Ein chronisches Autoimmun-Trockenaugen-Rattenmodell mit Zunahme im Effekt-Speicher T-Zellen in Augapfel-Gewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, klinische Merkmale der Tränenfunktionsstörung und der Tränendrüsenentzündung bei Ratten durch subkutane Immunisierung und subkonjunktivale und intralakrimale Drüseninjektion von Tränendrüsenextrakten zur Beurteilung von Therapien beim autoimmunen trockenen Auge zu induzieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen beim trockenen Auge zu beantworten, z. B. ob Medikamente, die T-Zellen bei Autoimmunerkrankungen unterdrücken, wirksam sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ähnliche Anzeichen von Augenerkrankungen hervorruft wie das trockene Auge beim Menschen und auch die T-Zellen, die die Tränendrüse und das Auge infiltrieren.

Die Implikationen dieses Tiermodells erstrecken sich auf das Verständnis des Lymphozytenhandels, da Milz und Lymphknoten untersucht werden können. Im Allgemeinen werden Einzelpersonen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es an geeigneten Instrumenten zur Dokumentation von Veränderungen im kleinen Rattenauge mangelt. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da bestimmte Schritte aufgrund des schnellen Trocknens des Rattenauges und des Fehlens von Blinzeln nach der Anästhesie schwer zu erlernen sind.

Nachdem Sie eine weibliche Sprague-Dawley-Ratte gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert haben, legen Sie das Tier flach mit einem Ohr gegen den Tisch und dem anderen nach oben. Machen Sie mit einer Schere einen 10-Millimeter-Schnitt von oben-unten unter dem freiliegenden Ohr. Entfernen Sie dann die Tränendrüse, indem Sie sie aus dem umgebenden Bindegewebe und aus dem Abflusskanal präparieren.

Anschließend das Taschentuch mit einer Schere auf Eis so fein wie möglich zerkleinern. Fügen Sie dann 150 Mikroliter PBS mit 1X Proteasehemmer pro Tränendrüse hinzu. Wenn der Ultraschallator auf 10 Sekunden an, 10 Sekunden aus und 30 % Amplitude eingestellt ist, beschallen Sie die Proben fünf Minuten lang auf Eis bei 20 Kilohertz.

Zentrifugieren Sie dann die beschallten Proben bei 13.000 g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen. Dann aliquotieren Sie den Überstand zu 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern sie bei minus 80 Grad Celsius.

Übertragen Sie ein vollständiges Freund-Adjuvans, das fünf Milligramm pro Milliliter Mycobacterium tuberculosis H37Ra enthält, oder ein unvollständiges Freund-Adjuvans in ein 50-Milliliter-Röhrchen, wobei sichergestellt wird, dass das Volumen des Adjuvans an das Antigengemisch in einem Verhältnis von eins zu eins steht. Geben Sie das Antigengemisch, das zwei Milligramm pro Milliliter Ovalbumin und 10 Milligramm pro Milliliter Tränendrüsenextrakt enthält, tropfenweise in die adjuvante Lösung, während Sie mit der höchsten Geschwindigkeit vortexen, die nicht zum Verschütten führt. Fahren Sie mit dem Vortexen für fünf Minuten fort, nachdem das gesamte Antigen hinzugefügt wurde.

Übertragen Sie die Emulsion auf eine Fünf-Milliliter-Spritze und verbinden Sie sie mit einem Spritzenanschluss mit einer weiteren Fünf-Milliliter-Spritze. Schieben Sie dann die Emulsion von einer Spritze in die andere, um sie zu mischen. Verteilen Sie am Tag Null 200 Mikroliter der Emulsion, die ein Milligramm Tränendrüsenextrakt und 200 Mikrogramm Ovalbumin in vollständigem Freund-Adjuvans enthält, in ein Milliliter Luer-Lock-Spritzen und bestücken Sie die Spritzen mit 27-Gauge-Nadeln.

Injizieren Sie die Emulsion ohne Anästhesie subkutan an der Basis der Rattenschwänze. Dann, am 14. Tag, injizieren Sie auf ähnliche Weise 200 Mikroliter desselben Antigens in unvollständiges Freund-Adjuvans. Am selben Tag injizieren Sie intraperitoneal 300 Nanogramm Pertussis-Toxin in 100 Mikroliter PBS.

Wiegen Sie an Tag 48 die erforderliche Menge Ovalbumin und lösen Sie es in PBS auf. Kombinieren Sie dann Ovalbumin mit dem aufgetauten Tränendrüsenextrakt, der zuvor in diesem Video hergestellt wurde, und stellen Sie eine Antigenlösung her, die ein Milligramm pro Milliliter Ovalbumin und ein Milligramm pro Milliliter Tränendrüsenextrakt enthält. Nach der Betäubung der Ratte injizieren Sie fünf Mikroliter Antigen in die Forniceal-Subkonjunktiva des Auges.

