Name: Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Gerüst-Liposomen zur Rekonstitution lipid-proximaler Protein-Protein-Wechselwirkungen in vitro nutzen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer Dynamik mit nativen Proteinkonformationen.

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Die Autoren möchten sich bei der Finanzierung durch die American Heart Association (SDG12SDG9130039) bedanken.

1. Scaffold Liposome Vorbereitung HINWEIS: eine relativ einfache und featureless Gerüst (bestehend aus DOPC (1,2-Dioleoyl - sn - glycero-3-phosphocholin oder PC) und DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-Dioleoyl, anfänglichen Experimenten sollte Idealer verwenden - sn - glycero-3 - [(N - (5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure) succinyl]. (Nickelsalz)) , das weg von diesen Experimenten Lipidladung, Flexibilität und Krümmung kann als einzelne Faktoren eingeführt werden , mit dem Potential Membran-proximalen Wechselwirkungen zu ändern. Diese Änderung kann durch Zugabe definierter Mengen spezifischer Lipidbestand erreicht werden, einschließlich Phosphatidylserin oder Cardiolipin (CL), Phosphatidylethanolamin (DOPE oder PE) oder Galactosyl (β) Ceramid. <ol><li> Kombinieren Sie in Chloroform in einem sauberen Glas Reagenzglas gelöst Lipide. Dampfe das Lösungsmittel unter trockenem Stickstoffgas, während das Rohr Drehen eines dünnen Lipidfilm zu bilden. Entfernen Restlösungsmittel mit einem centrifugal Verdampfer für 1 h bei 37 ° C. HINWEIS: Verschiedene Liposomenformulierungen werden in den Protokollen beschrieben: Gerüst Liposomen (3,3 Mol-% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7 Mol-% DOPC), Gerüst Liposomen mit Cardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% Cardiolipin / 86,7 mol% DOPC), flexible Gerüst Liposomen mit Cardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% Cardiolipin / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC) und angereichertem Gerüst Liposomen (10 Mol-% DGS-NTA (Ni 2+) / 15 Mol-% Cardiolipin / 35 mol% DOPE / 40 Mol-% DOPC). </li><li> Hinzufügen Puffer A (25 mM HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure), 150 mM KCl, pH eingestellt auf 7,5 mit KOH), vorerhitzt auf 37 ° C, so dass die endgültige Lipidkonzentration von 1 bis 2 mM. Inkubieren 30 min bei 37 ° C unter gelegentlichem Vortexen vollständig das Lipidgemisch (Abbildung 1a) resuspendieren. </li><li> Transfer zu einem Kunststoff-Teströhrchen, das Reagenzglas in flüssigem Stickstoff bis vollständig gefroren (roughly 30 s), und in einem 37 ° C Wasserbad °, bis sie vollständig aufgetaut (ca. 1-2 min). Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Gefrier-Auftau - Zyklen (Abbildung 1b). </li><li> Vorbereiten eines Lipids Extruder durch Einweichen 4 Filterträger und einen Polycarbonatfilter in Puffer und Zusammenbauen des Extruders nach Herstelleranweisungen. Extrudieren der Lipidlösung durch den Filter 21-mal. Verwenden Sie sanft, mit konstantem Druck eine homogene Größenverteilung (Abbildung 1c) zu gewährleisten. HINWEIS: Für alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimenten wurde eine 1,0 um Polycarbonatfilter wurde für die Extrusion verwendet. DRP1 Wechselwirkung mit anionischen Lipide können mit einer Vielzahl von Liposomendurchmessern beobachtet werden , im Bereich von 50 nm bis 400 nm 12 oder größer 13. Daher wurde die Filtergröße von 1 um als ideal sowohl GTPase-Aktivität ausgewählt und für die Elektronenmikroskopie. Wenn andere Liposoms Durchmesser gewünscht