Name: Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In-vitro- Leistung von der vermeintlichen Hämangioblastom Neovaskularisation mit den Sphäroid sprießen Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung der Neovaskularisation bei Hämangioblastomen mit dem Sphäroid-Sprossungs-Assay in vitro. Diese Methode liefert Einblicke in komplementäre Mechanismen der Tumorangiogenese.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Shanghai Ausschuss für Wissenschaft und Technologie (15411951800, 15410723200) unterstützt. Die Autoren danken Prof. YuMei Wen und Prof. Chao Zhao der pathogenen Mikroorganismus Abteilung der Fudan-Universität für ihre technische Unterstützung.

Diese Methode wurde in Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien und Vorschriften der Forschung Ethik Komitee von Huashan Krankenhaus, Fudan University durchgeführt. Entsprechende standard-Sicherheits-Maßnahmen wurden in den einzelnen Schritten gefolgt. Eine schematische Darstellung finden Sie in Abbildung 1.
(1) Zell-Kultur und Plasmid-Konstrukt
<ol><li>Routinemäßig pflegen die menschliche nabelader Endothelzellen (HUVECS) in Dulbecco modifizierten Adlers Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100-Einheit/mL Penicillin und 100 µg/mL von Streptomycin in einer befeuchteten 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.</li>
	<li>PLKO.1 Plasmid ApaI mit EcoRI für die Synthese von ShRNA Fragment zu verdauen. Sicherstellen Sie, dass die Oligonukleotid-Sequenz von VHL ShRNA Vektor CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14.</li>
	<li>Dann mischen Sie 20 µΜ System mit vorwärts 5 µL 5 µL reverse Oligo Oligo, 5 µL 10 x NEB Puffer und 35 µL DdH2O zusammen (das Gesamtvolumen beträgt 50 µL). Erhitzen Sie die Mischung bei 98 ° C für 4 min, und langsam auf Raumtemperatur abkühlen, in ein paar Stunden.</li>
	<li>Verbinden Sie die geglühten Oligos und PLKO.1 Plasmid zusammen mit T4-Ligase bei 4 ° C für eine Nacht. 16 h später hinzufügen 5 µL Ligatur-Mix in 25 µL kompetente DH5α Zellen. Dann Bildschirm erfolgreich aufgespaltenen Plasmiden, und überprüfen Sie die eingefügte Fragment durch Sequenzierung.</li>
</ol>(2) Lentivirus Paket und Infektion
<ol><li>Insgesamt mischen Sie 10 µg des PLKO.1-ShVHL oder PLKO.1-ShScramble Vektors, 7,5 µg Plasmid psPAX2 zu verpacken und 2,5 µg Umschlag Plasmid pMD2.G in 500 µL der DMEM Medien ohne fetalen bovine Serum (FBS) für 25 min.</li>
	<li>Fügen Sie 7 mLDMEM ohne FBS der Projektmappe bereit oben hinzu.</li>
	<li>Kulturzellen Sie 293 FT in DMEM ohne FBS in einem Durchmesser von 10 cm Gewebekultur Gerichte. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Zellen 293FT 1 x 107 Zelle Zähler.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der Lösung bereit, über das Medium der 293FT Zellen zur Transfektion. Hinweis: Die Zell-Linie 293FT 293F Zelllinie abgeleitet ist und stabil express das SV40 große T-Antigen. Daher ist es ein geeigneter Gastgeber für Lentivirale Produktion.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Kulturmedium mit der DMEM mit 10 % FBS nach 6 h.</li>
	<li>Sammeln Sie die Medien mit einer Pipette in 48 h nach Transfektion. Hinweis: Das Virus existiert in der DMEM mit 10 % FBS. Die abgestorbenen Zellen Schwimmen auf dem Medium. Verwenden Sie sterile Membran 0,45 µm, um abgestorbenen Zellen und Unreinheiten zu filtern. Im Allgemeinen gibt es keine Notwendigkeit, die Multiplizität der Infektion (MOI) zu überprüfen. Dies soll eine stabile Zellen-Linie zu schaffen. Im letzten Schritt werden alle lebenden Zellen ohne erfolgreiche Infektion durch Puromycin sterben. Die ShScramble Gruppe und HUVECS Zellen sind der Kontrollgruppe. Stellen Sie sicher, dass die HUVECS Zellen mit der verwendeten Puromycin Konzentration von 72 h sterben. Jeder Brunnen hat die gleiche Anzahl von Zellen.</li>
