Name: Methoden Epithelial Transportprotein Funktion und Expression in Mutterdarm und Caco-2-Zellen gezüchtet in 3D zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Untersuchung epithelialer Transportproteine in Mäusedarm und Caco-2-Zellen in 3D-Kultur. Diese Techniken ermöglichen präzise Analysen von SERT-Regulation und Transportfunktion.

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Wir danken Herrn Christopher Manzella, MD/Doktorand im RKG-Labor, für seine Hilfe bei der Bearbeitung und dem Korrekturlesen unseres Manuskripts.

1. Untersuchung der intestinalen Transporters in einer 3D-Kultursystem von Caco-2: Wachsende 3D Caco-2-Zellkultur auf einem Gelatinous Proteinmischung <ol><li> Auftau-Wachstumsfaktor gelatinösen Proteingemisch für 8 h auf Eis reduziert (oder O / N) bei 4 ° C. Nach dem Auftauen machen 1 ml oder 500 &amp; mgr; l-Aliquots für die Anwendung oder bei -20 ° C für die spätere Verwendung. </li><li> Am Tag der Kultur, vorzukühlen Die Kulturplatten (für RNA und Proteinextraktion) oder gekammert Folien (Immunfärbung) auf Eis. In 30 ul gallertartig Proteinmischung in jede Vertiefung einer acht gut chambered-Objektträger aus Glas (oder 120 &amp; mgr; l pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) und gleichmäßig verteilt. Achten Sie darauf, keine Luftblasen während des Prozesses zu erzeugen. </li><li> Platzieren Sie die Folien / Platten in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C für 15 - 30 min und erlauben die gelatinöse Proteinmischung zu verfestigen. </li><li> Während die gelatinöse Proteingemisch Verfestigen trypsinize eine konfluente Kolben von Caco-2-Zellen. </li><li> Zählen Sie die Anzahlvon Zellen und für 5 min bei 500 xg sie in einer Tischzentrifuge drehen. Resuspendieren des Zellpellets in 3D Caco-2 Medium nach Bedarf. </li><li> Samen der Glaskammer gleitet bei 4.000 Zellen pro Vertiefung (für Teller, 20.000 pro Vertiefung). Lassen Sie die Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator wachsen. Ändern Medium alle 3 - 4 D. </li></ol> 2. Immunfluoreszenzanfärbung für Epithelial Transporters in 3D Caco-2-Zellen: Tag 1 <ol><li> Anzusaugen, das Medium und fixieren die Zellen mit 400 ul 2% Paraformaldehyd (PFA) (in PBS mit pH auf 8,5 mit NaOH eingestellt) für 30 min bei RT. HINWEIS: PFA-Lösung sollte nicht für mehr als 1 Woche bei 4 ° C, und frisch zubereitete Lösung verwendet werden, können gespeichert werden. ACHTUNG: PFA ist hochgiftig und ein potenzielles Karzinogen. Fassen Sie sie mit Vorsicht in einer chemischen Haube und mit persönlicher Schutzausrüstung. </li><li> Spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit 1x PBS und speichern Sie die Folien bei 4 ° C in PBS (400 &amp; mgr; l /Gut). Einmal festgelegt wurden, bei 4 ° C bis zu einer Woche. </li><li> Wärmen Sie die Kammer gleitet auf RT (dies wird die gallertartig Proteinmischung Bett verhärten und machen es zu aspirieren während der Waschschritte leicht). </li><li> Permeabilisierung der Zellen mit 0,5% Triton in PBS für nicht länger als 15 min. </li><li> Bereiten PBS-Glycin - Puffer (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2 PO 4 und 100 mM Glycin). Spülen 3x mit 1x PBS-Glycin für 10 min jeweils bei RT. </li><li> Bereiten Immunofluoreszenz Puffer (IF): 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2 PO 4, 100 mM Glycin, 7,7 mM NaN 3, 0,1% BSA, 0,2% TritonX-100 und 