sind, Herstellung von riesigen unilamellaren Vesikeln 14,15 (GUVs) oder kleine unilamellar Vesikel 16 (SUVs) verwendet werden. Dynamische Lichtstreuung verwendet werden , um Liposomengrößenheterogenität 13 beurteilen. </li><li> Lagerung von extrudierten Liposomen bei 4 ° C und entsorgen Sie nach 3 bis 5 d. </li></ol> 2. Verwendung von Scaffold Liposome für die Proteinbindungsanalyse <ol><li> Probenvorbereitung <ol><li> Für mindestens 15 min; inkubieren MffΔTM (5 &amp; mgr; M final) mit Gerüst Liposomen (50 uM final 40 Mol-% PC / 35 Mol-% PE / 15 Mol-% CL / 10 Mol-% DGS-NTA (Ni 2+)) His-tagged bei RT in Puffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol (BME), pH auf 7,5 mit KOH eingestellt). Für eine Mff freie Steuerung, bebrüten Liposomen mit einem His-markierten Kontrollprotein (wie GFP) zu binden und Schirm ausgesetzt NTA (Ni 2+). HINWEIS: MffΔTM wurde exprimiert und gereinigt , wie in einer früheren Studie 2 beschrieben. GFP wurde in ähnlicher Weise gereinigt, aber die Ionenaustauschschritt weggelassen wurde. BME wurde für diese experimen erforderlichts da ist DRP1 oxidationsempfindlich, die ihre Aktivität und Montageeigenschaften verändern kann. </li><li> In DRP1 (2 uM final) und Inkubation für 1 h bei RT. HINWEIS: Es wurde DRP1 exprimiert und gereinigt , wie in einer früheren Studie 2 beschrieben. Nach Inkubation mit DRP1, kann die Wirkung der Nukleotid - Bindungs auf Membranverformung durch Inkubation eine weitere Stunde mit 2 mM MgCl 2 und entweder 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP, oder Puffer A + BME sucht werden. </li></ol></li><li> Negative Stain Transmissions-Elektronenmikroskopie (EM) Analyse <ol><li> Transfer 5 ul der Probe auf ein Blatt Laborfolie und legen eine kohlenstoffbeschichteten Cu / Rh Gitter auf der Probe. Inkubieren Sie die Gitter 1 min auf der Probe, auslöschen überschüssige Flüssigkeit auf Filterpapier entfernt und übertragen zu einem Rückgang von 2% Uranylacetat. Inkubieren 1 min, auslöschen Überschuss Fleck auf Filterpapier und übertragen auf eine Gitterbox. Shop unter Vakuum O / N Vollaustrocknungs zu gewährleisten. </li><li> Bild Proben mit einem Transmissions-Elektronen-Microsc mitope bei 18.500 - 30.000 - facher Vergrößerung ultrastrukturelle Veränderungen in Protein und Liposom - Morphologien 17 zu beachten. Hinweis: Elektronenmikroskopische Veränderungen quantifiziert werden können Bildanalyse - Software, wie ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein Dekoration kann gemessen werden, wenn im Vergleich mit nackten Lipid-Vorlagen. Außerdem können die Durchmesser der rohrförmigen Segmente aus dem äußersten Abschnitt der 13 Baugruppen gemessen werden. Eine genauere Analyse kann Kryo-Elektronenmikroskopie 17 durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann ohne den Einsatz von Schwermetall Flecken, die Beschichtung der Probe in Lösungsmittel native Protein-Lipid-Baugruppen Bild verwendet werden. Auf diese Weise können detaillierte strukturelle Merkmale nicht in Negativfärbung erkennbar, einschließlich Änderungen in der darunter liegenden Lipid Morphologie kann untersucht und quantifiziert werden. </li></ol></li></ol> 3. Verwendung von Scaffold Liposome für enzymatische Assay Hinweis: A Colorimetrische GTPase - Test 18 wurde verwendet , Phosphat Befreiung über die GTP - Hydrolyse zu messen. Alternative GTPase - Assays sind 19 verfügbar und können je nach Bedarf umgesetzt werden. <ol><li> Inkubieren His-tagged MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1) oder