Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, die Bildung der embryonalen und perinatalen Aortenwände während der normalen Entwicklung sowie die Störungen in diesem Prozess während der Krankheit zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Gefäßentwicklung zu beantworten, z. B. woher die Zellen stammen, die zum embryonalen und perinatalen Gefäßmedium beitragen. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie die Bewertung der Pathogenese und Morphogenese der glatten Muskulatur ermöglichen, die während der embryonalen und perinatalen Entwicklungsstadien auftreten.

Die Implikation dieser Techniken ergibt sich aus der Therapie von Gefäßerkrankungen wie der supravalvulären Aortenstenose bei periodischen Erkrankungen, die eine übermäßige Produktion von Sumozellen verursacht. Das Verfahren zur Platzierung der Minipumpe wird von Dr. Jiasheng Zhang durchgeführt, einem Forscher, der ein mikrochirurgisches Zentrum und die Yale University leitet. Beginnen Sie damit, Paarungen zwischen zwei bis sechs Monate alten Mäusen mit Cre ER und Mäusen mit einem Cre-Reporter einzurichten.

Überprüfen Sie jeden Morgen mit einer Metallsonde auf Vaginalpfropfen und trennen Sie das Weibchen vom Mann, wenn ein Pfropfen erkannt wird. Für eine frühe embryonale Induktion injizieren Sie Tamoxifen intraperitoneal in die schwangere Feuchtigkeit. Um Zellen in der mittleren bis späten Schwangerschaftsperiode zu markieren und ihr Schicksal oder ihre Klonalität bei der postnatalen Maus zu verfolgen, injizieren Sie Progesteron in die intraperitoneale Höhle der schwangeren Feuchtigkeit inkompetent mit Tamoxifen in einem Verhältnis von einer zu zwei Dosis.

Um die Embryonen zum richtigen Embryonaldatum zu entnehmen, reinigen Sie den Bauch von der schwangeren Feuchtigkeit mit 70%igem Ethanol und verwenden Sie eine Schere, um den Bauch zu öffnen und die Gebärmutter zu entfernen. Entnehmen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter mit einer Pinzette und einem Stereomikroskop, um sie vorsichtig von der Plazenta und dem Dottersack zu trennen. Fixieren Sie die Embryonen zwei Stunden lang in 4%igem Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius.

Gefolgt von drei Waschgängen in PBS, um das überschüssige Fixiermittel zu entfernen. Nach der dritten Wäsche inkubieren Sie die Embryonen in 30%iger Saccharose in PBS in einzelnen 15-Milliliter-Röhrchen, bis die Embryonen absinken. Füllen Sie anschließend Kunststoff-Gefrierformen mit einer Mischung mit optimaler Schnitttemperatur bis zu zwei Dritteln des maximalen Volumens und platzieren Sie einen Embryo vertikal in jede Form.

Frieren Sie das Gewebe nach 10 Minuten bei Raumtemperatur aufrecht in einem Trockeneisbad mit 70%igem Ethanol ein und stellen Sie die Kryostatentemperatur auf 22 Grad Celsius ein. Schneiden Sie die Gewebeblöcke, um 10 bis 20 Mikrometer dicke Quergewebeschnitte durch die Gesamtheit jeder Aorta zu erzeugen, und erfassen Sie jeden Schnitt auf einem Glasobjektträger, während er gewonnen wird. Wenn alle Proben entnommen wurden, trocknen Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie sie bei 80 Grad Celsius lagern.

Um die Gewebeproben zu färben, tauen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur auf, schützen Sie sie vor Licht, um ein Fluorophorbleichen zu vermeiden, und waschen Sie die Objektträger in 0,1 %PBS Twin 20. Für die klonale Analyse färben Sie das Gewebe mit einem geeigneten Kernfarbstoff und bilden Sie die anderen Flurophore des Regenbogen-Cre-Reporters direkt auf einem Fluoreszenzmikroskop ab. Für die Schicksalskartierung mit dem mTmG cre Reporter können Sie die GFP-Expression durch direkte Bildgebung mit oder ohne Immunfärbung sichtbar machen.

Um eine embryonale Aorta zu kultivieren und zu explantieren, platzieren Sie den Embryo in Rückenlage und befestigen Sie die ausgestreckten Gliedmaßen auf einem Präparierbrett unter einem Stereomikroskop. Machen Sie mit einer Schere einen vertikalen Schnitt vom Bauch durch das Brustbein bis zum oberen Brustkorb. Präparieren Sie feinste Tracheallungen, Speiseröhre, Leber und Darm.

Ziehen Sie das Herz mit einer Pinzette sanft nach ventral und präparieren Sie die Aorta mit einer Schere von der dorsalen Seite der Brust- und Bauchhöhle weg. Schneiden Sie die Aorta an der proximalen Wurzel und den distalen Bauchpositionen ab, um sie zu lösen, und legen Sie die entnommene Aorta in steriles, eiskaltes PBS in eine Zellkulturhaube. Nach einer kurzen Wäsche wird die Aorta in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte überführt, die DMEM-Medium enthält, das mit 0,5 % PBS versetzt ist, und die Platte für bis zu 24 Stunden in einen Zellkultur-Inkubator stellen.