0,05% Tween-20 . </li><li> Waschen 3x in IF für jeweils 10 min bei RT puffern. Block in 5% normalem Ziegenserum (NGS) in IF-Puffer. Inkubieren mit dem primären Antikörper verdünnt in IF + 1% Ziegenserum, 200 &amp; mgr; l / Vertiefung, für 1 bis 2 h bei RT. Waschen Sie mit IF-Puffer 3x je 10 min. </li><li> Inkubieren mit sekundärem AntiKörper (1: 200), verdünnt in IF + 1% NGS, 200 &amp; mgr; l / Vertiefung, 1 h bei RT. </li><li> Waschen Sie mit IF-Puffer dreimal für jeweils 10 min. Halten Sie die Folien in der Dunkelheit von diesem Schritt an. Heben die Kunststoffkammern von den Glasobjektträger durch die Kammer Schieber in einer schwarzen Halterung platziert und ein weißes Hebers durch den Halter bis zu ihrer Kante in Kontakt mit dem Rand der Mulden gleiten. Ziehen Sie die Kammern nach oben (der Halter und Heber sollte mit den Kulturträger kommen). </li><li> Montieren Sie mit langsamen anti-fade Medium und lassen Sie es 10 Minuten lang bei RT trocknen. </li><li> Sobald vollständig getrocknet, versiegeln Sie die Dias mit Nagellack und Bild sie mit der konfokalen Mikroskopie. Speichern der Objektträger bei 4 ° C für zwei Wochen oder bei -20 ° C für mehrere Monate. </li></ol> 3. RNA und Protein Extraktion aus 3D-Caco-2-Zellen <ol><li> Behandeln die kultivierten Zellen auf gelatinösen Proteinmischung für 12 bis 14 d mit einem Testmittel, wie TGF- β1 (10 ng / ml, 1 h). </li><li> Nach der Behandlung, waschen Sie die Zellen mit 1x PBS. Halten Sie die Zellen auf Eis für 30 min die gelatinöse Proteingemisch zu verflüssigen. </li><li> Waschen der Vertiefungen mit PBS gekühlt und die Zellen in einzelnen Zentrifugenröhrchen sammeln. Sammle die Zellen unter Verwendung von Niedergeschwindigkeits-Zentrifugation bei 500 xg und 4 ° C für 10 min. Extrahieren Sie die RNA unter Verwendung von Standardverfahren und verwenden Echtzeit-RT-PCR. </li><li> Für die Proteinextraktion, lysieren die Zellen 1x Zelllysepuffer mit 1x Protease-Inhibitor-Cocktail ergänzt werden. Zell-Lyse-Puffer zu dem Pellet, lysieren die Zellen durch Beschallung und entfernen die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 7.500 xg und 4 ° C für 10 min nach der Zugabe. </li></ol> 4. Messung der 5-HT-Uptake in Maus-Ileum Verwendung einer Ussingkammer: Intestinale Vorbereitung und seromuskuläre Stripping <ol><li> Nach Euthanasie, sezieren die Mäuse und entfernen Sie den Dünndarm (nach dem Magen und vor dem Blinddarm). Teilen Sie den Dünndarm in drei Teile. Entsorgen Sie das mittlere Drittel, verwenden Sie den proximalen Drittelals Jejunum und das distale Drittel Ileum verwenden. Vermeiden Sie den Darm von seiner mesenteric Befestigung ziehen Beschädigung des Epithels zu verhindern. Halten Sie den Gewebeschnitt kalt indem sie sie mit eiskaltem Krebs-Ringer-Bicarbonat (KBR) Puffer abdeckt. </li><li> Öffnen Sie den Darm in Längsrichtung mit einer Schere. Inkubieren frisch ausgeschnittenen Darmabschnitte in eiskaltem, Begasung KBR 1 uM Indometacin für 10 Minuten, bevor die seromuskuläre Strippen enthält. </li><li> Pin der Darmabschnitt (~ 1 cm in der Länge) Schleimhautseite nach unten auf eine Platte, enthaltend 7% Agarose oder gehärtetes Silikonelastomer (0,5 cm dick). </li><li> Isolieren Sie die seromuskuläre Schichten unter einer Dissektion Stereomikroskop mit Bodenbeleuchtung. Schneiden Sie die seromuskuläre Schicht eine Feder Skalpellklinge verwendet