GFP (5 uM final für alle) mit Gerüst Liposomen (150 &amp; mgr; M final) für 15 min bei RT in Puffer A + BME (Volumen = 30 &amp; mgr; l). In DRP1 (500 nM endgültige) und Inkubation weitere 15 min bei RT (Volumen = 80 &amp; mgr; l). HINWEIS: Fis1 wurde in ähnlicher Weise wie Mff 2, aber der Ionenaustausch - Chromatographie - Schritt weggelassen wurde gereinigt. Der Zweck His-Tag GFP ist es, die NTA (Ni 2+) Kopfgruppen zu schützen und nicht - spezifische Ladungs Wechselwirkungen mit anderen Proteinen zu verhindern. Wenn keine Wirkung in Abwesenheit von GFP beobachtet wird, dann kann diese Steuerung nicht erforderlich. Alternative blockieren Proteine ​​(von vergleichbarer Größe wie das Protein von Interesse) können auch verwendet werden, aber GFP ermöglicht die direkte Visualisierung der Wechselwirkungen mit scaffalten Liposomen. </li><li> Übertragungsrohre zu einem Thermocycler auf 37 ° C eingestellt und initiieren Reaktionen durch Zugabe von GTP und MgCl 2 (1 mM und 2 mM final sind; Volumen = 120 ul). </li><li> Zu gewünschten Zeitpunkten (dh T = 5, 10, 20, 40, 60 min), Transfer 20 ul Reaktion auf Vertiefungen einer Mikrotiterplatte , enthaltend 5 &amp; mgr; l 0,5 M EDTA Mg 2+ zu chelatisieren und die Reaktion zu stoppen. </li><li> Einen Satz von Phosphat - Standards von KH 2 PO 4 in Puffer A + BME Verdünnung Ergebnisse zu kalibrieren. Ein nützlicher Satz von Standards ist 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 und 0 &amp; mgr; M. Geben Sie 20 &amp; mgr; l von jedem zu den Vertiefungen, enthaltend 5 &amp; mgr; l von 0,5 M EDTA. </li><li> Fügen Sie 150 ul von Malachitgrün - Reagenz (1 mM Malachitgrün Carbinol, 10 mM Ammoniummolybdattetrahydrat und 1 N HCl) in jede Vertiefung und lesen OD 650 5 min nach der Zugabe. HINWEIS: GTP ist säurelabil und wird in Gegenwart von Malachitgrün-Reagenz hydrolysieren. Stellen Sie sicher, dass ter Zeit zwischen Zugabe von Malachit-Reagenz und das Lesen ist konstant reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. </li><li> Generieren Sie eine Standardkurve von OD 650 der Standards als Funktion der Phosphatkonzentration aufgetragen ist . Verwenden der linearen Regression , die die Beziehung zwischen OD 650 und Phosphatkonzentration in einer Probe zu bestimmen. </li><li> Mit Hilfe der linearen Regression, wandeln die OD 650 der Proteinreaktionsproben zu uM Phosphat. Bestimmen die Rate der Phosphat - Generierung für jedes Reaktionsgemisch durch Phosphatkonzentration als Funktion der Zeit aufgetragen, und konvertieren cat k durch die Rate der Konzentrations DRP1 Dividieren (0,5 uM). HINWEIS: Nur der linearen Anfangsgeschwindigkeit sollte die Rate der Phosphaterzeugung und mindestens 3 Datenpunkte, um zu bestimmen, verwendet werden müssen, verwendet werden. Wenn die Reaktionsgeschwindigkeit ausreichend schnell ist , dass die ersten drei Datenpunkte nicht linear sind (dh der r 2 der linearen Anpassung kleiner als 0,9) ein Zeichenificantly kürzere Zeitverlauf mit mindestens 3 Zeitpunkten durchgeführt werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll bietet ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen integralen Membranproteinen. Durch ein modulares Gerüst Liposom verwendet wird, sind Forscher, die die Aktivität eines oder mehrerer Proteine ​​in einer Lipid-Umgebung proximal zu beurteilen. 26 - Frühere Studien haben eine ähnliche Methode für die Rezeptorenzyme der Plasmamembran 24 gezeigt. Wir haben dieses Verfahren erweitert, um Lipid-Cofaktoren integrieren und zu erforschen Wechselwi...

