichnung verwendet; Myh11-CreERT2 oder Acta2-CreERT2-Mäuse- 11 ,- 12 wird häufig für diesen Zweck verwendet. Für die Kennzeichnung von embryonalen Gewebe im großen und ganzen haben wir ROSA26R-CreERT2 Mäuse 13 eingesetzt.
	<ol><li>Zur klonalen Analyse verwenden eine mehrfarbige Cre Reporter (z. B. Konfetti oder Rainbow [Rb] Mäuse) 8 , 14 , 15 und für das Schicksal Mapping, eine einfarbige Cre Reporter (z. B. ROSA26R-YFP Mäuse 16) oder der Doppel-Farbe Cre Reporter ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17. 
		Hinweis: Diese Zucht-Schema verwendet erwachsener Mäuse, das sind 2-6 Monate alt (in der Regel ca. 30 g) und generiert Embryonen mit einer CreER und Cre Reporter.</li>
	</ol></li> <li>Check für vaginalen Stecker am Morgen mit einem metallischen probe und, mittags am Tag der Stecker Erkennung als embryonale Tag (E) 0,5 prüfen.</li>
	<li>Das Männchen das Weibchen trennen, wenn ein Stecker erkannt wird.</li>
	<li>Vorbereitung 4-OH-Tamoxifen und Tamoxifen funktionierende Lösungen.
	<ol><li>Für 4-OH-Tamoxifen, 5 mg in 50 µL 100 % Ethanol, Wirbel für 2 min auflösen und fügen Sie dann 450 µL Maisöl. Beschallen Sie auf dem Eis am Pegel 2 für 10 s-Zyklen mit Ruhe zwischen den Zyklen bis Probe hat abgekühlt. Nach der Probe vollständig aufgelöst ist (in der Regel ~ 4-5 Zyklen der Beschallung), 200 µL beschallten Lösung nehmen und lösen sich in 1.800 µL Maisöl, letzte funktionierende Lösung (4-OH-Tamoxifen, 1 mg/mL) zu machen.</li>
		<li>Für Tamoxifen, bis 50 mg/mL in 100 % Ethanol und Wirbel zu verdünnen, bis sie aufgelöst ist. Verdünnte in Maiskeimöl, um die letzte funktionierende Lösung (Tamoxifen, 10 mg/mL) und rühren bei 45 ° C um sicherzustellen, dass es vollständig aufgelöst ist.</li>
	</ol></li> <li>Für die frühen embryonalen Induktion 4-OH-Tamoxifen intraperitoneal in eine schwangere dam injizieren.
	<ol><li>Verwenden 4-OH-Tamoxifen Injektionen (bis zu ~ 150 µg pro schwangere Maus oder etwa 5 mg/kg Körpergewicht) bei E5.5 und danach wie sie tragfähige dam, Embryonen und Welpen ergeben.</li>
		<li>Gebrauch Tamoxifen bei Dosen von 0,5 - 1,5 mg (oder 17-50 mg/kg) für Dämme mit Embryonen im schwanger ~ E9 und danach. 30G Nadeln für alle Injektionen verwenden. 
		Hinweis: Filtration durch einen 0,22 µm-Filter wird normalerweise verwendet, um alle Mischungen vor der Injektion zu sterilisieren. </li></ol></li> <li>Zur klonalen Analyse verwenden intraperitoneale Injektion von hohen Dosen von 4-OH-Tamoxifen (z. B. 5 mg/kg) oder Tamoxifen (z. B. 50 mg/kg), mehrere Zellen zu markieren.
	<ol><li>, Einzelne Zellen zu markieren, unten die 4-OH-Tamoxifen oder Tamoxifen-Dosis titrieren, so dass im Gewebe von Interesse (d. h. der Aorta), fast alle Embryonen analysiert (wie unten am Ende dieses Abschnitts beschrieben) haben entweder keine Zellen beschriftet oder nur einer einzelnen Farbe; Dies ist die Schwellendosis.</li>
	</ol></li> <li>, Markieren Sie Zellen in der Mitte Ende gestational Periode und deren Schicksal oder Infektionsstaus in der postnatalen Maus verfolgen injizieren Progesteron in intraperitoneale Hohlraum des Stausees schwanger begleitend mit Tamoxifen in einer 1:2 (Progesteron: Tamoxifen) Dosis Verhältnis. 
	Hinweis: Tamoxifen Dosen sind 17-50 mg/kg und Progesteron Dosen sind 8,5-25 mg/kg (d. h. die Hälfte der Tamoxifen-Dosen). Die Progesteron-Injektion kann Arbeit ~ 1-2 Tage verzögern.</li>
	<li>Einschläfern getränkt mit unverdünntem Isofluran Stausees schwanger mit Embryonen einer gewünschten Zeit mit einer offenen Drop-Methode, wo der Damm in ein Gefäß mit Baumwolle oder Gaze gesetzt. Tod zu bestätigen, durch die Eröffnung der Brusthöhle Pneumothorax zu induzieren, durch das Entfernen der lebenswichtigen Organe und/oder durch zervikale Dislokation ausführen.</li>
	<li>Reinigen den Bauch mit 70 % Ethanol. Mit einer Schere aufschneiden des Bauches und sezieren, die Gebärmutter. Die Embryonen aus der Gebärmutter zu entfernen und die Embryonen aus der Plazenta und der Dottersack mit Pinzette sorgfältig zu trennen.</li>
	<li>Einschläfern die Embryonen bei E15 oder ältere durch zervikale Dislokation oder Enthauptung mit einer chirurgischen Schere oder einer scharfen Klinge durchführen. 
	Hinweis: Jünger als E15 Embryonen sterben schnell nach Euthanasie der Mutter und/oder die Entfernung der Embryonen von Mutter.</li>
	<li>Die Embryonen in eiskaltem PBS und schneiden Sie ein kleines Stück Schwanz mit einer Schere zu Genotyp für die CreER und Cre Reporter.</li>
	<li>Fixieren den Embryonen in 4 % Paraformaldehyd bei 4 ° C für 2 h waschen die Embryonen dreimal mit PBS-Puffer und inkubieren Sie die Embryonen in 30 % Saccharose in PBS in 15 mL Tuben, warten, bis sie sinken, was bis zu zwei Tage dauern kann.</li>
