Die Quantifizierung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Cells Mit Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngene Zebrafisch

Der Limitierungsverdünnungs-Zelltransplantationsassay ist der Goldstandard für die Bewertung des Selbsterneuerungspotenzials in experimentellen Tiermodellen. In dieser Demonstration werden syngene Zebrafischembryonen im Zellstadium mit rag two MIC und RAG two GFP injiziert, um transgene Zebrafische zu erzeugen, die fluoreszenzmarkierte T-Zell-akute lymphatische Leukämie entwickeln. Bis zum 60. Lebenstag werden die primären Leukämiezellen aus dem Zebrafisch isoliert und dann mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung gereinigt.

Als nächstes werden die Zellen bei begrenzter Verdünnung in die Bauchhöhle erwachsener Zebrafische transplantiert, und die Fische werden bis zu 90 Tage lang auf Tumorwachstum überwacht. Schließlich wird das statistische Softwareprogramm für die extreme limitierende Verdünnungsanalyse verwendet, um die Häufigkeit von leukämievermehrenden Zellen innerhalb des ursprünglichen Tumors zu quantifizieren. Die Zelltransplantationsanalyse zur Begrenzung der Verdünnung ermöglicht es den Forschern, die Anzahl der selbsterneuernden Zellen, die in der Masse der Tumormasse enthalten sind, genau zu beurteilen.

Es sind diese sich selbst erneuernden Zellen, die die Krebsentstehung vorantreiben und letztendlich für den Rückfall verantwortlich sind. Der Hauptvorteil der Durchführung von Transplantationsassays mit limitierender Verdünnung im Zebrafischmodell besteht darin, dass für jedes Experiment viele Fische transplantiert werden können, was zu einer besseren Präzision bei der Bestimmung der Häufigkeit von sich selbst erneuernden tumorvermehrenden Zellen führt. Diese Methode ermöglicht Einblicke in tumorvermehrende Zellen in T-Zell, einer akuten lymphatischen Leukämie.

Es kann auch angewendet werden, um andere Krebsmodelle von Zebrafischen zu verstehen. Jessica Blackburn, eine Stipendiatin im Labor, und Sally Liu, eine talentierte Technikerin, werden heute das Verfahren für Sie demonstrieren Um Rag zwei CM und RAG zwei G-F-P-D-N-A Konstrukte zu linearisieren, verdauen 10 Mikrogramm jedes Plasmids mit Restriktionsenzym, nicht eines bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach der Extraktion von Phenylchloroform und der Ethanolfällung suspendieren wir jedes Plasmid in 20 Mikrolitern Wasser.

Bestimmen Sie die DNA-Konzentrationen auf einem 1%-Agro-Gel, indem Sie eine Eins-zu-Eins-, Eins-zu-Fünf- und Eins-zu-10-Verdünnung jedes verdauten Plasmids mit 20 Mikrolitern, 10 Mikrolitern und fünf Mikrolitern einer DNA-Leiter mit hoher Reichweite durchführen. Verdünnen Sie nun die DNA auf eine Endkonzentration von 60 Nanogramm pro Mikroliter für die Injektion in das CG-Syngen eines Stammes. Ein Zebrafischembryo injiziert 250 Nanoliter von 30 Nanogramm pro Mikroliter, zwei CM und 30 Nanogramm pro Mikroliter.

Bringen Sie zwei GFPs in ein Zellstadium und richten Sie die DNA sorgfältig direkt in die Zelle und nicht in das Eigelb aus. Lagern Sie die injizierten Embryonen bei 28,5 Grad Celsius und entfernen Sie die toten Embryonen nach 24 Stunden nach fünf Lebenstagen, bringen Sie die Tiere etwa 28 Tage nach der Injektion in große Tanks. Narkose von Zebrafischlarven durch Zugabe von 200 Mikrolitern von vier Nanogramm pro Milliliter Trica S zu 25 Millilitern Wasser aus dem Fischsystem in einer Petrischale.

Untersuchen Sie die Larven auf die Entwicklung von fluoreszenzmarkiertem TALL, indem Sie ein Epi-Fluoreszenzmikroskop verwenden, um GFP-Fluoreszenz zu erkennen. Trennen Sie tumorpositive Larven von denen, die negativ sind, um sicherzustellen, dass keine leukämischen Fische in der Analyse übersehen werden. Negative Larven können zu einem späteren Zeitpunkt untersucht werden, sobald die Tumore möglicherweise größer geworden sind. Überwachen Sie fluoreszenzmarkierte leukämische Fische mindestens einmal pro Woche mit dem Epi-Fluoreszenzmikroskop, um das Tumorwachstum zu verfolgen.

Wenn GFP-positive Leukämiezellen mehr als 50 % des Tieres überholt haben, fügen Sie einen Milliliter von vier Nanogramm pro Milliliter hinzu. Trica S in eine Petrischale mit neun Millilitern Wasser aus dem Fischsystem geben, um den Fisch zu opfern, den Fisch in eine neue Petrischale mit einem Milliliter 5% fötalem Rinderserum in 0,9 XPBS legen, den Fisch mit einer Rasierklinge mazerieren, die Mischung pipettieren, um großzellige Klumpen zu dissoziieren. Anschließend werden die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Maschensieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen geleitet.