Studium membran proximal Protein-Protein - Wechselwirkungen ist eine herausfordernde Fangen wegen der Schwierigkeit in der natürlichen Umgebung der integralen Membranproteine beteiligt rekapituliert 1. Dies ist aufgrund der Notwendigkeit des Waschmittels Solubilisierung und der inkonsistenten Orientierung von Proteinen in Proteoliposomen. Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir eine Strategie eingesetzt , wobei lösliche Membrandomänen integraler Membranproteine exprimiert werden als His-Tag - Fusionsproteine, und diese löslichen Fragmente werden auf Gerüst Liposomen über Wechselwirkungen mit NTA (Ni 2+) Kopfgruppen am Lipid verankert Oberfläche. Unter Verwendung dieser Gerüste, lipid-proximale Protein-Wechselwirkungen können über einen Bereich von Lipid- und Proteinzusammensetzungen untersucht werden. Wir haben effektiv diese Methode angewandt, um die kritische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, die Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer regieren und Lipid-Wechselwirkungen zu untersuchen, die diese pr modulierenocess 2. Während mitochondrialen Spaltung, eine konservierte Membran - Remodeling - Protein, Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) 3 genannt, wird auf die Oberfläche der äußeren Mitochondrienmembran (OMM) in Reaktion auf zelluläre Signale eingestellt , die Energie - Homöostase, apoptotische Signal regulieren, und mehrere andere Integral mitochondrialen Prozesse. 8 - Dieses große wird zytosolische GTPase an die Oberfläche der Mitochondrien durch Wechselwirkungen mit Proteinen integral OMM 4 eingestellt. Die Rolle eines solchen Proteins, Mitochondrial Fission Factor (MFF), ist schwierig gewesen , aufgrund einer scheinbaren schwache Wechselwirkung mit DRP1 in vitro zu untersuchen. Dennoch haben genetische Studien eindeutig gezeigt , dass Mff für eine erfolgreiche mitochondrialen Spaltung 7,8 wesentlich ist. Das Verfahren in diesem Manuskript beschrieben konnte früheren Mängel zu überwinden, indem die gleichzeitige Lipid-Wechselwirkungen, die Einführung von DRP1-Mff Wechselwirkungen fördern. Insgesamt ist dieses neuen Assay REVEAführte fundamentalen Wechselwirkungen der Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer Führung und eine neue Etappe für die laufende strukturelle und funktionelle Untersuchungen dieser wesentlichen molekularen Maschine zur Verfügung gestellt. Bislang Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen DRP1 und Mff haben durch die inhärente Flexibilität der Mff 9, die Heterogenität der DRP1 Polymeren 2,10, und die Schwierigkeit bei der Reinigung und Rekonstitution von voller Länge Mff mit einer intakten Transmembran- Domäne 11 kompliziert. Wir adressiert diese Herausforderungen mithilfe von NTA (Ni 2+) Gerüst Liposomen His-markierte Mff fehlt seine Transmembran - Domäne (MffΔTM-His 6) zu rekonstruieren. Diese Strategie war vorteilhaft , da MffΔTM extrem gut löslich war , als überexprimiert in E. coli, und das isolierte Protein wurde auf Gerüst Liposomen leicht wiederhergestellt. Wenn auf diese Lipid templates gebunden, angenommen Mff eine identische, nach außen weisende Orientierung an der Oberfläche der Membran.Zusätzlich zu diesen Vorteilen wurden mitochondrialen Lipiden, wie Cardiolipin, hinzugefügt Mff Faltung und Assoziation mit der Membran 11 zu stabilisieren. Cardiolipin interagiert auch mit der variablen Domäne der DRP1 2,12 welche diese ungeordneten Bereich stabilisieren kann und die Montage der Spaltmaschinen erleichtern. Diese robuste Methode ist allgemein anwendbar für zukünftige Studien, die Membran-proximalen Protein-Wechselwirkungen zu bewerten suchen. Durch den Einsatz von zusätzlichen Anbinden / affine Wechselwirkungen kann die Komplexität dieser Membran Rekonstitution Untersuchungen verbessert werden zusätzliche Komplexität an der Oberfläche der Membranen in Zellen zu imitieren. Zur gleichen Zeit, Lipidzusammensetzungen können modifiziert werden, um mehr, um genau die nativen Umgebungen dieser makromolekularen Komplexen nachahmen. Zusammenfassend stellt dieses Verfahren ein Mittel, um die relativen Beiträge von Proteinen und Lipiden in der Gestaltung Membranmorphologien bei kritischen zellulären proc zu untersuchenzesse.

