Synthese von Kern-Schale Lanthanid-dotierte Großbildschirmen Nanokristallen für mobile Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Synthese von Kern-Schale-Lanthanid-dotierten Aufwärtskonversions-Nanokristallen auf der Grundlage eines Hochtemperatur-Co-Präzipitationsansatzes und die Durchführung biokompatibler Oberflächenmodifikationen, die weitere zelluläre Anwendungen ermöglichen. In den letzten Jahren hat unser Labor eine sehr einzigartige Lanthanid-dotierte Aufwärtskonversion von Nanokristallen entwickelt, die sehr einzigartige optische Eigenschaften aufweist, die langwelliges Infrarotlicht absorbieren und dieses Licht im Grunde in mehrfarbige Emissionen im kurzen Wellenlängenbereich umwandeln können, einschließlich UV, das sogar für die Infrarotlichtfenster sichtbar ist. Solche einzigartigen Nanokristallstrukturen weisen auf vielversprechende Eigenschaften für biomedizinische Anwendungen hin.

Diese Methode bietet einen praktikablen Ansatz für die Synthese von Kern-Schale-Upconversion-Nanostrukturen und deren biokompatible Oberflächenmodifikationstechnik für die Proteinregulation von Light-Gate-Membrankanälen bei Nahinfrarotlichtbeleuchtung. Zu Beginn des Verfahrens werden Stammlösungen der Seltenerdacetat-Komplexe in Methanol hergestellt. Bereiten Sie 20 Milligramm pro Milliliter Lösungen von Natriumhydroxid und Ammoniumfluorid in Methanol vor.

Lagern Sie die Stammlösungen bei vier Grad Celsius. Dann pipettieren Sie drei Milliliter Ölsäure und sieben Milliliter 1-Octadecen in einen 50-Milliliter-Kolben mit drei Halsen und rundem Boden. Hinzu kommen 1,089 Milliliter der Yttriumacetatlösung, 0,608 Milliliter der Ytterbiumacetatlösung, 83,6 Mikroliter der Thuliumacetatlösung und 128,5 Mikroliter der Neodymacetatlösung.

Rüsten Sie den Kolben mit einem Rührstab und einem Thermometer aus. Erhitzen Sie den Kolben in einem Ölbad unter Rühren auf 100 Grad Celsius, bis das Methanol verdampft ist. Schließen Sie dann den Kolben an eine Schlenk-Leitung an und pumpen Sie den Kolben zwei bis drei Minuten lang ab, um das restliche Methanol zu entfernen.

Stellen Sie den Kolben anschließend unter eine Stickstoffatmosphäre. Erhitzen Sie das Reaktionsgemisch eine Stunde lang bei 150 Grad Celsius unter Rühren bei 700 U/min. Lassen Sie die Mischung dann auf Raumtemperatur abkühlen.

Geben Sie dann zwei Milliliter der Natriumhydroxid-Stammlösung und 2,965 Milliliter der Ammoniumfluorid-Stammlösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Verschließen Sie das Röhrchen fest und wirbeln Sie das Natriumhydroxid-Ammoniumfluorid-Gemisch fünf Sekunden lang ein. Über einen Zeitraum von fünf Minuten wird das Natriumhydroxid-Ammoniumfluorid-Gemisch mit einer Glaspipette unter Rühren langsam in den Reaktionskolben gegeben.

Anschließend erhitzen Sie das Reaktionsgemisch auf maximal 50 Grad Celsius. Halten Sie die Mischung 30 Minuten lang auf dieser Temperatur. Erhitzen Sie dann die Mischung auf 100 Grad Celsius, um das Methanol zu verdampfen.

Schließen Sie den Kolben an die Schlenk-Leitung an und entfernen Sie das restliche Methanol zwei bis drei Minuten lang unter Vakuum. Der Kolben wird mit Stickstoffgas gefüllt und das Reaktionsgemisch auf 290 Grad Celsius bei fünf Grad Celsius pro Minute erhitzt. Halten Sie die Mischung 1,5 Stunden lang bei oder etwas über 290 Grad Celsius.