wird. Verwenden feinen Pinzette die Kante der Schicht entlang der Längsachse des Darmes zu erhalten. HINWEIS: Während der Stripping-Verfahren, die Bodenbeleuchtung des Stereomikroskops hilft Bereiche mit Peyer-Plaques zu identifizieren und zu vermeidenes. </li><li> Nach dem Abschluss der seromuskuläre Strippen, montieren Sie die Schleimhaut sorgfältig auf die Stifte einer Ussing Halbkammer. Während des gesamten Prozesses, achten Sie auf gestrippt Schleimhautgewebe durch die Kanten zu halten es nicht reißt. </li></ol> 5. Equilibrierung und Gewebebehandlung <ol><li> Bereiten Kreb-Lösung: 115 mM NaCl, 25 mM NaHCO 3, 2,4 mM K 2 HPO 4, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgCl 2 und 0,4 mM KH 2 PO 4 bei pH 7,4, begast mit 95% O 2/5% CO 2 bei 37 ° C. Zugabe von 10 mM Glucose, um die Serosa Bad als Energiesubstrat und 10 mM Mannit in die Schleimhaut Bad zu dienen der osmotische Gleichgewicht zu halten. HINWEIS: Kreb-Lösung mit L-Ascorbinsäure (100 &amp; mgr; M) und Pargylin (100 uM, Monoaminoxidase-Hemmer) ergänzt wird intrazellulär 5-HT-Abbau zu verhindern. </li><li> Setzen Sie den Schieber in die Kammer sowohl die apikal (Luminal) si aussetzende und der basolateralen (Serosa) Seite des Gewebes zu Kreb-Lösung. </li><li> Nach einer Äquilibrierungsperiode von 10 min, 30 min auf der apikalen Seite für J ms (Schleimhaut-to-Serosa Fluss) die Ileum - Gewebe mit Fluoxetin (10 uM) vorzubehandeln. </li><li> Behandlung des Gewebes mit TGF-β1 (10 ng / ml) für 1 h auf basolateralen Seite und dann inkubiert mit 3 [H] -5-HT (20 nM) für 30 min auf der apikalen Seite. </li></ol> 6. Quantifizierung der Mucosal zu serösen Flux (J ms) und 3 [H] -5-HT Akkumulation im Gewebe <ol><li> Sammeln 0,75 ml Aliquots aus dem serösen Reservoir (insgesamt 5 ml) , um die Radioaktivität in einem Flüssigszintillationszähler zu messen und Schleimhaut-to-Serosa (J ms) Flussraten zu berechnen; Fluoxetin empfindlichen Fluss stellt 3 [H] -5-HT - Aufnahme-SERT vermittelt. </li><li> Um zu vermeiden, hydrostatische Druckdifferenzen über die Schleimhaut während einer Fluss Zeit nehmen Proben aus der Serosaseite und relegen Sie sie mit identischen Volumina Bad-Medium. HINWEIS: Die Flussberechnung korrigiert um die Verdünnung des Endes Probe (4,25 ml / 5 ml = 0,85). </li><li> Für die Quantifizierung von 3 [H] -5-HT im Gewebe angesammelt hat , absitzen die Schleimhaut vom Schieber, waschen Sie es einmal mit eiskaltem KRB - Puffer, und legen Sie sie in Kulturröhrchen Glas. </li><li> Inkubiere die Schleimhaut in 0,5 ml 10% KOH über Nacht bei 37 ° C. Messen der Radioaktivität in 150 &amp; mgr; l-Aliquots der Lysate (in dreifacher Ausführung) mit einem Flüssigkeits-Szintillationszähler verwendet wird. </li><li> Aliquots (3 bis 5 &amp; mgr; l) der Lysate Proteinkonzentration unter Verwendung des Bradford-Methode zu messen. HINWEIS: 10 ml Inkubationsmedium radioaktiven serotonin enthält, als Standard verwendet wird. 5-HT erhalten in das Gewebe wird als pmol / mg Protein / min ausgedrückt. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ausdifferenzierten Monolayern Caco-2 - Zell haben ausgiebig Darm Transport zu studieren 10, 11, 12, 13, 14, 15 als polarisierte epitheliale Monolayern verwendet worden. Um jedoch die physiologischen Organisation der intestinalen Epithelzellen zu imitieren, hat es ein beträchtliches Interesse an der Entwicklung eines Caco-2-K...

