Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In-vitro- Leistung von der vermeintlichen Hämangioblastom Neovaskularisation mit den Sphäroid sprießen Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Leistungsfähigkeit der mutmaßlichen Hämangioblastom-Neovaskularisation mit Hilfe des Sphäroid-Spkeim-Assays in vitro zu bewerten. Die Methode kann helfen, die wichtigsten Fragen im angiogenen Bereich zu beantworten, wie z.B. die Tumorangiogenese. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Produkt eines umfassenden Verfahrens zur In-vitro-Bewertung ist, wo die klassische Tumorangiogenese beim Hämangioblastom existiert und beim Hämangioblastom wächst.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Therapie von Hämangioblastumoren und Gefäßen, da das Ergebnis die Komplexität der Neovaskularisation von Hämangioblastumoren hervorhebt, und dies deutet darauf hin, dass diese häufige Form der Angiogenese nur ein komplementärer Mechanismus ist. Diese Methode kann also einen Einblick in die Untersuchung der Neovaskularisation von Hämangioblastumoren geben. Es kann auch auf Tumoren, Angiogenese und Vaskulogenese im Zusammenhang mit Anwendungen bei einigen soliden Tumoren angewendet werden, wie z. B. bei der vaskulogenen Mimikry von Tumoren in Glastumoren.

Eine reale Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Erzeugung dieser manipulierten Endothelzell-Sphäroidschritte schwer zu erlernen ist. Denn die passende Kondition ist wichtig. Zuerst werden die HUVEC-Endothelzellen in DMEM-Kulturmedium kultiviert, das mit zehn Prozent fötalem Rinderserum, Penicillin und Streptomycin ergänzt wird.

Halten Sie dann die Kultur im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid. Um das shRNA-Fragment zu synthetisieren, verdauen Sie das Plasmid mit ApaI- und EcoRI-Restriktionsenzymen. Fügen Sie dann dem verdauten Plasmid sowohl das Forward- als auch das Reverse-Oligo, 10x NEB-Puffer und doppelt destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 50 Mikrolitern hinzu.

Nachdem Sie alle Reagenzien hinzugefügt haben, erhitzen Sie die Mischung vier Minuten lang bei 98 Grad Celsius. Kühlen Sie dann innerhalb weniger Stunden allmählich auf Raumtemperatur ab. Verwenden Sie T4-Ligase, um die geannealten Oligos und das Plasmid zu ligieren.

Inkubieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius für eine Nacht. Am nächsten Tag fügen Sie fünf Mikroliter Ligaturmischung zu 25 Mikrolitern DH5alpha-kompetenten Zellen hinzu. In 500 Mikroliter DMEM-Medium den lentiviralen Vektor oder den verschlüsselten Vektor zusammen mit anderen Verpackungsplasmiden hinzufügen.

Inkubieren Sie dann die lentivirale Mischung für 25 Minuten bei 37 Grad Celsius. Geben Sie nach der Inkubation 7 Milliliter des DMEM-Mediums in die Rühr- oder lentivirale Mischlösung. Kultivieren Sie die 293FT-Zellen in DMEM-Medium ohne fötales Rinderserum in einer 10 Zentimeter großen Kulturschale.

Geben Sie einen Milliliter der lentiviralen Lösung oder Rührlösung zu den 293FT-Zellen in der Kulturschale. Nach sechs Stunden wird das alte Medium aus der Kulturschale abgesaugt. Ersetzen Sie dann das alte Medium durch frisches DMEM-Medium, das 10 Prozent fötales Rinderserum enthält.

Nach 48 Stunden das Medium einsammeln. Übertragen Sie die HUVEC-Endothelzellen in das lentivirale Medium und halten Sie sie 72 Stunden lang. Geben Sie anschließend zwei Mikrogramm pro Milliliter Puromycin in das HUVEC-Zellkulturmedium.

Zum Schluss inkubieren Sie die Kultur für weitere 24 Stunden. Fügen Sie am nächsten Tag einen Milliliter Trypsin-EDTA hinzu, um HUVEC-Zellen zu trypsinisieren. Dann resuspendieren Sie die trypsinisierte Zellsuspension in DMEM-Medium mit 10 Prozent fötalem Rinderserum.

Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler. Nach der Zählung säen Sie die Zellen in einer 3D-96-Well-Platte mit rundem Boden aus. Nach der Aussaat inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid für 72 Stunden ununterbrochen.

Ersetzen Sie nach 36 Stunden die Hälfte des Nährmediums durch frisches Medium. Tauen Sie die Gellösung zuerst bei vier Grad Celsius auf und verdünnen Sie sie dann im Verhältnis eins zu fünf mit dem reduzierten Serummedium. Saugen Sie die Sphäroide mit einer Mikropipette aus dem DMEM-Medium.

Waschen Sie anschließend die Sphäroide mit fünf Millilitern reduziertem Serummedium. Übertragen Sie vorsichtig die suspendierten Sphäroide und das verdünnte Gel. In eine 15-Well-Platte werden 300 Mikrolitter der gemischten Flüssigkeit aus Sphäroiden und verdünntem Gel eingebettet.

Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Geben Sie anschließend 400 Mikroliter reduziertes Serummedium in eine einzelne Vertiefung. Um eine Verdunstung zu verhindern, füllen Sie die Umgebung der Vertiefung mit sterilem Wasser.

Kultivieren Sie die Zellen dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid und 100 Prozent Luftfeuchtigkeit. Nach der Inkubation aspirieren Sie das alte Medium und geben Sie 600 Mikroliter reduziertes Serummedium mit einem Prozent Endothelzellwachstumszusatz in die Vertiefung und inkubieren Sie einen Tag lang. Nehmen Sie Bilder mit einem inversen Lichtmikroskop auf.

Hier wird die sphäroidische Keimung der Zellen mit einem inversen Lichtmikroskop erfasst, um den Effekt des VHL-Gen-Silencing auf das angiogene Potenzial der Endothelzellen zu untersuchen. Es wird beobachtet, dass ein Sphäroid 12 Stunden nach der lentiviralen Behandlung sowohl in den Kontroll- als auch in den VHL-stummgeschalteten Endothelzellen sprießt. Als nächstes wird eine statistische Analyse durchgeführt, um die Länge der Sprossen zu quantifizieren, die von den zum VHL-Gen stummgeschalteten Sphäroiden erzeugt werden.

Die mittlere Sprossenlänge scheint in den VHL-schallgedämpften Gruppen etwa 125 Mikrometer zu betragen, während sie in der Kontrollgruppe nur etwa 65 Mikrometer beträgt. Die durchschnittliche kumulative Sprossenlänge der schallgedämpften VHL-Gruppe beträgt etwa 1250 Mikrometer, während die der Kontrollgruppe 680 Mikrometer beträgt. Diese Ergebnisse deuten auf eine zweifache Zunahme der Sprossenlänge in den schallgedämpften VHL-Gruppen hin.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 48 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach diesem Verfahren und einer Methode wie dem Kapillarbildungsassay kann ein Assay durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel die Erforschung der angiogenen Fähigkeit von vaskulären Endothelzellen.

Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Angiogenese, um die innere Vaskulorisation von Tumoren zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, welche Gene in manipulierten Endothelzellen, die für explodierende Assays verwendet werden, eine Funktion verlieren.