	<li>Kultur der HUVECS Zellen in den Lentivirale Medien für 72 h. Fügen Sie Puromycin zu den Medien der HUVECS Zellen in einer Konzentration von 2 µg/mL für 24 Std. Einsatz HUVECS Zellen ohne Behandlung als die Kontrollgruppe. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen sterben bis zu diesem Zeitpunkt zu kontrollieren. Hinweis: Die lebenden Zellen repräsentieren eine stabile Zelllinie von VHL Knockdown Zellen und ShSramble Zellen. Die Beschichtung ist 5.000/Brunnen in 96-Well Platten.</li>
</ol>3. Generation von Endothelzellen Sphäroide
<ol><li>Trypsinize die Mediumwechsel Zellen und Aufschwemmen mittelfristig DMEM mit 10 % FBS. Hinzugeben Sie mit einer moderaten Anzahl von Zellen in der Kulturschale von 10 cm 1 mL Typsin-EDTA.</li>
	<li>Samen der Zellen in einem 3D Rundboden 96-Well-Platte in einer Zelle Dichte von 1 × 103 Zellen/gut. Verwenden Sie einen Brunnen, der ein Sphäroid von 0,50 µL aussetzen der Sphäroid unterbringen kann. Anzahl Zellen mit einem Zellsystem Zähler nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 kontinuierlich für 72 h. Sicherzustellen Sie unter diesen Bedingungen, dass die suspendierten Zellen die Zelle Sphäroide automatisch bilden. Ersetzen Sie die Hälfte des Kulturmediums nach 36 h.</li>
</ol>4. in-vitro- Angiogenese-Assay
<ol><li>Tauen Sie die Gel-Lösung bei 4 ° C auf und verdünnen Sie es mit dem reduzierten Serum Medium bei einem Verdünnungsverhältnis von 1:5.</li>
	<li>Saugen Sie die Sphäroide aus dem Kulturmedium DMEM mit einer Mikropipette. Nach dem Waschen aussetzen die Sphäroide mit 5 mL des Mediums reduzierte Serum der Sphäroide sanft und vorsichtig in das verwässerte Gel. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.</li>
	<li>300 µL der gemischten Flüssigkeit in ein 15-Well-Platte einbetten. Fügen Sie nach der Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 1 h 400 µL reduzierte Serum-Medium in jede Vertiefung hinzu. Füllen Sie steriles Wasser um die Brunnen zu erzeugen eine feuchte Umgebung um Verdunstung zu verhindern.</li>
	<li>Danach die Platte bei 37 ° C in 5 % CO2 bei 100 % Luftfeuchtigkeit für 1 h Kultur.</li>
	<li>Vorsichtig Aspirieren Sie das alte Medium und ersetzen Sie es durch 600 µL reduzierte Serum-Medium mit 1 % Endothelzellen Ergänzungen in jede Vertiefung.</li>
	<li>Nach 12 h oder 24 h, nehmen Bilder unter einem invertierten Lichtmikroskop (40 *).</li>
</ol>(5) Datenanalyse
<ol><li>Laden Sie die Bilder, um eine Online-Bild-Analyse-Plattform sprießen Längendaten (Table of Materials) zu erhalten.</li>
	<li>Erstellen Sie ein Konto auf der Webseite per e-Mail.</li>
	<li>Dann laden Sie die Bilder durch Klicken auf die Schaltfläche "hochladen".</li>
	<li>Herunterladen Sie das Ergebnis durch Klicken auf die Schaltfläche "Download". Hinweis: Die Software generiert das bearbeitete Bild und die Daten. Die Daten enthalten fünf Teile: kumulative sprießen, mittlere sprießen Länge, die Standardabweichung der Länge sprießen, Keimen und Sphäroid Bereich. In das bearbeitete Bild jeden Parameter sind zusammengefasst in einer anderen Farbe, Identifikation in das bearbeitete Bild erleichtern: Rot steht für Sprossen Skelett, Gelb die Anzahl der Sprossen, blau sprießen Struktur, weißen sprießen Ende und orange Sphäroid.</li>
</ol>

<ol><li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673603136434">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li>
<li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma%3A+the+pathologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells%2Fprogenitors+in+the+specific+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li>
<li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102(2014).</li>
<li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li>
<li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li>
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<li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+hemangioblastoma%3A+histogenesis+of+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li>