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Arivarasu N. Anabazhagan
to:
Arivarasu N. Anbazhagan

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Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

Das Darmepithel ist mit verschiedenen Transportproteine ​​(Kanäle, ATPasen, Co-Transporter und Austauscher) ausgestattet, die aus der Absorption von Nährstoffen reichen, Elektrolyten und Medikamente zur Sekretion von Flüssigkeit und Ionen in dem Lumen zahlreiche Funktionen ausführen. Transportproteine ​​erzeugen elektrochemischen Gradienten, der die Bewegung von Ionen oder Molekülen in vektorieller Weise ermöglichen. Dies wird durch die asymmetrische Verteilung der Verkehrssysteme in den apikalen und basolateralen Membranen polarisierter Epithelzellen erreicht. Zusätzlich tight junctions, die benachbarten Epithelzellen anbinden, eine wichtige Rolle in diesem Prozess spielen, indem sie als Barriere gegen die Diffusion von Komponenten intramembranären zwischen den apikalen und basolateralen Membrandomänen dienen. Geeignete Modellsysteme , die diese charakteristischen Eigenschaften des nativen Darms (dh Polarität, Differenzierung und tight junction Integrität) nachahmt sind entscheidend für die Untersuchung der functionalität von epithelialen Transportsysteme. In Bezug auf die Modelle, sind die typischen Zelllinien, die derzeit in Darmepithel-Verkehrsforschung Caco-2, ein Modell der ausdifferenzierten, saugfähig Dünndarm-Epithelzellen; und T84 - Zellen oder HT-29 Subklone, Modelle der Krypta abgeleiteten großen intestinalen Epithelzellen 1. Herkömmlicherweise werden diese Zelllinien als Monoschichten in Kunststoffoberflächen oder in beschichteten Transwell-Einsätzen gewachsen. Trans-Well - Zellkultur - Einsätze zu einem gewissen Grad ähneln der in - vivo - Umgebung von polarisierten Zellen ermöglicht basolaterally zu ernähren. Jedoch ist eine Einschränkung in herkömmlichen 2D-Kultursysteme, dass die Zellen gezwungen werden, einen künstlichen, flachen und steifen Oberfläche anzupassen. Somit wird die physiologische Komplexität der nativen Epithelien nicht genau in einem 2D-System reflektiert wird. Diese Begrenzung wurde durch Methoden überwinden Zellen in 3D in einem bestimmten Mikroumgebung, wie gallertartig Protein Mixtur zu wachsene, eine Vielzahl von extrazellulären Matrixkomponenten , die 2, 3. Dennoch können die in vitro - Kulturen nicht die Komplexität des Darmepithels simulieren, die multiple Zelltypen und regionsspezifischen Architektur im Darm hat. So erfordern die Studien unter Verwendung von Zellkulturmodellen weitere Validierung im nativen Darm. Unter Verwendung der in vitro Zellkultur - 3D und Maus Darmschleimhaut, beschreiben wir hier einfache Methoden der Regulierung der Darmserotonintransporter zu studieren (SLC6A4, SERT). Der SERT transporter regelt die extrazelluläre Verfügbarkeit eines wichtiges Hormon und Neurotransmitter 5-Hydroxytryptamin (5-HT), indem sie durch einen Na + / Cl rasch transportieren - -abhängigen Prozesses. SERT ist ein bekanntes Ziel von Antidepressiva und als ein neues therapeutisches Ziel von GI Störungen wie Durchfall und Darmentzündung kürzlich entstanden.Methods 5-HT-Aufnahme in intestinalen Epithelzellen zu untersuchen, die zuvor beschrieben wurden. Beispielsweise auf Kunststoffträger oder permeablen Einsätzen Caco-2 - Zellen wurden bei 4 Fluoxetin empfindlichen 3 H-5-HT - Aufnahme zeigen sowohl apikalen und basolateralen Domänen gewachsen gezeigt. Die Messung der SERT - Funktion in isolierten Pinsel-Vesikeln (gereinigten BBMVs) aus menschlichen Organspender Dünndarm hergestellt wurde auch von uns 5 beschrieben worden ist . 3 H-5-HT - Aufnahme in den menschlichen BBVMs wurde gezeigt , Fluoxetin empfindlich und Na + / Cl sein - -abhängigen, und es zeigte Sättigungskinetik mit einem K m von 300 nM 5. 6 Unter Verwendung ähnlicher Verfahren, auch wir vorher SERT Funktion als 3 H-5-HT - Aufnahme in Maus - Darm-gereinigten BBMVs gemessen. Jedoch erfordert die Herstellung von reinen Plasmamembran-Vesikel, eine große Menge von Gewebe-Schleimhaut. Andere Verfahren, wie die radiogphische Visualisierung von 3 H-5-HT - Aufnahme - Sites, haben auch zuvor bei Meerschweinchen und Ratten - Dünndarm 7 gezeigt. Der Ussing-Kammer bietet eine physiologische System den Transport von Ionen, Nährstoffe und Medikamente in verschiedenen epithelialen Geweben zu messen. Der Hauptvorteil der Ussing-Kammer-Technik ist, dass es die genaue Messung der elektrischen und Transportparameter an intaktem, polarisierter Darmepithel ermöglicht. Ferner kann der Einfluss des