Methoden Epithelial Transportprotein Funktion und Expression in Mutterdarm und Caco-2-Zellen gezüchtet in 3D zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, intestinale Caco-2-Zellen in drei Dimensionen zu züchten und die Verwendung der Ussing-Kammer in Studien zur Regulation von Serotonintransportern zu demonstrieren. Die hier gezeigten Methoden können Schlüsselfragen im Bereich des epithelialen Transports beantworten, z.B. wie der intestinale Serotonintransporter SERT reguliert wird. Der Hauptvorteil des 3D-Caco-2 besteht darin, dass sie die Wechselwirkungen zwischen Zellen und von Zellen zu extrazellulären Matrizen genauer widerspiegeln als Monoschichten.

Und die Ussing-Kammertechnik ermöglicht eine präzise Messung der Transportfunktion im Darmepithel. Die Bedeutung von 3D, den Caco-Kulturen, erstreckt sich auch auf die Entdeckung von Therapeutika, da diese Modelle das Screening nach Wirkstoffen gegen Krankheiten ermöglichen, die mit einer veränderten Transportfunktion verbunden sind. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Regulation des Serotonintransporters bietet, kann sie auch auf Studien zu anderen Elektrolyttransportern wie Natrium und Chlorid angewendet werden.

visuelle Demonstration dieser Techniken ist von entscheidender Bedeutung, da das Abstreifen der seromuskulären Schicht und das Montieren der Darmschleimhaut in Ussing-Kammern schwer zu erlernen sind. Die 3D-Caco-2-Zellverfahren werden von Ishita Chatterjee, Dozentin, und Anoop Kumar, einem Postdoc-Stipendiaten aus unserer Gruppe, demonstriert. Sangeeta Tyagi, eine leitende Forschungsspezialistin aus meinem Labor, wird das Entfernen der seromuskulären Schicht aus dem Ileum der Maus demonstrieren.

Auch Shubha Priyamvada und Arivarasu Natarajan, Ausbilder aus meinem Labor, werden das Montieren von abgestreifter Schleimhaut und das Einführen in die Ussing-Kammern demonstrieren. Zu Beginn tauen Sie die mit Wachstumsfaktor reduzierte gallertartige Proteinlösung über Nacht auf Eis in einem bei vier Grad Celsius warmen Kühlschrank auf. Bereiten Sie nach dem Auftauen Aliquots von einem Milliliter oder 500 Mikrolitern vor.

Am Tag der Kultur die gekammerten Objektträger auf Eis vorkühlen. Geben Sie dann 30 Mikroliter der gallertartigen Proteinlösung in jede Vertiefung des Glasobjektträgers mit acht Vertiefungen und verteilen Sie sie gleichmäßig. Beim Plattieren der gallertartigen Mischung im Objektträger oder in den Kammerplatten sollte darauf geachtet werden, dass keine Blasenbildung entsteht, da sich die Zellen ablösen können.

Stellen Sie die kultivierte Schale für 15 bis 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Zellkultur-Inkubator, damit sich die Lösung verfestigen kann. Als nächstes lösen Sie mit Trypsin konfluente Caco-2-Zellen aus einem Kulturkolben. Zählen Sie dann die Zellen in einem Hämozytometer und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 500 mal g bei vier Grad Celsius.

Das resultierende Zellpellet wird erneut in 3D-Caco-2-Medium suspendiert, um die Suspension mit der gewünschten Dichte zu erhalten. Mit der vorbereiteten Zellsuspension säen Sie 4.000 Zellen pro Vertiefung auf die Glaskammer-Objektträger und lassen Sie sie 12 bis 14 Tage lang in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius wachsen. Um die Zellen zu färben, aspirieren Sie zuerst das Medium und fixieren die Zellen mit 400 Mikrolitern 2%PFA.

Fixieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen zweimal in PBS gewaschen haben, permeabilisieren Sie sie nicht länger als 15 Minuten mit 0,5%iger Triton-Lösung in PBS. Spülen Sie die Zellen zweimal in PBS-Glycinpuffer und waschen Sie dann die permeabilisierten Zellen zehn Minuten lang bei Raumtemperatur in IF-Puffer.

Blockieren Sie die Zellen mit 5% normalem Ziegenserum in IF-Puffer. Inkubieren Sie dann die Zellen mit 200 Mikrolitern Primärantikörper, verdünnt in IF-Puffer, ergänzt mit 1 % Ziegenserum, für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation werden die Zellen dreimal mit IF-Puffer gewaschen.

Inkubieren Sie gewaschene Zellen mit 200 Mikrolitern Sekundärantikörper, verdünnt in IF-Puffer, ergänzt mit 1 % Ziegenserum, für eine Stunde bei Raumtemperatur. Die Zellen dreimal zehn Minuten lang mit IF-Puffer waschen. Um die Kammer für den Objektträger zu lösen, legen Sie zuerst den Objektträger in den Objektträger-Basishalter und schieben Sie dann den weißen Heber durch den Halter, bis er den Rand der Vertiefungen berührt.

Ziehen Sie vorsichtig an der Kammer, um sie vom Objektträger zu entfernen. Verwenden Sie eine abgedeckte Blackbox, um die Dias vor Licht zu schützen. Montieren Sie die Dias mit Slow Anti-Fade-Medium und decken Sie sie mit Deckgläsern ab.

Nachdem Sie die Objektträger zehn Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen gelassen haben, versiegeln Sie sie vor der Bildgebung mit Nagellack. Isolieren Sie das Maus-Ileum gemäß dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren. Öffnen Sie dann mit einer Schere den Darm in Längsrichtung.

Der resultierende Gewebeschnitt wird zehn Minuten lang in eiskalt gasendem KBR-Puffer mit einem mikromolaren Indomethacin inkubiert. Stecken Sie einen etwa einen Zentimeter langen Darmabschnitt mit der Schleimhautseite nach unten auf eine Platte mit 0,5 Zentimeter dickem 7%Agarose oder ausgehärtetem Silikonelastomer. Mit einem Präparier-Stereomikroskop mit Bodenbeleuchtung werden die seromuskulären Schichten abgestreift.

Schneiden Sie dann die seromuskuläre Schicht mit einer Federskalpellklinge ab. Heben Sie mit einer feinen Pinzette den Rand der Schicht entlang der Längsachse des Darms an. Zum Schluss montieren Sie die Schleimhaut vorsichtig auf den Stiften des Schiebers.

Halten Sie das abgestreifte Schleimhautgewebe an den Rändern fest, um ein Reißen zu vermeiden. Bei der Montage der abgestreiften Ilialschleimhaut an Stiften des Schiebers sollten Vorkehrungen getroffen werden, um ein Einreißen des Gewebes an den Stecknadelköpfen zu verhindern und eine Beschädigung der Geweberänder zu minimieren. Vor der Gewebebehandlung ist Krebslösung herzustellen, die mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid begast ist.

Gießen Sie dann die Lösung in eine Ussing-Kammer. Geben Sie 10 Mikromolare Glukose als Energiesubstrat in das Serosalbad und 10 Mikromolare Mannitol zur Aufrechterhaltung des osmotischen Gleichgewichts in das Schleimhautbad. Anschließend wird der Schieber mit der montierten Mukosa in die Kammer eingeführt, um sowohl die apikale als auch die basolaterale Seite des Gewebes der Krebslösung auszusetzen.

Äquilibrieren Sie das Ileumgewebe zehn Minuten lang im Bad. Anschließend wird die apikale Seite 30 Minuten lang mit 10 mikromolaren Fluoxetin vorbehandelt, um den Fluss von Schleimhaut zu Serosa zu messen. Behandeln Sie schließlich die basolaterale Seite des Gewebes eine Stunde lang mit 10 Nanogramm pro Milliliter TGF beta 1 und inkubieren Sie dann die apikale Seite mit 20 nanomolar tritiiertem 5-HT für 30 Minuten.