	<li>Füllung Kunststoff Einfrieren Formen bis zu 2/3 der Höchstgehalt mit optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung. Stellen Sie jedem Embryo senkrecht in der Form vollständig untergetaucht im Okt. Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur (RT), Bläschen zu minimieren.</li>
	<li>Ort Einfrieren Gewebe Blöcke aufrecht in einer Trockeneis, 70 % Ethanol Bad zu frieren. Die Blöcke bei-80 ° c</li>
	<li>Kryostaten Temperatur bis-22 ° C einstellen und schneiden Sie Blöcke, um Querschnitte durch die gesamte Aorta, 10-20 µm Dicke erzeugen. Trocknen Sie die Folien bei RT für 30 min vor der Aufbewahrung bei-80 ° c</li>
	<li>Tauen die Folien bei RT, geschützt vor Licht, um zu vermeiden, das Bleichen von Fluorophore. Waschen Sie die Folien mit PBS-Tween20 0,1 %.
	<ol><li>Zur klonalen Analyse, färben die Folien für Kerne (DAPI, 5 mg/mL) und direkt Bild andere Fluorophore in der Rainbow Cre-Reporter (himmelblauen: 433-nm Anregung max, 475 nm Emission max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
		<ol><li>Verwendung der folgenden Filter zur Erkennung von Fluorophore mit einem aufrechten fluoreszierende Mikroskop: DAPI (Erregung Max/Bandbreite 350/50 nm, Emission Max/Bandbreite 460/50 nm), Himmelblau (Erregung 436/20 nm, Emission 480/40 nm), Texas rot (Erregung 560 / 40 nm, Emission 630/75 nm) und benutzerdefinierte Filter, mCherry von mOrange (Erregung 577/10 nm, Emission 630/50 nm) zu trennen.</li>
		</ol></li> <li>Für Schicksal-Mapping mit dem mTmG Cre Reporter erkennen GFP (484 nm, 510 nm), entweder durch bildgebende direkt oder mithilfe von Immunostaining. Für die Bildgebung mit einem aufrechten fluoreszierende Mikroskop verwenden einen GLP-Filter (Erregung 470/40 nm, Emission 525/50 nm).</li>
		<li>Für Immunostaining, Abschnitte mit primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubieren, waschen mit 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer und dann mit Sekundärantikörper für 1 h Nutzung Anti-CD31 inkubieren (Endkonzentration 0,0016 mg/mL), Anti-GLP (0,006 mg/mL) und Cy3-direkt konjugierten Anti-SMA (1: 500 Endverdünnung) Primärantikörper und Verwendung sekundärer Antibodies direkt zu Fluorophore (1: 500 Endverdünnung) (siehe Tabelle der Materialien) konjugiert.</li>
	</ol></li> <li>Image-Folien mit einem aufrechten fluoreszierende Mikroskop (Vergrößerung: 4 X - 20 X) oder confocal Mikroskop (10 X-63 X). Für hohe Vergrößerung verwenden ein confocal imaging 63 x Öl-Ziel mit einer numerischen Apertur von 1,4-0,6 und ein Frame-Größe von 1.024 x 1.024 Pixel.</li>
</ol> 2. Explant embryonalen Aorta Kultur Hinweis: dieser Ansatz war früher die Rolle der Integrin beta3 im Stenose der der explantierten bewerten Eln (- / -) embryonalen Aorta 9 , 18. <ol><li>einschläfern einen zeitlich-schwanger Damm am E15.5 durch überschüssige Isofluran Inhalation gemäß Schritt 1,8, oben.</li>
	<li>Ernte und die Embryonen nach Schritte 1,9-1.10, oben einschläfern.</li>
	<li>Den Embryo supinely positionieren und fixieren die erweiterten Gliedmaßen die Dissektion gegenüber. Mit einer Dissektion Stereoskop visualisieren Sie und mit einer Schere schneiden Sie einen vertikalen Schnitt aus dem Bauch durch das Brustbein zu den oberen Brustkorb. Sezieren entfernt den Thymus, Luftröhre, Lunge, Speiseröhre, Leber und Darm.</li>
	<li>Sanft ziehen das Herz ventral mit Pinzette und Schere verwenden, um die Aorta von der dorsalen Aspekt der thorakalen und abdominalen Hohlräume zu sezieren. Zum Lösen der Aorta schneiden proximalen und distalen Abdominal-Positionen.</li>
	<li>Legen die Aorta in eiskalten sterile PBS in einer Zelle Kultur Kapuze. Die Aorta auf einer 24-Well-Platte übertragen und Kultur es in DMEM mit 0,5 % FBS für bis zu 24 h bei 37 ° c 
	Hinweis: Das Kulturmedium kann durch eine blockierende Antikörper (z. B. Anti-Integrin αvβ3 Antikörper bei 0,02 mg/mL 9; vgl. die Tabelle der Materialien) oder eine pharmakologische Mittel ergänzt werden.</li>
	<li>Die Aorta zweimal mit PBS waschen und dann fix it mit 4 % Paraformaldehyd für 20 min.</li>
	<li>Waschen dreimal mit PBS und Übertragung der Aorta auf eine 1,5-mL-Tube mit 30 % Saccharose in PBS. Nachdem die Aorta sinkt, stellen gefrorenes Gewebe Blöcke, Zuschnitte und Immunostain, oben beschriebenen Schritten 1.13-1,15.</li>
</ol> 3. SMC-Isolation aus der perinatalen Aorta Hinweis: dieser Ansatz dient derzeit zur Biologie der Aorta SMCs von Eln (- / -) und Wildtyp perinatale Mäusen isoliert vergleichen.