Waschen Sie die Aorta am Ende der Inkubation zweimal mit PBS und fixieren Sie das Gewebe 20 Minuten lang in 4%Paraformaldehyd. Nach drei weiteren PBS-Waschungen übertragen Sie die Aorta in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 30 % Sacprosin-PBS, bis das Gewebe absinkt. Für die Isolierung der glatten Muskulatur der perinatalen Aorta verwenden Sie eine 23-Gauge-Nadel, um den linken Ventrikel einer Maus nach der Geburt von 0,5 zu punktieren, und verwenden Sie einen Plastikschlauch, um die Nadel mit einer sterilen PBS-haltigen Spritze zu verbinden, die vertikal in einer erhöhten Position gehalten wird, so dass das PBS durch die Schwerkraft in den linken Ventrikel fließt.

Wenn die Leber blanchiert, verwenden Sie eine Pinzette, um das Adventsgewebe an der Außenseite der Aorta zu entfernen und die Aorta wie gerade gezeigt zu entnehmen. Dissoziieren Sie das Aortengewebe in 500 Mikrolitern Verdauungslösung mit manuellem Schütteln alle fünf bis 10 Minuten. Nach 45 Minuten wird das Röhrchen in eine sterile Zellkulturhaube überführt und mit einer 200-Mikroliter-Pipette die Gewebeaufschlämmung verzerrt, bis eine Einzelzellsuspension erhalten wurde.

Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, fügen Sie dann zwei Milliliter DMEM hinzu und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Suspendieren Sie das Pellet in drei Millilitern glattem Muskelzellkulturmedium und säen Sie die Zellen auf eine 35-Millimeter-Kulturplatte. Legen Sie dann die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator und erneuern Sie das Zellkulturmedium alle drei Tage.

Um eine subkutane osmotische Minipumpe zu platzieren, beginnen Sie damit, den unteren Rücken einer anästhesierten Maus mit einer Haarschneidemaschine zu rasieren und die Maus in Bauchlage auf eine beheizte chirurgische Platte zu legen. Schrubben Sie den Rücken mit Betadin und Isopropylalkohol und legen Sie die Maus unter ein Stereomikroskop. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um einen 0,5 bis einen Zentimeter langen horizontalen Hautschnitt etwa drei bis fünf Zentimeter rostral zur Basis des Schwanzes zu machen, ohne den darunter liegenden Muskel zu verletzen.

Führen Sie ein Blutstillungsmittel in den Schnitt ein und öffnen und schließen Sie die hämostatischen Kiefer, um eine subkutane Tasche zu schaffen. Führen Sie eine osmotische Minipumpe, die mit dem interessierenden Mittel gefüllt ist, in die Tasche ein und verwenden Sie 6 o nicht resorbierbare Nähte, um den Schnitt zu schließen. Lassen Sie dann die Maus mit Überwachung bis zum Erreichen der sternalen Liege erholen.

Embryonen, die für das Gen mutiert sind, das für das Protein der extrazellulären Matrix, Elastin, kodiert, akkumulieren überschüssige glatte Muskelzellen in den inneren Schichten der Aorta, beginnend nach dem embryonalen Tag 15.5. Die klonale Analyse der glatten Muskelzellen mit dem mehrfarbigen Cre-Reporter während dieses Prozesses deutet darauf hin, dass die Zellen mehrfarbig und somit polyklonal sind. Die Immunfärbung von explantierten Aortenschnitten zeigt, dass die Elastin-mutierten embryonalen Aorten am Tag 15,5 innerhalb von 18 Stunden nach der Kultivierung hypermuskulär und stenodisch werden, ein Prozess, der durch die Zugabe eines Anti-Anti-Antigrin-Beta-3-blockierenden Antikörpers abgeschwächt wird.

Glatte Muskelzellen, die aus der Aorta von Wildtyp-Mäusen isoliert wurden und nach dem Geburtstag 0,5 Marker für glatte Muskelzellen, aber nicht CD31 exprimieren. Die kontinuierliche Infusion eines Integrin-beta-3-Hemmers in schwangere Feuchtmittel, beginnend am embryonalen Tag 13.5, schwächt die Aortenstenose und Hypermuskularisation bei Mäusen, die für das extrazelluläre Matrixprotein Elastin mutiert sind, signifikant ab. Verändern Sie jedoch nicht die Aorten von Wildtyp-Mäusen.

Einmal gemeistert, kann die osmotische Minipumpen-Platzierungstechnik in weniger als 10 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach diesen Verfahren können diese Ansätze auch extrapoliert werden, um die kodierte, nicht-vaskuläre glatte Muskulatur zu untersuchen, wie z. B. das Gewebe des Magen-Darm-Trakts oder der Lungenbereiche. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man In-vivo-Kartierungen der embryonalen Passform und klonalen Analysen durchführt, explantierte embryonale Aortenzellen kultiviert, perinatale glatte Muskelzellen der Aorta kultiviert und subkutane osmotische Minipumpen explantiert.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mäusen, Tamoxifen und einem festen Reducer gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel und besondere Vorsicht bei der Durchführung dieser Verfahren immer getroffen werden sollten.