intrinsischen neuromuskulären Systems, seromuskuläre Abisolieren von Darmschleimhaut zu minimieren 8 die Regulierung der Transporteure in dem Epithel zu untersuchen , durchgeführt werden. Wir zeigen, dass Caco-2 in 3D gezüchteten Zellen auf gallertartig Protein ein hohles Lumen deutliche apikale und basolaterale Marker exprimieren, bilden. Diese Zellen zeigen eine höhere Expression von SERT als 2D Caco-2-Zellen. Methoden 3D-Zellen zu wachsen und zu perform Immunfärbung oder RNA und Protein-Extraktion beschrieben. Darüber hinaus beschreiben wir Verfahren SERT Funktion und Regulation von TGF-β1, ein pleiotrope Cytokine, in Dünndarmschleimhaut unter Verwendung einer Ussing-Kammer-Technik zu studieren.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; HTB&schüchtern; 37&Handel;</td><td>Zellen</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Mikroskop für konfokale Bildgebung</td></tr><tr><td>3[H]-5-HT&nbsp;</td><td>LabtekII</td><td>152453</td><td>Kultivierung von Zellen für die Mikroskopie</td></tr><tr><td>5-HT&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td>Kein Gefahrstoff</td></tr><tr><td>95% O2- 5% CO2 Zylinder</td><td>KPL</td><td>71-00-27</td><td>Kein Gefahrstoff</td></tr><tr><td>Agar (für Agarplatten)</td><td>Fischer</td><td>BP151-100</td><td>Akute Toxizität,</td></tr><tr><td>Ora-Agar (für Elektrode)</td><td>Sigma</td><td>G7126-1KG</td><td>Kein Gefahrstoff</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>C3867-1VL</td><td>Kein gefährlicher Stoff</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Gesundheitsschädlich bei Verschlucken oder Einatmen</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>LifeTechnologies</td><td>A12380</td><td>Kein gefährlicher Stoff</td></tr><tr><td>Caco-2-Zellen</td><td>Sigma</td><td>A8806-5G</td><td>Kein gefährlicher Stoff</td></tr><tr><td>Zelllysepuffer</td><td>Fischer</td><td>BP337-100</td><td>Kein gefährlicher Stoff Gefahrstoff</td></tr><tr><td>Chabered Objektträger</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td>Kein gefährlicher Stoff</td></tr><tr><td>Kollagen Typ-1 Lösung</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Elektroden</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>EMEM</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Verwendung als extrazelluläre Matrix</td></tr><tr><td>Fluoxetin</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Cell Signaling, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigszintillationszähler</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>70013--032</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Meta</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, Kalifornien;</td><td>EM-CSYS-8</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Physiologische Instrumente, San Diego, Kalifornien;</td><td>P2304</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Physiologische Instrumente, San Diego, Kalifornien;</td><td>VCC MC8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Physiologische Instrumente, San Diego, CA&nbsp;</td><td>DM MC6</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanal-Spannungs-/Stromzange</td><td>für physiologische Instrumente, San Diego, Kalifornien;</td><td>P2300</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Physiologische Instrumente, San Diego, Kalifornien;</td><td>P2023-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum (NGS, 10%)</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strp</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz für Proteinassays</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>10420</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-Inhibitor-Cocktail</td><td>MEDOX, Chicago, IL&nbsp;</td><td>Typ G-12300</td><td></td></tr><tr><td>RNA easy Mini-Bausatz</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Einkanal-Elektrodeneingangsmodul&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Schieber für Snapwell-Kammern</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>F132</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T7039</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>Perkin-Elmer, Waltham, MA</td><td>NFT1167250UC</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Packard Instruments, Downers Grove, IL</td><td>B1600</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Chamber (nur Kammer)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Chamber Systems</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden epithelial transportprotein funktion und expression in mutterdarm und caco-2-zellen gezüchtet in 3d zu studieren

