Die Bestimmung der optimalen inhibitorische Frequenz für Krebszellen mit Tumor Behandlung Fields (TTFields)

Das übergeordnete Ziel des TTFields In-vitro-Applikationssystems ist es, ihre Wirkung auf Krebszellen verschiedener Tumorarten zu untersuchen, die klinische Verabreichung von TTFields zu steuern und das Behandlungsergebnis zu optimieren. Diese Methode kann helfen, die Wirkung verschiedener TTField-Parameter auf Krebszellen zu definieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die präklinische Identifizierung der effektivsten TTField-Frequenz ermöglicht, die das Wachstum einer bestimmten Krebszelllinie hemmt, was letztendlich beim Menschen angewendet werden könnte.

Durch leichte Modifikation dieser Technik ist es möglich, die Wirksamkeit der kombinierten Behandlung von TTField und anderen Behandlungsmodalitäten, wie Chemotherapeutika und Strahlentherapie, zu testen. Das Verfahren wird von Yaara Porat, einer Forscherin aus unserem Team, vorgeführt. Zu Beginn installieren Sie TTFields-Schalen mit Deckel auf einer Grundplatte und bereiten weitere acht Schalen vor, die für die Züchtung von Kontrollzellen verwendet werden.

Legen Sie ein steriles, zwei Millimeter dickes Deckglas auf den Boden jeder Schale. Als nächstes suspendieren Sie fünfmal 10 bis die vierten U-87-MG-Zellen in einem Milliliter DMEM-Medium. Die geeignete Anzahl von Zellen, die in jeder Schale plattiert sind, hängt von den Eigenschaften der verwendeten Zelllinie ab.

Es ist wichtig, es vor dem Experiment zu kalibrieren, um ein Überwachsen der Zellen zu vermeiden. Pipettieren Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension auf jedes Deckglas, so dass sich ein Tropfen auf seiner Oberfläche bildet, und bedecken Sie die Schalen mit ihren Deckeln. Inkubieren Sie alle Schalen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, damit die Zellen haften können.

Sobald die Zellen befestigt sind, saugen Sie das Medium mit einer 200-Mikroliter-Pipette aus den Deckgläsern ab und pipettieren Sie dann vorsichtig zwei Milliliter des vollständigen Wachstumsmediums auf jede Schale. Klopfen Sie vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze auf die Ränder des Deckglases, um alle Luftblasen freizusetzen, die sich unter dem Objektträger verfangen haben. Inkubieren Sie die Zellen anschließend bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bis die TTFields-Behandlung beginnt.

Um mit der TTFields-Behandlung zu beginnen, nehmen Sie die Grundplatte aus dem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und legen Sie sie in einen gekühlten Kohlendioxid-Inkubator. Die Temperatur des Kühlinkubators bestimmt die Intensität des elektrischen Feldes. Es ist wichtig, die richtige Intensität zu verwenden, die von der Empfindlichkeit der Zellen gegenüber TTFields abhängt.

Stecken Sie dann eine Flachbandbuchse in die Grundplatte und schalten Sie den TTFields-Generator ein. Öffnen Sie die Software für das TTFields In-vitro-Applikationssystem. Nachdem Sie eine neue Studie definiert haben, indem Sie die Namen des Experiments und des Experimentators eingegeben haben, passen Sie die Frequenz und die Zieltemperatur für jede Schale an.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die TTFields-Behandlung in der Software zu starten, und prüfen Sie, ob alle Gerichte auf dem Monitor hellblau erscheinen, was ihre korrekte Verbindung bestätigt. Um die Verbindung wiederherzustellen, drücken Sie die Schüssel vorsichtig nach unten und drehen Sie sie langsam hin und her, bis die Schüssel hellblau auf dem Bildschirm erscheint. Nach 24 Stunden der Behandlung stoppen Sie das Experiment in der Software, indem Sie auf Pause klicken.

Trennen Sie den Flachkabelstecker von der Grundplatte und legen Sie dann die Grundplatte in den Laminar-Flow-Schrank, dann entfernen Sie die Grundplatte mit den Schalen und den unter Standardbedingungen gezüchteten Steuerzellen aus ihren Inkubatoren. Ersetzen Sie das Medium in allen Schalen durch frisches vollständiges Wachstumsmedium, stellen Sie dann die Kontrollzellen in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und stellen Sie die Bodenplatte wieder in den Kühlbrutschular. Schließen Sie die Grundplatte wieder an den Generator an.

Setzen Sie die Behandlung fort, indem Sie auf die Schaltfläche Weiter klicken. Sobald die Behandlung abgeschlossen ist, beenden Sie das Experiment, indem Sie in der Software auf die Schaltfläche "Experiment beenden" klicken und dann die vom System hochgeladenen Daten speichern. Nachdem Sie den TTFields-Generator ausgeschaltet haben, trennen Sie das Flachbandkabel von der Grundplatte und nehmen Sie das System aus dem Inkubator.

Drücken Sie die Keramikschale nach unten und drehen Sie sie gegen den Uhrzeigersinn, um sie von der Bodenplatte zu lösen. Übertragen Sie anschließend die behandelten TTFields- und Kontrolldeckgläser aseptisch in sterile Petrischalen mit frischem Medium für die weitere Bewertung. Um die Wirkung der TTFields-Behandlung zu bewerten, entfernen Sie das Medium von jeder Deckglasschale, fügen Sie dann 0,5 Milliliter 0,25 % Trypsin/EDTA hinzu und inkubieren Sie die Schalen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, bis sich die Zellen von der Deckglasoberfläche lösen.

Neutralisieren Sie das Trypsin mit 0,5 Millilitern vollständigem Wachstumsmedium und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie die Suspension vorsichtig auf und ab pipettieren. Zum Schluss zählen Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Hier werden die Ergebnisse des Frequenzscans vorgestellt, der in A2780-Zellen durchgeführt wurde und den frequenzabhängigen Einfluss von TTFields auf das Wachstum und die klonogene Kapazität der untersuchten Zellen zeigt.

Die prominenteste Wirksamkeit der Behandlung wurde beobachtet, wenn die Frequenz von 200 Kilohertz angewendet wurde. Die Wirksamkeit der TTFields-Behandlung, die in zwei verschiedenen Intensitäten durchgeführt wurde, wurde in OVCAR-3-Zellen untersucht. Die Studie zeigt einen klaren Zusammenhang zwischen der applizierten Intensität und dem Behandlungsergebnis, wobei die höhere Feldintensität eine größere wachstumshemmende Wirkung hat.

Unabhängig von der applizierten Feldintensität wurde die stärkste Wirkung der TTFields-Behandlung bei einer Frequenz von 200 Kilohertz beobachtet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 30 Minuten pro Tag durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass keine Medien verschüttet werden und das Geschirr ausbalanciert bleibt, wenn es vom Inkubator in die Dunstabzugshaube und zurück transportiert wird.

Nach der TTField-Anwendung können weitere Methoden wie Durchflusszytometrie, Alaninproteinanalyse oder Immunfluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden, um das Behandlungsergebnis und den Mechanismus, der der beobachteten Aktivität zugrunde liegt, weiter zu untersuchen. Diese Technik wird verwendet, um die optimalen TTFields-Frequenzen zu bestimmen, die im klinischen Umfeld für verschiedene Krebsarten angewendet werden sollen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man TTFields in vitro Experimente plant und durchführt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zelllinien gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Schutzhandschuhe und -kleidung getroffen werden sollten.