<ol><li>Einschläfern ein Murine pup auf postnatale Tag (P) 0,5, entweder durch zervikale Dislokation oder durch Enthauptung mit einer chirurgischen Schere oder einer scharfen Klinge, wie in Schritt 1.10, beschrieben oben.</li>
	<li>Führen Sie Schritt 2.3 und dann, nach der Eröffnung des Thorax und Abdomen, Punktion linke Herzkammer mit 23G Nadel. Verwendung Kunststoffschlauch Verbindung die Nadel zu sterile Spritze PBS-haltigen senkrecht gehalten an einer erhöhten Position, so dass PBS in die linke Herzkammer durch die Schwerkraft fließt. Infusion von sterilen PBS in linken Ventrikel zu ermöglichen, bis die Leber blanches.
	<ol><li>Zange verwenden, um entfernen adventitial Gewebe auf der Außenseite der Aorta und die Aorta zu sezieren, wie unter Punkt 2.4 beschrieben.</li>
	</ol></li> <li>Die Aorta in einer einzigen Lösung von DMEM zu verdauen (500 µL) ergänzt mit 225 U/mL Kollagenase, 2,25 U/mL Elastase und 1 X Antibiotikum Antimykotikums für 45 min bei 37 ° C. manuell schütteln dem Rohr alle 5-10 min.</li>
	<li>In der sterilen Zelle Kultur Haube, Titurate das verdaute Gewebe durch Pipettieren oben und unten mit einer 200-µL Pipette eine einzellige Aussetzung zu generieren. Single-Zellsuspension auf eine 15-mL-Tube übertragen, fügen Sie 2 mL DMEM und Zentrifugieren bei 920 X g für 5 min bei 25 ° c</li>
	<li>Verwerfen den überstand. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 3 mL Kulturmedium SMC (DMEM mit 10 % FBS mit 2,5 µg/mL Amphotericin B, 1 µg/mL RhFGF, 10 µg/mL RhEGF und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin ergänzt). Übertragen auf einen 35-mm-Kultur Teller. 
	Hinweis: Bei der ersten Isolierung werden ~ 400.000 Zellen aus einem einzigen P0.5 Wildtyp Aorta erreicht; ~ 300.000 dieser Zellen sind SMCs.</li>
	<li>Kulturzellen bei 37 ° C und alle 3 Tage frische SMC Kulturmedium ändern. Mit standard-Techniken mit Trypsin, Durchgang der Zellen als konfluierende. Für Experimente, benutzen Zellen aus Passagen 3-7.</li>
</ol> 4. Subkutane osmotische Mini-Pumpe Platzierung in schwanger (oder nicht-Schwangere) Mäuse Hinweis: dieser Ansatz wurde früher verwendet, um kontinuierlich einen pharmakologischen Agenten (z. B. Integrin β3 und β5 Hemmer liefern Cilengitide) Embryonen in der Gebärmutter 9. Die Pumpe wurde eingefügt in die schwangere Damm am E13.5 und behielt bis Geburt.
<ol><li>Betäuben die Mäuse mit 2-5 % Isofluran in Sauerstoff (Durchfluss von 1 L/min) für Induktion und 1-3 % für Wartung. Verwenden des Zehe-Prise Reflexes, um das Niveau der Narkose zu überwachen, und das Anästhetikum nach Bedarf anpassen. Verwalten von subkutanen Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) für Analgesie.</li>
	<li>Rasieren des unteren Rückens mit Klipper. Sterilen Tüchern, Handschuhe und Instrumente verwenden und die Mäuse auf eine chirurgische Heizplatte während der Operation zu erhalten.</li>
	<li>Jede Maus in Bauchlage und schrubben den Rücken mit Betadine gefolgt von Isopropylalkohol. Ca. 3-5 cm rostral an der Schwanzwurzel in den unteren Rücken ein Skalpell verwenden, um eine horizontale Hautinzision 0,5 - 1,0 cm Länge ohne Verletzung der darunter liegenden Muskeln machen.</li>
	<li>Der Schnitt einer Gefäßklemme einfügen und erstellen eine subkutane Tasche Rostral zur Implantation der Pumpe durch öffnen und Schließen der Gefäßklemme Kiefer.</li>
	<li>Füllen eine osmotische Mini-Pumpe mit das Mittel der Wahl, nach der Hersteller &#39; s-Richtlinien (siehe die Tabelle der Materialien). Legen Sie die gefüllte Pumpe in der Tasche und schließen Sie den Schnitt mit Clips oder 6-0 nicht resorbierbare Nähte. Sicherzustellen, dass die gesamte chirurgische Zeit weniger als 10 min.</li>
	<li>Überwachen postoperativ, die Mäuse alle 15 min, bis sie von sternalen liegen erholt haben. Verwalten Sie subkutane Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) alle 6-12 Std. für 48 h. Wenn die Mäuse Vollnarkose vollständig erholt haben, überwachen sie täglich. Entfernen Sie die Clips oder Nähte 7-10 Tage nach der Operation.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Im Gegensatz zu den umfangreichen Untersuchungen der murinen Aorta und ihrer großen Niederlassungen in Erwachsenen pathologischen Zuständen, wie z. B. Modelle von Arteriosklerose ist weniger bekannt, bezüglich der Morphogenese und der Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta. Hier setzen wir auf die embryonale/perinatale Aorta, speziell die SMCs und bieten Protokolle zur Untersuchung der Aorta durch in-Vivo, Gewebe Explant und SMC Isolierung nähert. Diese kostenlosen Ansätze bieten die Ermittler mit unte...

