Methoden Epithelial Transportprotein Funktion und Expression in Mutterdarm und Caco-2-Zellen gezüchtet in 3D zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, intestinale Caco-2-Zellen dreidimensional zu kultivieren und die Anwendung der Ussing-Kammer bei Untersuchungen zur Regulation des Serotonintransporters zu demonstrieren. Die hier gezeigten Methoden können zentrale Fragen im Bereich des epithelialen Transports beantworten, beispielsweise wie der intestinale Serotonintransporter SERT reguliert wird. Der Hauptvorteil der 3D-Caco-2-Kultur liegt darin, dass sie die Interaktionen zwischen Zellen sowie zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix genauer widerspiegelt als Zellschichten in Monokultur.

Mit der Ussing-Kammer-Technik lassen sich Transportfunktionen im Darmepithel präzise messen. Die Verwendung von 3D-Caco-Kulturen eröffnet zudem Möglichkeiten zur Therapeutika-Entwicklung, da diese Modelle die Testung von Wirkstoffen gegen Erkrankungen mit gestörter Transportfunktion ermöglichen. Obwohl diese Methode Aufschluss über die Regulation des Serotonintransporters gibt, kann sie auch auf Untersuchungen anderer Elektrolyttransporter wie Natrium und Chlorid angewandt werden.

Die visuelle Demonstration dieser Techniken ist entscheidend, da das Abtrennen der seromuskulären Schicht und das Einlegen der Darmmukosa in Ussing-Kammern schwer zu erlernen sind. Die Demonstration der 3D-Caco-2-Zellverfahren übernimmt Ishita Chatterjee, Dozentin, und Anoop Kumar, ein Postdoktorand aus unserer Gruppe. Die Demonstration des Abtrens der seromuskulären Schicht aus dem Mausileum übernimmt Sangeeta Tyagi, eine leitende Wissenschaftsspezialistin aus meinem Labor.

Weiterhin demonstrieren Shubha Priyamvada und Arivarasu Natarajan, Dozenten aus meinem Labor, das Aufbringen der entfetteten Mukosa und deren Einbringung in Ussing-Kammern. Zunächst tauen Sie die wachstumsfaktorreduzierte, gelatinöse Proteinslösung über Nacht auf Eis in einem vier Grad Celsius kalten Kühlschrank auf. Nach dem Auftauen bereiten Sie Aliquots von einem Milliliter oder 500 Mikroliter vor.

Am Tag der Kultur die Kammerobjektträger auf Eis vorkühlen. Anschließend 30 Mikroliter der gelatinösen Proteinslösung in jede Vertiefung des achtlochigen Kammerobjektträgers geben und gleichmäßig verteilen. Beim Auftragen der gelatinösen Mischung auf den Kammerobjektträger oder Platten ist darauf zu achten, dass keine Blasen entstehen, da sonst die Zellen ablösen könnten.

Stellen Sie die Kulturschale für 15 bis 30 Minuten in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius, damit die Lösung erstarren kann. Danach lösen Sie konfluente Caco-2-Zellen mithilfe von Trypsin aus einem Kulturkolben. Zählen Sie die Zellen danach in einem Hämozytometer und zentrifugieren Sie sie bei vier Grad Celsius mit 500 × g für fünf Minuten.

Suspendieren Sie das resultierende Zellpellet in 3D Caco-2-Medium, um eine Suspension der gewünschten Dichte zu erhalten. Mit der hergestellten Zellsuspension 4.000 Zellen pro Vertiefung auf Glaskammernplatten ansäen und 12 bis 14 Tage lang in einem feuchten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C wachsen lassen. Um die Zellen anzufärben, zunächst das Medium abpipettieren und die Zellen mit 400 µL 2 % PFA fixieren.

