Differential Scanning Calorimetry - Eine Methode zur Beurteilung der thermischen Stabilität und Konformation von Protein-Antigen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die thermische Stabilität und strukturelle Konformation von Proteinen in einem industriellen Umfeld mit Hilfe der dynamischen Differenzkalorimetrie zu beurteilen. Die dynamische Differenzkalorimetrie misst die molare Wärmekapazität von Proben in Abhängigkeit von der Temperatur und wird seit Jahren erfolgreich zur Beurteilung der thermischen Stabilität und strukturellen Konformation von Proteinen eingesetzt. Dieses relativ einfache Verfahren hängt nicht von struktureller Helizität oder intrinsischen Fluorophoren ab, wie es bei anderen biophysikalischen Methoden der Fall ist.

Ein weiterer Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die thermische Übergangstemperatur und die Energie, die erforderlich ist, um die Wechselwirkung zu stören und die Tertiärstruktur von Proteinen zu stabilisieren, direkt misst. In Verbindung mit der Faszination der Entfaltung kann die thermische Übergangstemperatur als nützlicher Parameter dienen, um die Konsistenz der Herstellungsprozesse für Biologika von Charge zu Charge zu überwachen. Die visuelle Demonstration dieser Methode kann als interaktives Medium dienen, um die neuen Benutzer effektiv bei kritischen Schritten zu unterstützen.

Schalten Sie zunächst das dynamische Differenzkalorimeter ein. Versorgen Sie das System dann mit Stickstoff. Dadurch wird der Druck in den Zellen erhöht, um das Sieden der Proben zu unterdrücken und die Bildung von Blasen bei erhöhten Temperaturen zu verhindern.

Abhängig vom Material der Zelle ist der Druck der Stickstoffgaszufuhr entsprechend dem vom Hersteller empfohlenen Druck einzustellen, um eine Beschädigung der Zelle zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass alle Reinigungsmittelbehälter bis zum erforderlichen Volumen gefüllt sind. Zu den erforderlichen Reinigungsmitteln gehören Reinigungsmittel zum Waschen der Zelle und Wasser zum Reinigen der Zelle nach jedem Probenlauf.

Stellen Sie die Temperatur des Probenhalteraums auf einen geeigneten Wert ein, vorzugsweise fünf Grad Celsius, um die Integrität der Probe vor dem Experiment zu erhalten. Es ist wichtig, die Probe mit dem Puffer zu äquilibrieren, um sicherzustellen, dass der einzige Unterschied zwischen den Lösungen das Protein ist. Daher kann der beobachtete Unterschied in der Wärmekapazität korrekt auf das Protein zurückgeführt werden.

Bestimmen Sie die Konzentration der Proteinprobe mit einer geeigneten Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration, wie z. B. der Lowry-Methode. Für das in diesem Protokoll verwendete Instrument liegt der bevorzugte Arbeitsbereich bei 0,5 bis einem Milligramm Protein pro Milliliter. Dialysieren Sie die Probe gegen den Puffer, der als Referenz für das Experiment verwendet wird.

Entgasen Sie die Probe und den Referenzpuffer in einem Vakuum, um Mikroblasen zu entfernen, die zu Volumenungenauigkeiten führen können. Verwenden Sie bei der Arbeit in einem Laminar-Flow-Bioabdichtungsschrank eine Mikropipette und sterile Spitzen, um die Proben in ihrem jeweiligen Puffer paarweise in 96-Well-Platten zu laden. Füllen Sie die ersten beiden Well-Paare mit Puffer, um Puffer-Puffer-Scans durchzuführen, um die Eignung des Geräts vor der Probenmessung zu überprüfen.

Füllen Sie die letzten beiden Vertiefungspaare mit Wasser für den Wasserscan, um die Zellen zu reinigen. Decken Sie dann die 96-Well-Platte mit Siegelfolie ab. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen ordnungsgemäß abgedichtet sind, bevor Sie die Platte aus der Biosicherheitswerkbank nehmen, um eine Kontamination der Probe zu vermeiden.

Platzieren Sie abschließend die Platte in der richtigen Ausrichtung in das Probenhaltefach. Geben Sie mit der Erfassungssoftware die Probeninformationen in der Reihenfolge ein, in der die Platte eingelegt wurde. Geben Sie die Proteinkonzentrationen ein, falls verfügbar.