Die Herz-Kreislauf-Systeme der Mehrzeller Funktion, Nährstoffe und Sauerstoff zu den Zellen zu liefern sind, die nicht in Kontakt mit der äußeren Umgebung und Abfallstoffe und Kohlendioxid aus diesen Zellen zu entfernen. Bei Wirbeltieren besteht das primäre Herz-Kreislauf-System des Herzens, welche pumpt durch eine Reihe von Blutgefäßen Blut. Die Wände der großen Blutgefäße wie Arterien und Venen, bestehen aus drei Schichten: ich) die Intima oder innere Schicht von Endothelzellen; (II) die Medien oder mittlere Schicht abwechselnd umlaufend länglichen glatten Muskelzellen SMCs und elastische Lamellen; und Iii) der Adventitia oder äußere Schicht von Bindegewebe und Fibroblasten. Die überwiegende Mehrheit der Studien in der vaskulären Biologie konzentrieren sich auf Endothelzellen, die Bildung von neuen endothelial Zelle gesäumten Röhren durch Angiogenese untersucht. Im Vergleich dazu erhalten SMCs relativ wenig Beachtung. SMCs sind jedoch eine kritische Zelltyp in den Bau der normalen Arterienwand und vaskuläre Erkrankungen.
Die Aorta ist die größte Kaliber Arterie im Körper, das Herzzeitvolumen aus dem linken Ventrikel des Herzens empfangen. Es wird von vielfältigen menschlichen Krankheiten, einschließlich Arteriosklerose, Aneurysma und Dissektion heimgesucht. Im erwachsenen Organismus sind die Aorta und ihre Hauptzweige in Modellen von Gefäßerkrankungen intensiv untersucht. Zum Beispiel fettreiche Diät gefüttert Mäuse, die für die Codierung der Rezeptor Low density Lipoprotein oder Apolipoprotein E, gen null sind entwickeln Atherosklerose und den letzten Schicksal Mapping Studien zeigen, dass bereits vorhandene SMCs mehrere Zelltypen entstehen die atherosklerotischen Plaque1. In Aortenaneurysmen pathologische Veränderungen gehören SMC Apoptose und extrazelluläre Matrix Umbau2,3.
Während der embryonalen und perinatale ist wesentlich weniger über SMC Morphogenese und Pathogenese bekannt. Hier bieten wir Protokolle für ein Studium embryonaler und perinataler Aorten SMCs in Vivo, in Gewebe Explantaten und in isolierten Zellen. Beispielsweise beschreibt der erste Abschnitt des Protokolls Schicksal Kartierung und klonale Analyse embryonaler Mäuse. Cre-Rekombinase ausgedrückt unter der Kontrolle eines Promotors zellspezifische erleichtert die Kennzeichnung bestimmter Zellen und ihre Nachkommen4,5,6; zeitliche Steuerung der Zelle-spezifische Kennzeichnung kann jedoch während der Embryonalentwicklung bei Mäusen schwierig sein. In diesem Zusammenhang bieten mit Embryonen, die mit dem Ausdruck der bedingten CreER unter Förderer aktiv in SMCs (e.g.,Myh11 oder Acta2) und eine Cre-Reporter wir Methoden zur Injektion von Tamoxifen oder seine aktiven Metaboliten 4-OH-Tamoxifen in schwanger Dämme und für die Analyse von markierten Zellen in Embryonen oder postnatale nachkommen. Darüber hinaus ist im Gegensatz zu Schicksal Mapping Studien, welche überwiegend nutzen Cre-Reporter mit einem einzigen Reporter-Fluorophor1,7, klonale Analyse deutlich mit Multi-Color-Cre-Reporter verstärkt.
Die zweite und dritte des Protokolls Abschnitten Methoden zur Isolierung und Kultivierung embryonalen Aorten-Explantaten und Aorta SMCs von Neugeborenen, beziehungsweise. Diese Ansätze erlauben die Manipulation der Signalwege, speziell in Aorta Explantaten oder SMCs, und für die Analyse der direkten Effekte pharmakologischer Substanzen. So kann die Rolle bestimmter Gene in das Gewebe von Interesse weit schneller Weise als durch traditionelle genetische Manipulationen an Mäusen gezeigt. Darüber hinaus die isolierte SMC Studien erleichtern die Analyse der Zellwanderung und Adhäsion, technisch begrenzt in Vivo.
Der vierte Protokoll Abschnitt beschreibt schließlich die Platzierung einer subkutanen osmotische Mini-Pumpe mit pharmakologischer Substanzen bei schwangeren (oder nicht-schwangeren) Mäusen geladen. Diese Methode erleichtert die Analyse der Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung verursacht durch Agenten, die kontinuierliche Infusion wegen schnellen Stoffwechsel benötigen. Die Alternative, häufige Injektionen ist nicht praktisch für viele Agenten und sollte vermieden werden, da es erhebliche Beschwerden in der Schwangerschaft Damm führen kann.