Um die Flussraten von Schleimhaut zu Serosal zu berechnen, sammeln Sie 0,75 Milliliter Aliquots aus dem Serosalreservoir und ersetzen Sie sie durch identische Volumina des Badmediums, um hydrostatische Druckunterschiede in der Schleimhaut zu vermeiden. Um das im Gewebe angesammelte tritiierte 5-HT zu quantifizieren, entfernen Sie die Schleimhaut aus dem Schieber. Waschen Sie es einmal mit eiskaltem KRB-Puffer und legen Sie es in ein Glaskulturröhrchen.

Inkubieren Sie die Schleimhaut in 0,5 Millilitern 10%KOH über Nacht bei 37 Grad Celsius, um das Gewebe zu lysieren. Messen Sie dann die Radioaktivität in 150 Mikrolitern Aliquoten der Lysate in dreifacher Ausfertigung mit einem Flüssigszintillationszähler. Messen Sie mit der Bradford-Methode die Proteinkonzentration in drei bis fünf Mikroliter-Aliquoten der Lysate.

Hier sind Caco-2-Zysten zu sehen, die in 3D-Kultur gezüchtet und mit Aktin gefärbt wurden, und Caco-2 3D-Zysten, die gleichzeitig mit Aktin, Zellkernen und SERT-Protein gefärbt wurden. SERT ist in der luminalen Membran und in subapikalen Kompartimenten sichtbar. Um den Vorteil von Caco-2 3D-Kugeln gegenüber 2D-Caco-2-Monoschichten weiter zu bestätigen, wurde eine Western-Blot-Analyse der SERT-Proteinexpression durchgeführt.

Die Ergebnisse zeigten die erhöhte Expression des SERT-Proteins in Caco-2 3D-Kugeln im Vergleich zu 2D Caco-2 Zellen. Schließlich wurde ein Ussing-Kammersystem verwendet, um zu zeigen, dass das TGF beta den Schleimhaut-serosal-Fluss erhöht, was eine erhöhte 5-HT-Aufnahme aus der Luminalmembran und eine verstärkte 5-HT-Akkumulation widerspiegelt, die in der Ileumschleimhaut beobachtet wurde. Diese Befunde werden durch die beobachtete Empfindlichkeit der 5-HT-Aufnahme gegenüber der Fluoxetin-Behandlung unterstützt, die der SERT-Expression auf der Luminalmembran entspricht.

Einmal gemeistert, kann diese Technik des Abstreifens und Montierens der Ileumschleimhaut in 15 Minuten abgeschlossen werden. Bei der Anwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass das extravio-Darmpräparat nach der Entnahme aus dem Tier nur begrenzt lebensfähig ist und bis zu drei Stunden dauern kann. 3D-Caco-2-Zysten könnten für verschiedene Studien verwendet werden, z. B. für Membrantransportereignisse, Genexpression oder Protein-Protein-Interaktion von Epitheltransportern.

Nach ihrer Entwicklung ebnet die 3D-Caco-2-Technik Forschern auf dem Gebiet des Darmtransports den Weg, um die Flüssigkeitsbewegung zu erforschen und die Pathophysiologie von Darialkrankheiten zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität äußerst gefährlich sein kann und dass immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von PSA und ordnungsgemäße Dekontaminationsverfahren getroffen werden sollten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie in der Lage sein, Caco-2-Zellen in 3D-Kulturen zu züchten und diese Kulturen zur Untersuchung der epithelialen Transporterexpression zu verwenden.

Sie werden auch in der Lage sein, die Ussing-Kammer zu nutzen, um die Serotonin-Transportfunktion im nativen Mäusedarm zu untersuchen.