Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Lebensfähigkeit der Zellen in einer Kleinhirn-Körnerneuronenkultur genau zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften und Neuropharmakologie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir unerwünschte Gliazellen von Neuronen in MISTA-Zellkulturen unterscheiden können.

Lin Jiajia, Wang Jialing, Xu Dilin, drei Studenten aus meinem Labor, werden die Verfahren vorführen. Beginnen Sie mit dem Präparieren der Köpfe von acht Tage alten Rattenbabys, indem Sie zuerst eine Schere in das Foramen magnum einführen und die beiden Seiten des Schädels von den Ohren bis zu den Augen durchschneiden. Benutze dann eine Pinzette, um den Schädel anzuheben.

Isolieren Sie das Kleinhirn mit einer Pinzette und legen Sie es in eine 35-Millimeter-Schale mit der Dissektionslösung. Bringen Sie die Platte auf den Tisch des Präpariermikroskops und entfernen Sie mit zwei Pinzettenpaaren die Hirnhäute und Blutgefäße. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Klinge und geben Sie das Gewebe dann in ein Zentrifugenröhrchen mit 30 Millilitern Dissektionslösung.

Fünf Minuten bei Raumtemperatur bei 1.500 x g zentrifugieren. Nach der Zentrifugalisierung wird der Überstand abgesaugt und das Pellet aufbewahrt. Fügen Sie dann Trypsinlösung zum Pellet hinzu und resuspendieren Sie es durch leichtes Schütteln.

Legen Sie die Tube dann für 15 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Nach 15 Minuten eine Lösung aus DNase One, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor und Magnesiumsulfat hinzufügen und schütteln. Anschließend fünf Minuten bei Raumtemperatur bei 1.500 x g zentrifugieren.

Nach dem Aspirieren des Überstands resuspendieren Sie das Pellet in einer weniger verdünnten DNase One, einem Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor und einer Magnesiumsulfatlösung. Bereiten Sie als Nächstes zwei 15-Milliliter-Röhrchen vor. Legen Sie die Hälfte der Zellen in jedes Röhrchen und pipettieren Sie mit einer mit Watte verschlossenen Pasteur-Pipette 60 bis 70 Mal nach oben und unten, um die Zellen zu homogenisieren.

Geben Sie nach der Homogenisierung drei Milliliter Magnesiumsulfat und Calciumchloridlösung in jedes 15-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie die Röhrchen 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Nach Ablauf der Zeit den Überstand vorsichtig mit einer mit Watte verschlossenen Pasteurpipette entfernen und in neue 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen.

Fünf Minuten bei Raumtemperatur und 1.500 x g zentrifugieren. Kulturmedium zum Pellet hinzufügen, um es auf eine Zelldichte von etwa 1,5 x 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter zu verdünnen. Pipettieren Sie die Zellen in eine 6-Well-Platte und kultivieren Sie sie im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Geben Sie nach 24 Stunden AraC-Stammlösung in eine Endkonzentration von einem Millimolaren, um das Wachstum der Gliazellen zu hemmen, bevor Sie die Platten wieder in den Inkubator einsetzen. Dann, am siebten Tag, fügen Sie 50 Mikroliter zu D-Glukose-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzu. Beginnen Sie die Färbung, indem Sie Fluoresceindiacetat mit einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter und Propidiumiodid mit einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter und 10 Milliliter PBS mischen.

Mischen Sie die FDA/PI-Lösung durch Vortexen und legen Sie sie auf Eis. Legen Sie die Kulturplatte auf Eis. Aspirieren Sie das Kulturmedium vorsichtig, ohne die Zellen mit der Pipettenspitze zu berühren, und fügen Sie dann langsam kaltes PBS hinzu.

Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie dann kalte FDA/PI- oder FDA/PI Hoechst-Arbeitslösung hinzu. Legen Sie den Teller fünf Minuten lang auf Eis. Nachdem Sie die FDA/PI- oder FDA/PI/Hoechst-Arbeitslösung abgesaugt haben, fügen Sie jeder Vertiefung kaltes PBS hinzu.