<table><tbody><tr><td>Phosphatidylcholin (DOPC)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylethanolamin (DOPE)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DGS-NTA(Ni2+)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>Rinderherz Cardiolipin (CL)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>268320010</tr><tr><td>Liposomen-Extruder</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Cu/Rh Negative Fleckengitter</td><td>Ted Pella</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofugenröhrchen</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Streifen</td><td>Thermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie Farbstoff</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Acros Organics</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE Gel</td><td>Bio Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Loading Dye</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Malachitgrün Carbinol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>229105</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Molybdat Tetrahydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Laborfilm</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai T12 100 keV Mikroskop</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated CentriVap Konzentrator</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax Mikroplatten-Reader</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

scaffold liposomen zu rekonstituieren lipid-proximalen protein-protein-wechselwirkungen in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studien von integralen Membranproteinen in vitro sind durch die Anwesenheit einer hydrophoben Transmembrandomäne häufig kompliziert. Weitere diese Studien zu verkomplizieren, reincorporation von Waschmittel-solubilisierte Membranproteine ​​in Liposomen ist ein stochastischer Prozess, in dem Protein-Topologie zur Durchsetzung unmöglich ist. Dieses Papier bietet eine alternative Methode, um diese anspruchsvollen Techniken, die ein Liposom-basierten Gerüst verwendet. Protein Löslichkeit wird durch die Deletion der Transmembrandomäne erhöht und diese Aminosäuren sind mit einem Anbinden Einheit ersetzt, wie beispielsweise ein His-Tag. Dieser Haltegurt wirkt mit einer Ankergruppe (Ni 2+ koordiniert von Nitrilotriessigsäure (NTA (Ni 2+)) für His-markierte Proteine), die an der Oberfläche des Liposoms eine einheitliche Protein - Topologie erzwingt. Ein Beispiel präsentiert wird, wobei die Wechselwirkung zwischen Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) mit einem integralen Membranprotein, Mitochondrial Fission Factor (MFF) wurde investigated dieses Gerüst Liposom-Verfahren. In dieser Arbeit haben wir die Fähigkeit von Mff demonstriert effizient löslich DRP1 an die Oberfläche von Liposomen zu rekrutieren, die ihre GTPase-Aktivität stimuliert. Darüber hinaus war DRP1 der Lage, die MFF-dekorierten Lipid-Vorlage in Gegenwart von spezifischen Lipiden tubulate. Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit der Gerüst Liposomen strukturellen und funktionellen Assays und unterstreicht die Rolle von Mff Aktivitäts DRP1 regulieren.