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

Das Darmepithel hat wichtige Transport- und Barrierefunktionen, die Schlüsselrollen in normalen physiologischen Funktionen des Körpers spielen, während eine Barriere gegen Fremdpartikeln. Impaired epithelialen Transport (ion, Nährstoff oder Arzneimittel) wurden mit vielen Krankheiten verbunden und können Folgen haben, die über die normalen physiologischen Funktionen der Transportunternehmen, wie beispielsweise durch Beeinflussung epithelialen Integrität und den Darm microbiome verlängern. die Funktion und die Regulierung der Transportproteine ​​zu verstehen, ist für die Entwicklung von verbesserten therapeutischen Interventionen kritisch. Die größte Herausforderung bei der Untersuchung von epithelialen Transport entwickelt ein geeignetes Modellsystem, das wichtige Funktionen der nativen intestinalen Epithelzellen rekapituliert. Mehrere in vitro - Zellkulturmodellen, wie Caco-2, T-84 und HT-29-Zellen werden typischerweise Cl.19A in epithelialen Transport Forschung eingesetzt. Diese Zelllinien stellen einen reduktionistischen Ansatz zur Modellierung der epithelium und wurden in vielen mechanistische Studien verwendet worden, einschließlich der Prüfung der epithelial-mikrobiellen Wechselwirkungen. Allerdings Zellmonolayern genau nicht Zell-Zell - Interaktionen reflektieren und die in - vivo - Mikroumgebung. Die Zellen in 3D gewachsen sind, werden vielversprechende Modelle für Studien Arzneimittelpermeabilität gezeigt. Wir zeigen, dass Caco-2-Zellen in 3D verwendet werden können epithelialen Transporter zu studieren. Es ist auch wichtig, dass Studien in Caco-2-Zellen mit anderen Modellen ergänzt werden zellspezifische Effekte auszuschließen und die Komplexität des nativen Darm zu berücksichtigen. Mehrere Verfahren zuvor verwendet wurden, um die Funktionalität von Transportern, wie umgestülpte Sack und die Aufnahme in isolierten Epithelzellen oder in isolierten Plasmamembranvesikel zu beurteilen. Unter Berücksichtigung der Herausforderungen auf dem Gebiet in Bezug auf Modelle und die Messung der Transportfunktion, zeigen wir hier ein Protokoll Caco-2-Zellen in 3D zu wachsen und die Verwendung eines Ussingkammer als beschreibenwirksamer Ansatz Serotonin-Transport, wie in intakten polarisierten Darmepithelien zu messen.

Immunfärbung in 3D Caco-2 Zysten ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein repräsentatives Bild eines XY-Ebene zeigt gut abgegrenzte Lumen in der 3D - Zyste gefärbt mit Phalloidin Aktin ist in 1A dargestellt. Die Seite, die dem Lumen zugewandt bezeichnet die apikalen Seite. Epithelialen Zellen in einer 3D Umgebung Ergebnis in einem robusten epithelialen Phänotyp. Verschiedene Caco-2 Zysten am Tag 12, wenn Aktin und SERT waren co-gefärbt, sind in 1B</st...

Wir beschreiben einfache Methoden der Regulierung der intestinalen Serotonintransporter zu studieren (SERT) Funktion und Expression einer in vitro Zellkulturmodell von Caco-2 - Zellen gezüchtet in 3D und eine ex - vivo - Modell der Maus - Darm verwendet wird . Diese Verfahren sind anwendbar auf die Untersuchung von anderen epithelialen Transportern.

Methoden Epithelial Transportprotein Funktion und Expression in Mutterdarm und Caco-2-Zellen gezüchtet in 3D zu studieren

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, intestinale Caco-2-Zellen dreidimensional zu kultivieren und die Anwendung der Ussing-Kammer bei Untersuchungen zur Regulation des Serotonintransporters zu demonstrieren. Die hier gezeigten Methoden können zentrale Fragen im Bereich des epithelialen Transports beantworten, beispielsweise wie der intestinale Serotonintransporter SERT reguliert wird. Der Hauptvorteil der 3D-Caco-2-Kultur liegt darin, dass sie die Interaktionen zwischen Zellen sowie zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix genauer widerspiegelt als Zellschichten in Monokultur.Mit der Ussing-Kammer-Technik lassen sich Transportfunktionen im Darmepithel präzise messen. Die Verwendung von 3D-Caco-Kulturen eröffnet zudem Möglichkeiten zur Therapeutika-Entwicklung, da diese Modelle die Testung von Wirkstoffen gegen Erkrankungen mit gestörter Transportfunktion ermöglichen. Obwohl diese Methode Aufschluss über die Regulation des Serotonintransporters gibt, kann sie auch auf Untersuchungen anderer Elektrolyttransporter wie Natrium und Chlorid angewandt werden.Die visuelle Demonstration dieser Techniken ist entscheidend, da das Abtrennen der seromuskulären Schicht u