Stellen Sie sicher, dass das Fluoreszenzmikroskop richtig eingestellt ist. Detektieren Sie die Fluoreszenzemissionen für FDA, PI und Hoechst bei 520, 620 bzw. 460 Nanometern mit einer Belichtungszeit zwischen 100 und 300 Millisekunden und einer analogen Verstärkung von 2,8 x. Nachdem Sie Fluoreszenzbilder aufgenommen haben, nehmen Sie ein Bild unter normalem Licht mit dem Phasenkontrastmodus auf.

Für die FDA/PI-Doppelfärbung überlagern Sie die Bilder der Zellen, indem Sie die positive FDA-Schicht in der Grafikbearbeitungssoftware auf die positive PI-Schicht ziehen. Passen Sie die Deckkraft der FDA-positiven Ebene an, indem Sie 50 % in das Feld "Deckkraft" des Ebenenbedienfelds eingeben. Führen Sie zwei Ebenen zusammen, indem Sie das Ebenenmenü öffnen und auf die Schaltfläche Sichtbare zusammenführen klicken.

Stellen Sie den Kontrast der Overlay-Bilder ein, indem Sie im Feld Kontrast unter Bild, Anpassungen, Helligkeit/Kontrast den Wert 50 eingeben. Vergewissern Sie sich, dass die Overlay-Bilder keine doppelt positiven FDA- und PI-Zellen enthalten. Überlagern Sie für die FDA/PI/Hoechst-Dreifachfärbung die Bilder der Zellen, indem Sie die FDA-positive Schicht erneut auf die PI-positive Schicht ziehen, die Deckkraft der FDA-positiven Schicht anpassen und die Bilder wie zuvor zusammenführen.

Ziehen Sie dann die positive Ebene von Hoechst auf die zusammengeführte Ebene. Passen Sie die Deckkraft der positiven Hoechst-Ebene an, indem Sie 50 % in das Feld Deckkraft des Ebenenbedienfelds eingeben, und führen Sie die beiden Ebenen zusammen, indem Sie das Menü "Ebene" öffnen und auf die Schaltfläche "Sichtbare zusammenführen" klicken. Unterscheiden Sie visuell zwischen großen, unregelmäßigen Gliazellen und zerebellären granulären Neuronen, indem Sie die im Fluoreszenzmodus aufgenommenen Bilder mit denen im Phasenkontrastmodus vergleichen.

Die folgenden Bilder zeigen, dass sowohl kleine Neuronen als auch große, unregelmäßige Gliazellen in der CGN-Kultur vorhanden sind. Dieses Bild zeigt die GAP-43-Aminofärbung einer CGN-Kultur nach acht Tagen in vitro. Die blauen Pfeile zeigen Neuronen an.

Hier wird die GFAP-Amino-Färbung von Gliazellen gezeigt. Der weiße Pfeil zeigt eine Gliazelle an. Dieses Phasenkontrastbild zeigt die Morphologie der Zellen.

Die FDA/PI-Hakenfärbung, mit der Gliazellen von Neuronen unterschieden werden können, ist vorteilhaft für die genaue Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit in CGN-Kulturen. Dies ist ein zusammengeführtes Bild von dreifach gefärbten Zellen, die in normalem Wachstumsmedium gezüchtet wurden. Der Pfeil zeigt eine typische Gliazelle.

Hier wurde eine ähnliche Kultur mit einem kaliumarmen Medium behandelt, und der Pfeil zeigt wieder eine typische Gliazelle. Beachten Sie auch das Auftreten von roter Propidiumiodid-Färbung. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Eine ähnliche Strategie kann auf andere gemischte Zellkulturen angewendet werden, wie z. B. primäre kortikale Kulturen und primäre Hippocampuskulturen, um die neuronale Lebensfähigkeit genau zu analysieren.