Pipettieren Sie 500 Mikroliter der Zellen in ein vier Milliliter schweres Styroporröhrchen. Fügen Sie einen Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Peridiumiodid hinzu, um den Wirbel der abgestorbenen Zellen zu markieren, und halten Sie die Zellen dann auf Eis. Bereiten Sie auch einen Wildtyp-CG-Fisch vor, um normale Blutzellen zu sammeln, die als Träger für die Tumorzellen während der Transplantation bei vier Millilitern von 5%FPS in 0,9 X PB S auf das 50-Milliliter-Röhrchen für ein Gesamtvolumen von fünf Millilitern dienen.

Zählen Sie die normalen Blutzellen, verdünnen Sie sie auf dreimal 10 bis fünfte Zellen pro Milliliter in 5 % FBS in 0,9 x pbs, pipettieren Sie dann 100 Mikroliter pro Well einer 96-Well-Platte mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer, sortieren Sie GFP-positive PI-negative Tumorzellen in die 96-Well-Platte, die Blutzellen in angegebenen Dosen enthält. Sortieren Sie zusätzlich 10.000 Zellen in eine Vertiefung ohne normale Blutzellen und analysieren Sie sie anhand von Fakten, um die Reinheit und Lebensfähigkeit der sortierten Zellzentrifuge zu beurteilen. Die 96-Well-Platte bei 2000 GS für 10 Minuten auffüllen, um die Zellen zu pelletieren.

Entfernen Sie 95 Mikroliter der Snat und resuspendieren Sie die Zellen in den restlichen fünf Mikrolitern. Injizieren Sie die Zellsuspension mit einer Mikrospritze von mehr als 60 Tage alten adulten syngenen Zebrafischen in die Bauchhöhle. Zebrafische müssen vor der Transplantation nicht betäubt werden.

Transplantation von 45 Fischen mit 10 Leukämiezellen, 20 Fischen mit 100 Zellen, sieben Fischen mit 1000 Zellen und fünf Fischen mit 10.000 TALL-Zellen ca. 28 Tage nach der Transplantation. Untersuchte den Empfängerzebrafisch mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 4 85 20 und einem Emissionsfilter von 5 30 25. Zum Nachweis von GFP-Fluoreszenz.

Notieren Sie die Anzahl der positiven Fische pro Gesamtzahl der injizierten Fische. Untersuchen Sie die Fische alle 14 Tage auf bis zu 90 und notieren Sie die Anzahl der positiven Fische. Wenn ein tumorpositiver Fisch häufiger wird.

Opfern Sie das Tier durch eine Überdosierung von trica US, geben Sie die Ergebnisse in eine Tabelle ein und laden Sie die Daten in die webbasierte Analysesoftware für die extreme Verdünnung hoch, um die Häufigkeit von sich selbst erneuernden Leukämiezellen innerhalb des primären TALL CG 1-Stammes zu bestimmen. Embryonen wurden mit RAG injiziert, zwei cmic und RAG zwei GFP-Larven wurden auf primäre TALL gescreent. Nach 28 Tagen in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten Etwa 5 % der injizierten Fische haben GFP-positive T-Zellen in ihrem Thymus, und 100 % dieser Fische entwickeln Leukämie. Hier wurden fluoreszenzmarkierte TALL-Zellen von 65 Tage alten erkrankten Tieren sortiert und im Limitierungsverdünnungs-Zelltransplantationsassay verwendet. Zuerst wurde ein Gang gezeichnet, um einzelne Zellen auszuwählen.

Dann wurden Propidiumiodid-negative Zellen selektiert. Und schließlich wurde ein Gang gezeichnet, um nur die GFP-positiven Leukämiezellen für die Sortierung auszuwählen. In diesem Beispiel von TALL-transplantierten Fischen am Tag 28 wurden Tumoren im Frühstadium als Bereich mit GFP-positiven Zellen in der Nähe der Injektionsstelle gesehen.

Während einige TLS weiter fortgeschritten waren und sich für diese Experimente ausdehnten, um die Bauchhöhle zu füllen, wurden über 220 Tiere transplantiert, was von einer Person innerhalb weniger Stunden leicht durchgeführt werden kann. Die Datenanalyse mit elda-Software zeigte, dass im Durchschnitt eine von 135 T aller Zellen selbsterneuernde Leukämie-fortpflanzende Zellen waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Tumorzellen transplantiert werden, um die Verdünnung in die Bauchhöhle von syngenetischen Zebrafischen zu begrenzen, und wie Sie die resultierenden Daten verwenden können, um die Häufigkeit von tumorvermehrenden Zellen innerhalb eines bestimmten Tumors zu bestimmen.

Weitere Studien mit gentechnisch veränderten Tieren könnten helfen, die Mechanismen zu identifizieren, die die Selbsterneuerung dieser tumorvermehrenden Zellen steuern.