<table><tbody><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Maisöl</td><td>Sigma</td><td>C-8267</td><td>Vehikel für Tamoxifen</td></tr><tr><td>4-OH-Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Aktiver Metabolit von Tamoxifen</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783-5G</td><td>Verwendung in halber Konzentration von Tamoxifen</td></tr><tr><td>OCT-Verbindung</td><td>Sakura tissue tek</td><td>4583</td><td>Zur Herstellung von Kryoblöcken</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Polysciences inc</td><td>18986</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>IHC-Färbung des Zellkerns, Endkonzentration 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Cy3 direkt konjugierter Anti-SMA-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>IHC-Färbung von SMA, Endverdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD31-Antikörper</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>IHC-Färbung von GFP, Endkonzentration 0,006 mg/mL</td></tr><tr><td>Anti-GFP-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11121</td><td>IHC-Färbung von CD31, Endkonzentration 0,0016 mg/ml</td></tr><tr><td>Sekundärantikörper Ziege Anti-Kaninchen, Alexa 647</td><td>Life Technologies</td><td>a21244</td><td>IHC-Färbung, Endkonzentration 0,004 mg/ml</td></tr><tr><td>Sekundärantikörper Ziege Anti-Kaninchen, Alexa 488</td><td>Life Technologies</td><td>a11008</td><td>IHC-Färbung, Endkonzentration 0,004 mg/ml</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>Für Zellkulturen</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Integrin, Beta3-blockierender Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>553343</td><td>Klon 2C9. G2, Endkonzentration 0,02 mg/ml</td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>44H14977A</td><td>Zur Verdauung der Aorta</td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>34K15139</td><td>Zur Verdauung der Aorta</td></tr><tr><td>Antibiotisch-antimykotisch (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant humanes FGF</td><td>Promega</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant humanes</td><td>EGF Promega</td><td>G5021</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturplatten</td><td>Corning</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>Alzet osmotische Minipumpe</td><td>Durect Corporation</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE 80i Aufrecht Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; TCS&nbsp; SP5</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier 450</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myh11-CreERT2 Mäuse</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>19079</td><td></td></tr><tr><td>Acta2-CreERT2 Mäuse</td><td></td><td></td><td>Gewonnen aus dem Labor von Dr. Pierre Chambon und Daniel Metzger</td></tr><tr><td>ROSA26R-CreERT2 Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>8463</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(mTmG/mTmG) Mäuse</td><td>Das Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>026862</tr><tr><td>ROSA26R(EYFP/EYFP) Mäuse</td><td>Das Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>&nbsp; 006148&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(Konfetti/Konfetti) Mäuse</td><td>Das Jackson Labor&nbsp;</td><td>13731</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(Rb/Rb) Mäuse</td><td>Labor von Dr. Irv Weissman</td><td></td><td>Gewonnen aus dem Labor von Dr. Irv Weissman</td></tr></tbody></table>