Während die Interaktion zwischen DRP1 und Mff nachgewiesen wurde für mitochondriale Spaltung wichtig zu sein, hat diese Interaktion schwierig gewesen , in vitro zu rekapitulieren. Unser Ziel war es besser, die zelluläre Umgebung emulieren, wobei DRP1 und Mff interagieren. Zu diesem Zweck Liposomen , die Grenzkonzentrationen von NTA (Ni 2+) Kopfgruppen wurden durch Rehydratisieren ein Lipidfilm hergestellt , wie oben beschrieben. Die Lipidlösung besteht zunächst aus un...

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Bewertung der Wechselwirkungen und Assemblierungen von integralen Membranproteinen in vitro mit verschiedenen Partnerfaktoren in einer lipidproximalen Umgebung.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, Lipid-proximale Protein-Protein-Wechselwirkungen in vitro zu erfassen. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der mitochondrialen Dynamik zu beantworten, z. B. wie Protein-Protein-Wechselwirkungen an der mitochondrialen Außenmembran durch akzessorische Lipide beeinflusst werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung löslicher Proteindomänen an Lipid-Templates sicherstellt, dass eine nativere Bestätigung erreicht werden kann.Darüber hinaus können komplexe Wechselwirkungen zwischen löslichen Proteinen und ihren gebundenen Partnern in Gegenwart definierter Lipid-Cofaktoren untersucht werden. Obwohl wir diese Methode verwenden, um Proteininteraktionen in der mitochondrialen Spaltungsmaschinerie zu untersuchen, kann sie auch auf andere Proteinkomplexe angewendet werden, die in verschiedenen Membrankompartimenten lokalisiert sind. Dieses Verfahren wird von Ryan, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert.Kombinieren Sie zunächst Chloroformlösungen der gewünschten Lipide in einem sauberen Reagenzglas aus Glas. Verdampfen Sie das Lösungsmittel mit trockenem Stickstoffgas, während Sie das Rohr drehen, um einen dünnen Lipidfilm zu bilden. Anschließend entfernen Sie das restliche Lösungsmittel mit dem Zentrifugalverdampfer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.Anschließend wird vorgewärmter Puffer A hinzugefügt, um eine endgültige Lipidkonzentration von ein bis zwei Millimolaren zu erhalten. 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, mit gelegentlichem Vortexen, um das Lipidgemisch vollständig zu resuspendieren. Nach der Inkubation wird das Lipidgemisch in ein Reagenzglas aus Kunststoff umgefüllt und das Röhrchen etwa 30 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff gelegt, bis es vollständig gefroren ist.Legen Sie dann die Tube für ein bis zwei Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad, bis sie vollständig aufgetaut ist. Bereiten Sie als Nächstes einen Lipid-Extruder vor, indem Sie vier Filterstützen und einen Polycarbonat-Filter in Puffer A einweichen und den Extruder gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammenbauen. Extrudieren Sie die Lipidlösung 21 Mal mit sanftem, konstantem Druck durch den Filter, um eine homogene Größenverteilung zu gewährleisten.Verwenden Sie während des Extrudierens langsamen, konstanten Druck, um die Homogenität der Liposomengröße zu gewährleisten. Bei einem Ein-Mikron-Filter ist dies weniger wichtig. Bei kleineren Filtergrößen kann dies jedoch zu einer größeren scheinbaren Heterogenität führen.Lagern Sie die extrudierten Liposomen bei vier Grad Celsius. Inkubieren Sie den mit His markierten mitochondrialen Spaltfaktor oder Mff mit Gerüstliposomen für mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur in Puffer A und BME. Für eine Mff-freie Kontrolle inkubieren Sie die Liposomen mit einem His-markierten Kontrollprotein wie GFP, um exponiertes Nickel-NTA zu binden und abzuschirmen.Geben Sie das Dynamin-verwandte Protein One oder Drp1 zur Liposomenmischung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie anschließend fünf Mikroliter der Probe auf ein Blatt Laborfolie und legen Sie ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfer-Rhodium-Gitter auf die Probe. Nach einer Minute