Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, Lipid-proximale Protein-Protein-Wechselwirkungen in vitro zu erfassen. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der mitochondrialen Dynamik zu beantworten, z. B. wie Protein-Protein-Wechselwirkungen an der mitochondrialen Außenmembran durch akzessorische Lipide beeinflusst werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung löslicher Proteindomänen an Lipid-Templates sicherstellt, dass eine nativere Bestätigung erreicht werden kann.

Darüber hinaus können komplexe Wechselwirkungen zwischen löslichen Proteinen und ihren gebundenen Partnern in Gegenwart definierter Lipid-Cofaktoren untersucht werden. Obwohl wir diese Methode verwenden, um Proteininteraktionen in der mitochondrialen Spaltungsmaschinerie zu untersuchen, kann sie auch auf andere Proteinkomplexe angewendet werden, die in verschiedenen Membrankompartimenten lokalisiert sind. Dieses Verfahren wird von Ryan, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert.

Kombinieren Sie zunächst Chloroformlösungen der gewünschten Lipide in einem sauberen Reagenzglas aus Glas. Verdampfen Sie das Lösungsmittel mit trockenem Stickstoffgas, während Sie das Rohr drehen, um einen dünnen Lipidfilm zu bilden. Anschließend entfernen Sie das restliche Lösungsmittel mit dem Zentrifugalverdampfer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.

Anschließend wird vorgewärmter Puffer A hinzugefügt, um eine endgültige Lipidkonzentration von ein bis zwei Millimolaren zu erhalten. 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, mit gelegentlichem Vortexen, um das Lipidgemisch vollständig zu resuspendieren. Nach der Inkubation wird das Lipidgemisch in ein Reagenzglas aus Kunststoff umgefüllt und das Röhrchen etwa 30 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff gelegt, bis es vollständig gefroren ist.

Legen Sie dann die Tube für ein bis zwei Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad, bis sie vollständig aufgetaut ist. Bereiten Sie als Nächstes einen Lipid-Extruder vor, indem Sie vier Filterstützen und einen Polycarbonat-Filter in Puffer A einweichen und den Extruder gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammenbauen. Extrudieren Sie die Lipidlösung 21 Mal mit sanftem, konstantem Druck durch den Filter, um eine homogene Größenverteilung zu gewährleisten.

Verwenden Sie während des Extrudierens langsamen, konstanten Druck, um die Homogenität der Liposomengröße zu gewährleisten. Bei einem Ein-Mikron-Filter ist dies weniger wichtig. Bei kleineren Filtergrößen kann dies jedoch zu einer größeren scheinbaren Heterogenität führen.

Lagern Sie die extrudierten Liposomen bei vier Grad Celsius. Inkubieren Sie den mit His markierten mitochondrialen Spaltfaktor oder Mff mit Gerüstliposomen für mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur in Puffer A und BME. Für eine Mff-freie Kontrolle inkubieren Sie die Liposomen mit einem His-markierten Kontrollprotein wie GFP, um exponiertes Nickel-NTA zu binden und abzuschirmen.

Geben Sie das Dynamin-verwandte Protein One oder Drp1 zur Liposomenmischung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie anschließend fünf Mikroliter der Probe auf ein Blatt Laborfolie und legen Sie ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfer-Rhodium-Gitter auf die Probe. Nach einer Minute Inkubation die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier entfernen und einen Tropfen 2%Uranylacetat hinzufügen.

Entfernen Sie nach einer weiteren Minute Inkubation den überschüssigen Fleck mit Filterpapier und geben Sie die Probe in eine Gitterbox. Am nächsten Tag werden die Proben mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei 18.500- bis 30.000-facher Vergrößerung abgebildet, um ultrastrukturelle Veränderungen in der Protein- und Liposomenmorphologie zu beobachten. Inkubieren Sie His-markierte Mff und Fis1 mit den Gerüstliposomen für 15 Minuten bei Raumtemperatur in Puffer A und BME.

Fügen Sie Drp1 hinzu und inkubieren Sie jede Mischung weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Röhrchen in den auf 37 Grad Celsius eingestellten Thermocycler und initiieren Sie die Reaktionen durch Zugabe von GTP und Magnesiumchlorid. Zu den gewünschten Zeitpunkten werden 20 Mikroliter jedes Reaktionsgemisches in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit fünf Mikrolitern 0,5 molaren EDTA überführt, um das Magnesium zu chelatisieren und die Reaktion zu stoppen.

Bereiten Sie anschließend einen Satz Phosphatstandards vor, indem Sie Kaliumphosphat in Puffer A und BME verdünnen, um die Ergebnisse zu kalibrieren. Geben Sie 20 Mikroliter jedes Standards in die Vertiefungen, die fünf Mikroliter 0,5 molare EDTA enthalten. Geben Sie 150 Mikroliter malachitgrünes Reagenz in jede Vertiefung.

Lesen Sie schließlich den OD 650 fünf Minuten nach jeder Zugabe ab. GTP hydrolysiert langsam in Gegenwart des sauren Malachitgrün-Reagenzes. Daher sollte dieses Reagenz innerhalb von 10 Minuten nach der Messung der Absorption in alle Probenvertiefungen gegeben werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren.

In Abwesenheit von Drp1 führten weder Mff noch GFP zu einer Membranverformung. Und für GFP-dekorierte angereicherte Gerüstliposomen oder ESL wurden nur merkmalslose Liposomen beobachtet. Als jedoch Drp1 zu Mff-dekorierten ESL-Vorlagen hinzugefügt wurde, war eine Umgestaltung der Liposomen offensichtlich.

Dekoration des SL mit Mff-verstärkter GTPase-Aktivität. Umgekehrt, wenn die exponierten NTA-Kopfgruppen mit His-markiertem GFP blockiert wurden, wurde diese erhöhte GTPase-Aktivität abliert. Das Tethering von Fis1, dem die Transmembrandomäne fehlt, führte ebenfalls nicht zu einer Stimulation der GTPase-Aktivität von Drp1.

Ähnlich wie bei der SL führte die Zugabe von SL/Cl zu Drp1 zu einer leichten Stimulation der GTPase-Aktivität, die durch die Bindung von His-markiertem Fis1 oder GFP an die Liposomen rückgängig gemacht wurde. Es wurde eine Synergie zwischen Mff und Cardiolipin beobachtet, da die GTPase-Aktivität von Drp1 um das 2,6-fache stimuliert wurde, wenn es mit Mff-dekoriertem SL/CL inkubiert wurde. Wenn SL/PE/CL-Vorlagen mit Mff verziert wurden, wurde die Drp1-Aktivität verbessert.

Die Fähigkeit von Drp1, Liposomen in Lipidtubuli umzubauen, wurde durch die Zugabe von PE zu den Gerüstliposomen verbessert. Einmal gemeistert, können diese Gerüste innerhalb von Stunden vorbereitet und verwendet werden, wenn das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Protein- und Lipid-Interaktionsmethoden wie Sedimentations- und Lichtstreuassays durchgeführt werden, um funktionelle Wechselwirkungen zu charakterisieren.

Die Anwendung dieser Technik ermöglicht es Menschen, die die Translokation von Proteinen in eine definierte biologische Membran untersuchen, um vorübergehende Proteininteraktionen und den Einfluss spezifischer Lipid-Cofaktoren auf die Bildung und Stabilisierung essentieller zellulärer Anordnungen zu untersuchen.