verwendung von in vivo und gewebe und zelle explant ansätze zur untersuchung der morphogenese und pathogenese der embryonalen und perinatale aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Die Aorta ist die größte Arterie im Körper. Die aortalen Wand besteht aus einer Innenlage aus Endothelzellen, einer Mittelschicht aus alternierenden elastische Lamellen und glatten Muskelzellen (SMCs) und eine äußere Schicht der Fibroblasten und extrazelluläre Matrix. Im Gegensatz zu der weit verbreiteten Studie von pathologischen Modelle (z.B. Arteriosklerose) in der Erwachsenen Aorta ist über die embryonale und perinatale Aorta weit weniger bekannt. Hier konzentrieren wir uns auf SMCs und Protokolle für die Analyse der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorten SMCs in normale Entwicklung und Krankheit. Insbesondere die vier Protokolle enthalten sind: ich) in Vivo embryonalen Schicksal Kartierung und klonale Analyse; (II) Explant embryonalen Aorta Kultur; (III) SMC isoliert von der perinatalen Aorta; und iv) subkutane osmotische Mini-Pumpe Platzierung in schwanger sind (oder nicht-schwangeren) Mäuse. Diese Ansätze ermöglichen die Untersuchung des Origin(s), des Schicksals und der klonalen Architektur von SMCs in die Aorta in Vivo. Sie ermöglichen für die Modulation embryonalen Aorta Morphogenese im Mutterleib durch die ständige Einwirkung von pharmakologischen Wirkstoffen. Darüber hinaus isolierte Aorta Gewebe explants oder Aorten SMCs Einblicke in die Rolle des spezifischen gen Ziele während grundlegende Prozesse wie Muscularization, Proliferation und Migration eingesetzt werden. Diese Hypothese schaffende Experimente an isolierten SMCs und der explantierten Aorta können dann im Kontext in Vivo durch pharmakologische und genetische Ansätze beurteilt werden.