Lassen Sie die Mischung dann unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen. Füllen Sie die Produktmischung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie den Rückstand mit 30 Millilitern Ethanol in die Tube.

Die Mischung wird bei 4.000 g acht Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und dispergieren Sie die Feststoffe in 10 Millilitern Hexanen durch Beschallung für zwei Minuten. Der Dispersion werden 30 Milliliter Ethanol zugesetzt, das Gemisch unter den gleichen Bedingungen erneut zentrifugiert und der Überstand verworfen.

Dispergieren Sie die Feststoffe in fünf Millilitern Hexanen und lagern Sie die Dispersion bei vier Grad Celsius. Überprüfen Sie die hochkonvertierte Emission der Kern-Schale-UCNs-Lösung bei 808-Nanometer-Laserbestrahlung im Dunkeln. Um mit der Herstellung von DBCO-modifizierten UCNs zu beginnen, waschen Sie die vorbereiteten Kern-Schale-Nanokristalle durch Zentrifugation in 30 Millilitern Ethanol.

Den Überstand verwerfen und 10 Milliliter einer wässrigen Salzsäurelösung mit einem pH-Wert von vier hinzufügen. Beschallen Sie die Mischung 30 Minuten lang, um die Feststoffe aufzulösen. Füllen Sie die Mischung in ein Glasfläschchen und rühren Sie zwei Stunden lang kräftig um.

Waschen Sie dann die Mischung mit vier 30-Milliliter-Portionen Diethylether. Kombinieren Sie die Ätherfraktionen und legen Sie die gewaschene wässrige Schicht beiseite. Gewinnen Sie spurenligandenfreie UCNs aus den Etherschichten mit 10 Millilitern deionisiertem Wasser und kombinieren Sie die wässrigen Schichten.

Geben Sie 20 Milliliter Aceton zu den kombinierten wässrigen Schichten und wirbeln Sie die Mischung fünf Sekunden lang auf. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 35.000 g für 10 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und lösen Sie den Niederschlag in zwei Millilitern deionisiertem Wasser auf, um eine Lösung aus ligandenfreien UCNs zu erhalten.

Als nächstes lösen Sie 200 Milligramm Polyacrylsäure in 20 Millilitern deionisiertem Wasser durch Ultraschall für 20 Minuten. Hinzu kommt die Lösung ligandenfreier UCNs unter kräftigem Rühren. Stellen Sie den pH-Wert der Mischung mit einer einmolaren Lösung von Natriumhydroxid auf 7,4 ein.

Beschallen Sie die Mischung 30 Minuten lang und rühren Sie die Mischung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur. Dann zentrifugieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 35.000 g G. Waschen Sie die Feststoffe durch Zentrifugation in 10 Millilitern entionisiertem Wasser viermal.

Dispergieren Sie die gewaschenen Feststoffe in acht Millilitern entionisiertem Wasser, um eine Lösung von 10 Milligramm pro Milliliter polymermodifizierter UCNs zu erhalten. Zentrifugieren Sie ein Milligramm der polymermodifizierten UCNs bei 35.000 g für 10 Minuten. Lagern Sie die restliche Lösung bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Feststoffe dreimal durch Zentrifugation in Ein-Milliliter-Portionen trockenem DMF. Lösen Sie dann den Niederschlag in 200 Mikrolitern trockenem DMF auf. Fügen Sie dieser Lösung 12,2 Milligramm HOBT, 14 Milligramm EDC, fünf Milligramm DBCO-Amin und 16 Mikroliter DIPEA hinzu.

Rühren Sie die Mischung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur um. Dann zentrifugieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 35.000 g Sekunden. Waschen Sie die Feststoffe viermal durch Zentrifugation in Ein-Milliliter-Portionen DMSO.