methods-to-study-epithelial-transport-protein-function-expression

Research

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Viele therapeutische Anwendungen erfordern sicheren und effizienten Transport von Arzneistoffträger und ihre Ladungen über zelluläre Barrieren im Körper. Dieser Artikel beschreibt eine Anpassung der etablierten Verfahren, um die Geschwindigkeit und der Mechanismus der Medikamententransport Nanoträger (NCS) über zelluläre Barrieren, wie der gastrointestinalen (GI) Epithel auszuwerten.

Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Caco-2-Zellen können als In-vitro-Modell dienen, um den Enterozytentransport von Lipiden und fettlöslichen Medikamenten/Vitaminen zu untersuchen. Das permeable Membransystem trennt das apikale vom basolateralen Kompartiment, während das Lentivirus-Expressionssystem eine effektive Genüberexpressionsmethode bietet. Die Isolierung von Lipoproteinen wird durch TEM bestätigt.

Verwenden von Caco-2-Zellen, die Lipidtransport Studie der Darm

Wir präsentieren Protokolle zur Isolierung der intestinalen 3D-Strukturen aus in-Vivo -Gewebe und in-vitro- Keller-Matrix eingebettet, Organellen, und Detail verschiedene Fixierung und Färbung Protokolle für Immuno-Kennzeichnung von Mikrotubuli optimiert, centrosomal und Knoten Proteine sowie Handy-Marken einschließlich des Stammzell-Proteins Lgr5.

Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Zwei Methoden werden hier vorgestellt, um intestinale Barrierefunktion zu bestimmen. Eine epitheliale Meter (Volt/Ohm) dient zur Messung des elektrischen Widerstands berührt der kultivierten Epithelien direkt in Gewebekultur Brunnen. Bei Mäusen ist die FITC-Dextran-Magensonde-Methode zur Ermittlung der intestinalen Permeabilität in Vivo.

In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur menschlichen Kultur Enteroid oder Colonoid Monolagen, die intakten Barrierefunktion, Wirt epithelialen Mikrobiota Interaktionen auf die zelluläre und biochemische Ebene zu studieren.

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Hier beschreiben wir eine Technik zur Quantifizierung der Barriereintegrität kleiner Darmorganoide. Die Tatsache, dass die Methode auf lebenden Organoiden basiert, ermöglicht die sequenzielle Untersuchung verschiedener Barriereintegritätsmodulisierungssubstanzen oder Kombinationen davon in einer zeitaufgelösten Weise.

Untersuchung des Darmbarriereabbaus bei lebenden Organoiden

Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Organoid-abgeleiteten intestinalen Epithel-Monolayern zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion, Permeabilität und des Transports. Da Organoide die ursprüngliche Reaktion des Epithelgewebes auf äußere Reize darstellen, kombinieren diese Modelle die Vorteile der Erweiterbarkeit von Zelllinien und die Relevanz und Komplexität von Primärgewebe.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

Hier stellen wir zwei Protokolle vor, die die Modellierung von intestinalen apikal-spezifischen Interaktionen ermöglichen. Organoid-abgeleitete intestinale Monoschichten und Air-Liquid-Interface (ALI)-Kulturen erleichtern die Erzeugung von gut differenzierten Epithelien, die sowohl von luminaler als auch von basolateraler Seite zugänglich sind, während polaritätsinvertierte Darmorganoide ihre apikale Seite freilegen und für Hochdurchsatz-Assays zugänglich sind.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Erfahren Sie Methoden zur Untersuchung epithelialer Transportproteine in Mäusedarm und Caco-2-Zellen in 3D-Kultur. Diese Techniken ermöglichen präzise Analysen von SERT-Regulation und Transportfunktion.

Methoden Epithelial Transportprotein Funktion und Expression in Mutterdarm und Caco-2-Zellen gezüchtet in 3D zu studieren

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