In einer repräsentativen klonalen Analyse von SMCs Embryonen Mutant für Eln (das Gen Kodierung der extrazellulären Matrix Protein Elastin) Eln(+/-), Acta2-CreERT2 Mäuse waren verbunden mit Eln(+/-) Mäuse auch die Durchführung der Multi-Color ROSA26R(Rb/Rb) Reporter. Wie in Schritt 1 beschrieben, Stecker wurden überprüft, schwanger Dämme wurden mit einer einzigen Tamoxifen-Injektion (1,5 mg) bei E12.5 induziert, und s...

Protokolle für das Studium der embryonalen und perinatalen murinen Aorta mit in Vivo klonalen Analyse und Schicksal Mapping, Aorten-Explantaten und isolierten glatte Muskulatur, die Zellen detailliert sind hier. Diese unterschiedlichen Ansätze ermöglichen die Untersuchung der Morphogenese der embryonalen und perinatale Aorta in normale Entwicklung und die Pathogenese in Krankheit.

Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, die Bildung der embryonalen und perinatalen Aortenwand während der normalen Entwicklung sowie Störungen dieses Prozesses bei Erkrankungen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der vaskulären Entwicklung zu beantworten, beispielsweise, welches die Herkunft der Zellen ist, die zum embryonalen und perinatalen vaskulären Media beitragen. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass sie die Beurteilung der Pathogenese und Morphogenese glatter Muskelzellen ermöglichen, die während der embryonalen und perinatalen Entwicklungsstadien stattfinden.Die Bedeutung dieser Techniken liegt in der Therapie von Gefäßerkrankungen, wie beispielsweise der supravalvulären Aortenstenose einer periodischen Erkrankung, die eine übermäßige SUMO-Zellproduktion verursacht. Das Verfahren zur Platzierung der Minipumpe wird von Dr. Jiasheng Zhang, einem leitenden Wissenschaftler eines Mikrochirurgie-Kernlabors an der Yale University, durchgeführt. Beginnen Sie mit der Einrichtung von Paarungsgruppen zwischen zwei und sechs Monate alten Mäusen mit Cre ER und Mäusen mit einem Cre-Reporter.Überprüfen Sie morgens mit einer Metallsonde auf Vaginalpfropfen und trennen Sie das Weibchen vom Männchen, sobald ein Pfropf entdeckt wird. Für die frühe embryonale Induktion injizieren Sie Tamoxifen intraperitoneal in die trächtige Maus. Um Zellen in der mittleren bis späten Tragzeit zu markieren und ihr Schicksal oder ihre Klonalität in der postnatalen Maus zu verfolgen, injizieren Sie Progesteron zusammen mit Tamoxifen in einem Verhältnis von einer zu zwei Dosen in die intraperitoneale Körperhöhle der trächtigen Maus.Um die Embryonen am entsprechenden embryonalen Tag zu gewinnen, reinigen Sie den Bauch der trächtigen Maus mit 70 % Ethanol und öffnen Sie den Bauch mit einer Schere, um die Gebärmutter zu entfernen. Sammeln Sie die Embryonen aus der Gebärmutter unter Verwendung einer Pinzette und eines Stereomikroskops, um sie vorsichtig von Plazenta und Dottersack zu trennen. Fixieren Sie die Embryonen zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius in 4 % Paraformaldehyd.Anschließend dreimal mit PBS waschen, um das überschüssige Fixiermittel zu entfernen. Nach dem dritten Waschgang die Embryonen in 30 % Saccharose in PBS in einzelnen 15-Milliliter-Röhrchen inkubieren, bis die Embryonen absinken. Danach die Kunststoff-Einbettungsformen mit Schnitttemperatur-Verbindung (OCT) bis zu zwei Drittel des maximalen Volumens füllen und jeweils einen Embryo vertikal in jede Form geben.Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur die Gewebe senkrecht in einem Trockeneisbad mit 70 % Ethanol einfrieren und die Kryostattemperatur auf 22 Grad Celsius einstellen. Schneiden Sie die Gewebeproben in transversale Schnitte mit einer Dicke von 10 bis 20 Mikrometern durch die gesamte Aorta und fangen Sie jeden Schnitt, sobald er erhalten ist, auf einem Glasobjektträger auf. Sobald alle Proben gewonnen wurden, trocknen Sie die Objektträger 30 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie sie bei 80 Grad Celsius lagern.Um die Gewebeproben zu färben, tauen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur auf, schützen Sie sie vor Licht, um eine Bleiche der Fluorophore zu vermeiden, und waschen Sie die Objektträger in 0,1 % PBS-Tween 20. Für die klonale Analyse färben Sie die Gewebe mit einem geeigneten Kernfarbstoff und nehmen Sie direkt die anderen Fluorophore des Rainbow-Cre-Reporters an einem Fluoreszenzmikroskop auf. Für die Fate-Mapping-Analyse mit dem mTmG-Cre-Reporter visualisieren Sie die GFP-Expression durch direkte Bildgebung mit oder ohne Immunfärbung.Um eine embryonale Aorta zu kultivieren und zu isolieren, platzieren Sie das Embryo in Rückenlage und befestigen Sie die ausgestreckten Gliedmaßen auf einem Präparationsbrett unter einem Stereomikroskop. Führen Sie mit einer Schere einen vertikalen Schnitt vom Abdomen durch das Sternum bis zum oberen Thorax durch. Präparieren Sie die feinsten Teile von Luftröhre, Lungen, Speiseröhre, Leber und Darm weg.Verwenden Sie eine Pinzette, um das Herz vorsichtig ventral zu ziehen, und benutzen Sie eine Schere, um die Aorta von der dorsalen Seite der Brust- und Bauchhöhle zu lösen. Durchtrennen Sie die Aorta an der proximalen Wurzel und an der distalen abdominalen Position, um sie zu entnehmen, und legen Sie die gewonnene Aorta in sterilem, eiskaltem PBS unter dem Zellkulturwerk ab. Nach einer kurzen Spülung überführen Sie die Aorta in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte, die mit DMEM-Medium ergänzt um 0,5 % PBS befüllt ist, und stellen Sie die Platte bis zu 24 Stunden in einen Zellkulturinkubator.Am Ende der Inkubation die Aorta zwei Mal mit PBS waschen und das Gewebe 20 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixieren. Nach drei weiteren PBS-Waschungen die Aorta in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 30 % Saccharose in PBS überführen, bis das Gewebe absinkt. Zur Isolierung glatter Muskelzellen aus der Aorta von neugeborenen Mäusen am postnatalen Tag 0,5 die linke Herzkammer mit einer 23-Gauge-Nadel punktieren und einen sterilen, mit PBS gefüllten Spritzen, der vertikal in erhöhter Position gehalten wird, mittels Kunststoffschlauch mit der Nadel verbinden, sodass PBS durch Schwerkraft in die linke Herzkammer fließt.Wenn die Leber blass wird, verwenden Sie eine Pinzette, um das adventitielle Gewebe von der Außenseite der Aorta zu entfernen, und entnehmen Sie die Aorta wie zuvor gezeigt. Lösen Sie das Aortengewebe in 500 Mikroliter Digestionslösung unter manuellem Schütteln alle fünf bis zehn Minuten auf. Nach 45 Minuten überführen Sie das Röhrchen in eine sterile Zellkulturbank und verwenden eine 200-Mikroliter-Pipette, um das Gewebepulver so lange zu pipettieren, bis eine Einzelzell-Suspension erhalten ist.Überführen Sie die Zellen in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie anschließend zwei Milliliter DMEM hinzu. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter glattmuskulärem Zellkulturmedium und säen Sie die Zellen auf eine 35-Millimeter-Kulturplatte aus. Stellen Sie die Platte dann in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und erneuern Sie das Zellkulturmedium alle drei Tage.Um eine subkutane osmotische Minipumpe zu platzieren, beginnen Sie damit, den unteren Rücken einer anästhesierten Maus mit einer Schermaschine zu rasieren, und positionieren Sie die Maus in Bauchlage auf einer beheizten Operationsplatte. Desinfizieren Sie den Rücken mit Betadine und Isopropylalkohol und stellen Sie die Maus unter ein Stereomikroskop. Führen Sie dann mit einem Skalpell einen horizontalen Hautschnitt von 0,5 bis einem Zentimeter Länge etwa drei bis fünf Zentimeter kaudal zur Schwanzwurzel durch, wobei die darunterliegende Muskulatur nicht verletzt werden darf.Führen Sie einen Hämostat in den Einschnitt ein und öffnen und schließen Sie die Hämostatbacken, um eine subkutane Tasche zu bilden. Platzieren Sie eine osmotische Minipumpe, gefüllt mit dem gewünschten Wirkstoff, in der Tasche und verschließen Sie den Einschnitt mit sechs nicht resorbierbaren Nähten. Anschließend lässt man die Maus unter Überwachung regenerieren, bis sie die sternale Liegeposition erreicht hat.Embryos, die für das Gen, das das extrazelluläre Matrixprotein Elastin kodiert, mutiert sind, sammeln ab dem embryonalen Tag 15,5 überschüssige glatte Muskelzellen in den inneren Schichten der Aorta an. Die klonale Analyse der glatten Muskelzellen mit dem mehrfarbigen Cre-Reporter während dieses Vorgangs zeigt, dass die Zellen mehrere Farben aufweisen und somit polyklonal sind. Die Immunfärbung von ausgeschnittenen Aortaschnitten zeigt, dass Aorten von Elastin-Mutanten am embryonalen Tag 15,5 innerhalb von 18 Stunden Kultur hypermuskulär und stenotisch werden, ein Prozess, der durch die Zugabe eines anti-Integrin-beta-drei-blockierenden Antikörpers abgeschwächt wird.Glattmuskuläre Zellen, die aus der Aorta von Wildtyp-Mäusen am postnatalen Tag 0,5 isoliert wurden, exprimieren Marker glatter Muskelzellen, jedoch nicht CD31. Eine kontinuierliche Infusion eines Integrin-Beta-drei-Inhibitors in trächtige Mäuse ab dem embryonalen Tag 13,5 verringert die Aortenstenose und die übermäßige Muskulatur in Mäusen mit Mutation im Gen für das extrazelluläre Matrixprotein Elastin signifikant, verändert jedoch die Aorten von Wildtyp-Mäusen nicht.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann die Platzierung osmotischer Minipumpen in weniger als 10 Minuten abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Mithilfe dieser Verfahren können diese Ansätze außerdem auf die Untersuchung glatter Muskulatur übertragen werden, die nicht vaskulär ist, wie beispielsweise Gewebe des Magen-Darm-Trakts oder der Lunge. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man in-vivo-Embryonal-Fit-Mapping und klonale Analysen durchführt, embryonale Aorten kultiviert, perinatale glatte Muskelzellen der Aorta sowie subkutan implantierte osmotische Minipumpen explantiert.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mäusen, Tamoxifen und einem festen Reduktionsmittel gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel sowie besondere Sorgfalt beachtet werden sollten, wenn diese Verfahren durchgeführt werden.