Inkubation die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier entfernen und einen Tropfen 2%Uranylacetat hinzufügen.Entfernen Sie nach einer weiteren Minute Inkubation den überschüssigen Fleck mit Filterpapier und geben Sie die Probe in eine Gitterbox. Am nächsten Tag werden die Proben mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei 18.500- bis 30.000-facher Vergrößerung abgebildet, um ultrastrukturelle Veränderungen in der Protein- und Liposomenmorphologie zu beobachten. Inkubieren Sie His-markierte Mff und Fis1 mit den Gerüstliposomen für 15 Minuten bei Raumtemperatur in Puffer A und BME.Fügen Sie Drp1 hinzu und inkubieren Sie jede Mischung weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Röhrchen in den auf 37 Grad Celsius eingestellten Thermocycler und initiieren Sie die Reaktionen durch Zugabe von GTP und Magnesiumchlorid. Zu den gewünschten Zeitpunkten werden 20 Mikroliter jedes Reaktionsgemisches in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit fünf Mikrolitern 0,5 molaren EDTA überführt, um das Magnesium zu chelatisieren und die Reaktion zu stoppen.Bereiten Sie anschließend einen Satz Phosphatstandards vor, indem Sie Kaliumphosphat in Puffer A und BME verdünnen, um die Ergebnisse zu kalibrieren. Geben Sie 20 Mikroliter jedes Standards in die Vertiefungen, die fünf Mikroliter 0,5 molare EDTA enthalten. Geben Sie 150 Mikroliter malachitgrünes Reagenz in jede Vertiefung.Lesen Sie schließlich den OD 650 fünf Minuten nach jeder Zugabe ab. GTP hydrolysiert langsam in Gegenwart des sauren Malachitgrün-Reagenzes. Daher sollte dieses Reagenz innerhalb von 10 Minuten nach der Messung der Absorption in alle Probenvertiefungen gegeben werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren.In Abwesenheit von Drp1 führten weder Mff noch GFP zu einer Membranverformung. Und für GFP-dekorierte angereicherte Gerüstliposomen oder ESL wurden nur merkmalslose Liposomen beobachtet. Als jedoch Drp1 zu Mff-dekorierten ESL-Vorlagen hinzugefügt wurde, war eine Umgestaltung der Liposomen offensichtlich.Dekoration des SL mit Mff-verstärkter GTPase-Aktivität. Umgekehrt, wenn die exponierten NTA-Kopfgruppen mit His-markiertem GFP blockiert wurden, wurde diese erhöhte GTPase-Aktivität abliert. Das Tethering von Fis1, dem die Transmembrandomäne fehlt, führte ebenfalls nicht zu einer Stimulation der GTPase-Aktivität von Drp1.Ähnlich wie bei der SL führte die Zugabe von SL/Cl zu Drp1 zu einer leichten Stimulation der GTPase-Aktivität, die durch die Bindung von His-markiertem Fis1 oder GFP an die Liposomen rückgängig gemacht wurde. Es wurde eine Synergie zwischen Mff und Cardiolipin beobachtet, da die GTPase-Aktivität von Drp1 um das 2,6-fache stimuliert wurde, wenn es mit Mff-dekoriertem SL/CL inkubiert wurde. Wenn SL/PE/CL-Vorlagen mit Mff verziert wurden, wurde die Drp1-Aktivität verbessert.Die Fähigkeit von Drp1, Liposomen in Lipidtubuli umzubauen, wurde durch die Zugabe von PE zu den Gerüstliposomen verbessert. Einmal gemeistert, können diese Gerüste innerhalb von Stunden vorbereitet und verwendet werden, wenn das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Protein- und Lipid-Interaktionsmethoden wie Sedimentations- und Lichtstreuassays durchgeführt werden, um funktionelle Wechselwirkungen zu charakterisieren.Die Anwendung dieser Technik ermöglicht es Menschen, die die Translokation von Proteinen in eine definierte biologische Membran untersuchen, um vorübergehende Proteininteraktionen und den Einfluss spezifischer Lipid-Cofaktoren auf die Bildung und Stabilisierung essentieller zellulärer Anordnungen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Um die Wechselwirkung eines Proteins mit seiner Ziel-Lipid verwendeten wir MACS und Annexin V-konjugierten magnetischen Kügelchen und Lipid-Vesikel, die aus der Ziel-Lipid-und Annexin V-Bindung Phosphatidylserin synthetisiert testen. Gebundene Proteine ​​zum Ziel Lipid sind co-gereinigt und analysiert nach der Elution von den Beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