Fixieren Sie die Zellen weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen zweimal mit PBS gewaschen haben, permeabilisieren Sie sie mit einer 0,5 %igen Triton-Lösung in PBS nicht länger als 15 Minuten. Spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS-Glycin-Puffer ab und waschen Sie die permeabilisierten Zellen anschließend zehn Minuten bei Raumtemperatur im IF-Puffer.

Blocken Sie die Zellen mit 5 % normalem Ziegenserum im IF-Puffer. Anschließend inkubieren Sie die Zellen mit 200 Mikroliter Primärantikörper, verdünnt im IF-Puffer, der mit 1 % Ziegenserum ergänzt wurde, eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit IF-Puffer.

Die gewaschenen Zellen mit 200 µL sekundärem Antikörper inkubieren, der in IF-Puffer mit 1 % Ziehenserum verdünnt ist, für eine Stunde bei Raumtemperatur. Die Zellen dreimal zehn Minuten lang mit IF-Puffer waschen. Um die Kammer vom Objektträger zu lösen, zuerst den Objektträger in den Halter des Objektträgerständers platzieren, dann den weißen Heber durch den Halter schieben, bis er die Kante der Vertiefungen erreicht.

Ziehen Sie vorsichtig an der Kammer, um sie vom Objektträger zu entfernen. Schützen Sie die Objektträger vor Licht mithilfe einer abgedeckten schwarzen Box. Montieren Sie die Objektträger mit einem langsam aushärtenden Anti-Fade-Medium und decken Sie sie mit Deckgläsern ab.

Nachdem die Objektträger zehn Minuten bei Raumtemperatur trocknen konnten, verschließen Sie diese vor der Bildaufnahme mit Nagellack. Isolieren Sie das Ileum der Maus gemäß dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren. Öffnen Sie dann mit einer Schere den Darm in longitudinaler Richtung.

Die resultierende Gewebeschnittprobe zehn Minuten lang in eiskaltem, mit Gas versetztem KBR-Puffer mit einem Mikromolar Indomethacin inkubieren. Ein etwa einen Zentimeter langes Darmstück mit der Schleimhautseite nach unten auf eine Platte mit einer 0,5 Zentimeter dicken Schicht aus 7 % Agarose oder ausgehärtetem Silikonelastomer aufspießen. Mithilfe eines Auflicht-Dissektionsstereomikroskops die seromuskulären Schichten abtrennen.

Danach schneiden Sie die seromuskuläre Schicht mit einer Federklinge. Heben Sie mit feinen Pinzetten den Rand der Schicht entlang der Längsachse des Darms an. Schließlich befestigen Sie die Mukosa vorsichtig an den Stiften des Objektträgers.

Halten Sie das entfleischte Schleimhautgewebe an den Rändern fest, um Einrisse zu vermeiden. Beim Aufspannen der entfleischten Ilealschleimhaut an den Stiften des Halterungsobjektträgers sind Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, um Beschädigungen des Gewebes an den Stiftköpfen zu verhindern und die Schädigung der Geweberänder zu minimieren. Vor der Gewebebehandlung bereiten Sie eine mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid gasgesättigte Krebs-Lösung vor.

Danach die Lösung in eine Ussing-Kammer geben. Fügen Sie 10 µM Glukose als Energiesubstrat zum serösen Bad und 10 µM Mannitol zur Aufrechterhaltung des osmotischen Gleichgewichts zum mukösen Bad hinzu. Anschließend wird der Schieber mit der montierten Mukosa in die Kammer eingesetzt, um sowohl die apikale als auch die basolaterale Seite des Gewebes der Krebs-Lösung auszusetzen.

Äquilibrieren Sie das ileale Gewebe im Bad für zehn Minuten. Behandeln Sie anschließend die apikale Seite 30 Minuten lang mit 10 Mikromolar Fluoxetin zur Messung des mukosalen zu serosalen Flusses. Behandeln Sie schließlich die basolaterale Seite des Gewebes eine Stunde lang mit 10 Nanogramm pro Milliliter TGF-beta-1 und inkubieren Sie danach die apikale Seite 30 Minuten lang mit 20 Nanomolar tritiiertem 5-HT.