using-vivo-tissue-cell-explant-approaches-to-study-morphogenesis

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir stellen Ihnen eine ganze-mount Immunhistochemie und konfokaler mit mehreren Kennzeichnung für die Analyse von komplizierten Gefäßnetz Bildung in embryonalen Maus Gliedmaßen Haut.

Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine...

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Pathologie der Aorta kann zu schwerer Morbidität und Mortalität führen, daher ist die Erforschung des Krankheitsverlaufs und möglicher Therapien gerechtfertigt. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Entfernung der murinen Aorta vor, um Forscher bei der Untersuchung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu unterstützen.

Isolierung und Exzision Murine Aorta; Eine vielseitige Technik in das Studium der Herz-Kreislauf-Krankheit

Dieses Manuskript beschreibt eine Technik zur Visualisierung des sich entwickelnden Gefäßsystems. Hier verwendeten wir in utero intrakardiale FITC-markierte Tomaten-Lektin-Mikroinjektionen an Mausembryonen. Mit dieser Technik grenzen wir die perfundierten und undurchbluteten Gefäße in der gesamten embryonalen Niere ab.

In Utero Intraherz Tomato Lektin-Injektionen auf Maus Embryonen zu Nierendurchblutung Messer

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Wir präsentieren ein Protokoll für die Analyse der Herzkranzgefäße in ganzen embryonalen Maus-Herzen bis E15.5, durch optische Clearance und der konfokalen Mikroskopie, gefolgt von immunologischen Standard Färbemethoden verwendet wird. Diese Technik ermöglicht die Darstellung von Blutgefäßen während des gesamten Herzens ohne die Notwendigkeit für zeitaufwendige Analyse von Serienschnitten.

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Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Bei dieser Methode sind embryonale Herz Gewebe chirurgisch Microdissected, dissoziiert, Eindringmittel beschriftet und in Host embryonalen Gewebe implantiert. Dies bietet eine Plattform für das Studium der Einzelperson oder Gewebe Ebene Entwicklungen Organisation unter ektopische hämodynamischen Bedingungen und/oder veränderten parakrine/Juxtacrine Umgebungen.

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Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta (Video) | JoVE Journal

Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta

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