Hier präsentieren wir ein Protokoll Single, SNARE-vermittelte Fusion Ereignisse zwischen Liposomen und unterstützt Bilayer in mikrofluidischen Kanälen unter Verwendung von polarisierten TIRFM, mit Einzelmolekülempfindlichkeit und ~ 15 ms Zeitauflösung zu erfassen. Lipid und lösliche Ladung Freisetzung können gleichzeitig erfasst werden. Liposomgröße, Lipid-Diffusität und Fusion Poreneigenschaften gemessen werden.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

Hier präsentieren wir zwei ultraschnelle Protokolle zur Rekonstitution von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes und Verschmelzung von solchen Proteoliposomes mit Ziel Lipid Bilayer für Waschmittel-freie Lieferung dieser Membran Proteine in der postfusion Bilayer. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht schnelle und leichtführig Montage von komplexen Mehrkomponenten Membransystemen.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Wir bieten ein Protokoll für in-vitro- Assays der Selbstorganisation von Verstand und mir auf einem unterstützten Lipid Bilayer in eine offene Kammer. Darüber hinaus beschreiben wir, wie der Assay in Lipid-plattiert PDMS Microcompartments in Vivo -Bedingungen durch Reaktion Entbindung imitieren einzuschließen.

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Die biologische Membranfusion wird durch spezialisierte Fusionsproteine katalysiert. Die Messung der fusogenen Eigenschaften von Proteinen kann durch Lipid-Mischtests erreicht werden. Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung des rekombinanten Drosophila Atlastin, ein Protein, das die homotypische Fusion des ER vermittelt, es zu vorgeformten Liposomen restituiert und auf Fusionskapazität getestet wird.

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Mitochondriale Fusion ist eine wichtige panostatische Reaktion, die der mitochondrialen Dynamik zugrunde liegt. Hier wird ein In-vitro-Rekonstitutionssystem beschrieben, um die mitochondriale Innenmembranfusion zu untersuchen, die Membran-Tethering, Andocken, Hämifusion und Porenöffnung auflösen kann. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes bei der Erforschung von Zellmembransystemen wird diskutiert.

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes zellfreies Verfahren zur Herstellung von hochwertigem Proteoliposom mittels Doppelschichtdialysemethode unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Diese Methode bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Entwicklung von Antikörpern.

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von Zell-imitierenden Uni-Lipid- und Multi-Lipid-Vesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Diese In-vitro-Modelle können angepasst werden, um eine Vielzahl von Lipidtypen zu integrieren und können verwendet werden, um verschiedene Molekül- und Makromolekül-Interaktionen zu untersuchen.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

In diesem Artikel wird eine einfache Ein-Topf-Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken innerhalb von phasengetrennten Riesenvesikeln vorgestellt. Die Methode kann verallgemeinert und auf die Verkapselung oder den Einschluss einer Vielzahl von Biomolekülen angewendet werden.

In vitro Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs)

Erfahren Sie, wie Sie Gerüst-Liposomen zur Rekonstitution lipid-proximaler Protein-Protein-Wechselwirkungen in vitro nutzen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer Dynamik mit nativen Proteinkonformationen.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro

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