Um die Flussraten von der Mukosa zur Serosa zu berechnen, sammeln Sie 0,75 ml Aliquote aus dem serosalen Reservoir und ersetzen Sie diese durch identische Volumina des Badmediums, um hydrostatische Druckunterschiede über die Mukosa hinweg zu vermeiden. Um die im Gewebe angereicherte tritierte 5-HT zu quantifizieren, entfernen Sie die Mukosa vom Slider. Spülen Sie sie einmal mit eiskaltem KRB-Puffer und geben Sie sie in ein Glas-Kulturgefäß.

Inkubieren Sie die Mukosa über Nacht bei 37 Grad Celsius in 0,5 Milliliter 10 % KOH, um das Gewebe zu lysieren. Anschließend messen Sie die Radioaktivität in 150-Mikroliter-Aliquoten der Lysate im Dreifachansatz mittels Szintillationszähler. Bestimmen Sie mithilfe der Bradford-Methode die Proteinkonzentration in Aliquoten von drei bis fünf Mikroliter der Lysate.

Gezeigt sind hier Caco-2-Zysten, die in 3D-Kultur gezüchtet und für Aktin gefärbt wurden, sowie Caco-2-3D-Zysten, die gleichzeitig für Aktin, Kerne und das SERT-Protein gefärbt wurden. SERT ist in der luminalen Membran sowie in subapikalen Kompartimenten sichtbar. Um den Vorteil von Caco-2-3D-Kugeln gegenüber 2D-Caco-2-Monomeren weiter zu bestätigen, wurde eine Western-Blot-Analyse der SERT-Proteinexpression durchgeführt.

Die Ergebnisse zeigten eine erhöhte Expression des SERT-Proteins in Caco-2-3D-Sphären im Vergleich zu Caco-2-2D-Zellen. Schließlich wurde ein Ussing-Kammer-System verwendet, um zu zeigen, dass TGF-beta den Schleimhaut-zu-Serosa-Fluss erhöht, was einer gesteigerten 5-HT-Aufnahme von der luminalen Membran und einer beobachteten erhöhten 5-HT-Anreicherung in der Ilealschleimhaut entspricht. Diese Befunde werden durch die beobachtete Empfindlichkeit der 5-HT-Aufnahme gegenüber Fluoxetin-Behandlung gestützt, die mit der SERT-Expression an der luminalen Membran übereinstimmt.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann das Abtrennen und Montieren der ilealen Mukosa innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen werden. Bei der Anwendung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die entnommene intestinale Aufbereitung nach der Entnahme vom Tier nur eine begrenzte Lebensfähigkeit aufweist und bis zu drei Stunden andauern kann. 3D-Caco-2-Zysten könnten für verschiedene Studien verwendet werden, wie beispielsweise Membrantransportvorgänge, Genexpression oder Protein-Protein-Interaktionen epithelialer Transporter.

Nach ihrer Entwicklung eröffnet die 3D-Caco-2-Methode Forschern auf dem Gebiet des intestinalen Transports neue Möglichkeiten, um Flüssigkeitsbewegungen zu untersuchen und die Pathophysiologie von Darmkrankheiten zu erforschen. Vergessen Sie dabei nicht, dass der Umgang mit Radioaktivität äußerst gefährlich sein kann und stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung (PPE) sowie ordnungsgemäße Dekontaminierungsverfahren getroffen werden müssen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sind Sie in der Lage, Caco-2-Zellen in 3D-Kulturen zu züchten und diese Kulturen zur Untersuchung der Expression epithelialer Transporter zu nutzen.

Sie werden außerdem in der Lage sein, die Ussing-Kammer zu nutzen, um die Serotonintransportfunktion im nativen Darm von Mäusen zu untersuchen.