Andernfalls geben Sie die Konzentration vor der Datenanalyse in die Analysesoftware ein. Wählen Sie die Option, die sicherstellt, dass die Zelle vor jedem Probenscan mit Reinigungsmittel gereinigt wird. Nach der Reinigung sollten mehrere Wasserspülschritte durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass keine Reinigungsmittelrückstände in den Zellen zurückbleiben.

Stellen Sie die Starttemperatur des Experiments auf 20 Grad Celsius ein, die je nach Probe variieren kann. Für bekannte Proteine kann eine vorgegebene Starttemperatur verwendet werden, während für unbekannte Proben eine niedrigere Starttemperatur angewendet werden kann. Stellen Sie dann die Endtemperatur des Experiments ein.

Auch die Endtemperatur kann je nach Vorwissen über die Probe variieren. Legen Sie als Nächstes die Abtastrate des Experiments fest. Es ist ratsam, unbekannte Proben mit unterschiedlichen Scanraten zu scannen, um die Kinetik der Entfaltung zu beurteilen.

Richten Sie die Erfassungssoftware so ein, dass die Proben erneut gescannt werden, um die Reversibilität des thermischen Übergangs zu untersuchen. Die Entfaltung eines Proteins gilt als reversibel, wenn die für den zweiten Scan erhaltene Enthalpie mindestens 80 % des Enthalpiewerts aus dem ersten Scan beträgt. Stellen Sie den Thermostat nach dem Experiment auf 10 Grad Celsius ein, um die Integrität der Kalorimeterzelle zu erhalten.

Stellen Sie sicher, dass die Setup-Parameter des Experiments korrekt sind, bevor Sie das Experiment ausführen. Wenn alles an seinem Platz ist, starten Sie das Experiment. Führen Sie nach dem Experiment die Datenanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben.

Für die Analyse wird die Basisliniensubtraktion manuell durchgeführt. Konsistenz in diesem Schritt ist entscheidend, um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Hier sehen Sie repräsentative Rohdaten eines Versuchslaufs einschließlich der Puffer- und Wasserscans.

Bei den Proben, die analysiert werden, handelt es sich um Toxine in ihrem nativen und entgifteten Zustand. Die Probenscans werden separat verarbeitet, um die Schmelztemperatur- und Enthalpiewerte für jede Probe abzuleiten. Im nativen Zustand beträgt die Schmelztemperatur 55,55 Grad Celsius und die Enthalpie des Toxins 3,157 mal 10 bis zum Fünftel Kalorien pro Mol.

Umgekehrt beträgt die Schmelztemperatur des Toxins im entgifteten Zustand 81,21 Grad Celsius und die Enthalpie 3,656 mal 10 auf das Fünftel der Kalorien pro Mol. Die Überlagerung der verarbeiteten Daten des Toxins in seinem nativen und entgifteten Zustand zeigt, dass die entgiftete Probe gemäß den Schmelztemperaturwerten thermisch stabiler ist als ihr nativer Zustand. Es deutet auch darauf hin, dass der Entgiftungsprozess strukturelle Veränderungen in der Tertiärstruktur des Toxins mit sich bringt.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, an eine ausreichende Versorgung mit Reinigungsmittel und Wasser zu denken, um eine Kreuzkontamination der Zelle und der Spritze zu vermeiden, da ihre Klarheit für genaue Ergebnisse entscheidend ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie ein gutes Verständnis für die dynamische Differenzkalorimetrie als Methode zur Beurteilung der thermischen Stabilität und Konformation von Proteinen. Sie werden auch in der Lage sein, aussagekräftige Abzüge aus den daraus resultierenden thermischen Läufen vorzunehmen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie z.B. der Zirkulardichroismus durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Veränderungen der Sekundärstrukturen während der Entfaltung zu beantworten. Daten, die für eine Reihe von Chargen desselben Produkts gesammelt wurden, wurden verwendet, um empirische Grundlagen zu schaffen, um die Auswirkungen von Prozessänderungen, Formulierungs- und Lagerbedingungen auf die Strukturkonformation von Proteinantigenen für die Impfstoffproduktion zu untersuchen.