Dispergieren Sie die DBCO-modifizierten UCNs in 0,2 Millilitern DMSO und lagern Sie die Dispersion bei vier Grad Celsius. Zuerst säen Sie eine mal 10 der fünften HEK293-Zellen in eine 12-Well-Platte und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Kombinieren Sie dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen ein Mikrogramm des gewählten Plasmids mit zwei Mikrolitern P3000-Transfektionsmittel in 100 Mikrolitern MEM.

Kombinieren Sie in einem anderen Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 Mikroliter des Transfektionsreagenzes mit 100 Mikrolitern MEM. Beide Mischungen werden 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Kombinieren Sie dann die Mischungen und fügen Sie 400 Mikroliter MEM mit niedrigem Serumgehalt hinzu.

Waschen Sie anschließend die inkubierten Zellen zweimal mit Ein-Milliliter-Portionen serumfreiem DMEM. Verteilen Sie die 600-Mikroliter-Transfektionsmischung in die Vertiefungen der 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie dann das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit Ein-Milliliter-Portionen DMEM. Verteilen Sie einen Milliliter einer tetraacetylierten N-Azidoacetyl-Mannosamin-Lösung in DMEM auf die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius.

Waschen, trypsinisieren und kultivieren Sie die Zellen dann über Nacht in einer konfokalen Schale. Ersetzen Sie anschließend das Medium durch einen Milliliter frisches DMEM, das zwei Mikroliter einer 50-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung von DBCO-UCNs enthält. Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und waschen Sie die Zellen zweimal mit DMEM.

Schalten Sie das Licht des Abzugs aus, geben Sie die entsprechenden Dienpufferlösungen zu den Zellen für die Kalziumbildgebung und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen mit serumfreiem DMEM. Bestrahlen Sie die Zellen mit 808 Nanometern starkem Nahinfrarotlicht mit einer Leistung von 0,8 Watt pro Quadratzentimeter.

Wechseln Sie eine fünfminütige Bestrahlung mit einer fünfminütigen Pause ab, bis die Zellen 20 Minuten lang bestrahlt wurden. Bilden Sie die Zellen mit einem konfokalen Mikroskop ab. Die Transmissionselektronenmikroskopie des Kerns und der Kern-Schale-UCNs zeigte kugelförmige Strukturen mit einer Schalendicke von etwa fünf Nanometern.

Hochauflösende TEM zeigten d-Abstände, die mit hochkristallisierten Nanostrukturen übereinstimmen. Nach der Oberflächenmodifikation konnten die UCNs leicht in Pufferlösung dispergiert werden. Dynamische Lichtstreuung zeigte, dass der hydrodynamische Durchmesser von DBCO-UCNs in wässriger Lösung etwa 96 Nanometer beträgt.

Die Zetapotentiale der PAA- und DBCO-modifizierten UCNs deuten auf negativ geladene Oberflächen hin, was mit der Löslichkeit und Stabilität in wässrigen Pufferlösungen übereinstimmt. Hochkonvertierte Emissionstests zeigten, dass PAA- und DBCO-modifizierte UCNs die gleichen Emissionsmuster aufwiesen wie die Basis-Kern-Schale-UCNs, wenn sie mit 808-Nanometer-Licht bestrahlt wurden. Azid-markierte HEK293-Zellen, die lichtgesteuerte Kanalproteine exprimieren, wurden verwendet, um die Bioanwendungen von DBCO-UCNs zu testen.

Die Lokalisierung der UCNs an den Azid-Tags wurde darauf zurückgeführt, dass die DBCO-Gruppen mit einem azidhaltigen Farbstoff gefärbt wurden. Wenn diese Zellen Nahinfrarotlicht ausgesetzt wurden, erleichterten die DBCO-UCNs den Fluss von Kalziumionen durch die Zellmembran, wie konfokale Bildgebung und Durchflusszytometrie mit einem fluoreszierenden Kalziumindikator zeigten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Kern-Schale-Aufwärtskonversions-Nanokristalle mit biokompatibler Oberflächenmodifikation und ihre weiteren Bioanwendungen vorbereiten können, um den lichtgesteuerten Ionenkanal in lebenden Zellen zu aktivieren, indem Sie diesem Verfahren folgen.