Injizieren Sie dann 20 Mikroliter Antigen in die Tränendrüse. Während Sie eine anästhesierte Ratte gemäß dem Textprotokoll halten, verwenden Sie zur Messung des Tränenvolumens mit dem phenolroten Faden eine Pinzette, um den Faden zu halten, und eine andere, um das untere Augenlid der Ratte zu ziehen. Legen Sie den Faden eine Minute lang an die proximale Ecke des unteren Fornix und entfernen Sie dann den Faden.

Lege dann den Faden neben ein Lineal mit Millimetermarkierungen und mache ein Bild von der Länge des benetzten Teils des Fadens. Um die Tränenglätte der Hornhaut zu messen, legen Sie die Ratte unter ein Stereomikroskop, das mit einem Ringlicht und einer Kamera ausgestattet ist. Tragen Sie dann fünf Mikroliter Kochsalzlösung auf die Hornhaut der Ratte auf.

Blinzeln Sie mit behandschuhten Fingern passiv, indem Sie das obere und untere Augenlid etwa fünfmal bewegen, um die Kochsalzlösung zu verteilen. Bei 1,6-facher Vergrößerung fokussieren Sie den Ringstrahler auf die Mitte der Hornhautoberfläche. Nehmen Sie dann nach 10 Sekunden fotografische Bilder auf.

Verwenden Sie Fluoreszein-Scanning, um Hornhautschäden zu messen, indem Sie der Hornhaut der Ratte zwei Mikroliter 0,2 % Fluorescein hinzufügen. Öffnen und schließen Sie mit einem behandschuhten Finger die Rattenlider dreimal passiv, um den Fluoresceinfarbstoff auf der Augenoberfläche zu verteilen. Verwenden Sie nach einer Minute eine Drei-Milliliter-Spritze, um einen Milliliter Kochsalzlösung zu ziehen.

Positionieren Sie dann die Spritze etwa zwei bis drei Millimeter vor der Hornhaut und tragen Sie vorsichtig Kochsalzlösung auf das Auge auf. Nehmen Sie bei ausgeschaltetem Hintergrundlicht Bilder unter dem Kobaltblaufilter eines Mikroskops mit Okularbildgebung auf. Nachdem Sie die Ratte gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert haben, entfernen Sie mit einer Schere die oberen und unteren Augenlider.

Befreien Sie die Kugel, indem Sie die extraokulären Muskeln, den Sehnerv und die Bindehaut fornicealis durchtrennen. Mache einen Schnitt, um den Augapfel zu öffnen. Entfernen Sie die Linse im Glasglas.

Legen Sie dann die präparierten Augäpfel in 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Sammeln Sie schließlich die Tränendrüsen, wie weiter oben in diesem Video beschrieben. Diese Abbildung zeigt repräsentative Bilder von phenolroten Fäden von Kontroll- und DED-Ratte.

Die Länge der phenolroten Fäden in der DED-Gruppe ist kürzer als in der Kontrollgruppe, was auf ein geringeres Tränenvolumen hinweist. Fluorescein bindet an geschädigtes Hornhautepithel und wird daher verwendet, um das Ausmaß der Schädigung zu messen. In diesem Experiment wurden Fluorescein-Spots auf der Hornhautoberfläche von DED-Ratten von null bis zwei eingestuft und mit Kontrollratten verglichen.

Ratten mit DED weisen eine stärkere Fluoreszeinfärbung auf als Kontrollratten, was auf eine Schädigung der Hornhaut hindeutet. Wie hier zu sehen, ist das Bild des Illuminatorrings auf der Okularoberfläche rundlich und perfekt, wenn die Hornhautoberfläche glatt und mit hoher Reißstabilität ist. Eine Verzerrung des Bildes deutet auf eine verminderte Hornhautglätte und einen instabilen Tränenfilm hin, wie er in der DED-Gruppe mit einem höheren Verzerrungsgrad beobachtet wurde.

Diese durchflusszytometrische Analyse zeigt, dass die vorherrschende T-Zell-Untergruppe in normalem Augapfelgewebe von Ratten Effektor-Gedächtnis-T-Zellen sind. In den Augäpfeln von DED-Ratten sind etwa 70 % der CD3-positiven T-Zellen Effektor-Gedächtnis-T-Zellen, während diese Zahl bei Kontrollratten bei etwa 50 % liegt. Augäpfel von DED-Ratten haben signifikant höhere Effektor-Gedächtnis-T-Zellen als die von Kontrollratten. Nach diesem Verfahren kann eine Färbung für andere Arten von Immunzellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Sie können zum Beispiel auf angeborene Immunzellen oder B-Lymphozyten färben. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die Immunologie der Augenoberfläche zu verstehen und darüber hinaus das trockene Auge beim Menschen und das Sjögren-Syndrom zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bei Ratten ein autoimmunes trockenes Auge induziert und eine solide Dokumentation der Ergebnisse durchführt.