<li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas%3A+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD41+and+CD45+expression+marks+the+angioformative+initiation+of+neovascularisation+in+human+haemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma.</a> Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).</li>
<li>Sharifpanah, F., Sauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Spheroid-Based+Sprout+Assay+in+Three-Dimensional+Fibrin+Scaffold%3A+A+Novel+In+Vitro+Model+for+the+Study+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).</li>
<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+taurine+upregulated+1+enhances+tumor-induced+angiogenesis+through+inhibiting+microRNA-299+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma.</a> Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).</li>
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<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li>
<li>D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+Vasculogenesis+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease.</a> Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).</li>
<li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li>
<li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li>
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<li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li>
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<li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis%3A+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li>
<li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li>
<li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753(2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Vor kurzem wurden mehrere Felder der vaskulären Biologie Forschung durch die Studie der angiogenen Endothel15stimuliert. In diesem Artikel, entwickelten wir eine endotheliale Sphäroid sprießen Technik als ein experimentelles Modell die Gefäß-Bildung zu studieren aus den Funktionsverlust des VHL-Gens in manipulierten Endothelzellen, neuartige Kandidaten Moleküle zu identifizieren die angiogenen Kaskade. Nach bestem Wissen und gewissen ist dies der erste Bericht der angiogenen Auswirkungen der endog...

Hämangioblastome (HBs) sind gutartige vaskuläre Tumore, die ausschließlich im menschlichen Zentralnervensystem (ZNS) gefunden werden. Sie entwickeln sich bei Patienten mit von Hippel-Lindau (VHL) Erkrankung oder sporadische Läsionen. VHL-HBs sind schwer zu heilen durch chirurgische Behandlung durch die häufige Wiederholung und multiple Läsionen, die sich daraus genetische ergeben Störung1. Obwohl die Inaktivierung von VHL Tumorsuppressor Gen die eigentliche Ursache der Tumorgenese von VHL-HBs angesehen wurde, bleiben die zytologische Ursprung (einschließlich Neovaskularisation) und evolutionären Prozess der HBs weitgehend umstritten2. Daher kann ein besseres Verständnis der biologischen Mechanismen der HB-neovaskulären nützliche Einblicke in die vielversprechendsten Anti-vaskulären Strategien VHL-HBs vorsehen.
Neue Forschung hat vorgeschlagen, dass HB-Neovaskularisation, die embryologische Vaskulogenese3,4,5 ähnelt. Klassische vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF)-vermittelten Angiogenese, entstand aus dem vaskulären Endothel und, angetrieben durch VHL Funktionsverlust, führte zu Verbreitung und neovaskulären Formation, die seit6in Frage gestellt. In 1965, Cancilla und Zimmerman gefunden, verwenden Elektronenmikroskopie, die das Endothel7HBs stammt. Später wurde festgestellt, dass Vasoformative Element8Stromazellen Zellen abgeleitet werden. 1982 fand Jurco Et Al. , dass Stromazellen Zellen von endothelialen Ursprungs-9. Daher vermutet wir, dass menschliche vaskuläre endotheliale Zellen der ursprünglichen Zellen von HB-Neovaskularisation10sind. Obwohl es besser, die Primärkulturen von HB Zellen aus VHL-Patienten Operationen zu verwenden ist, zufolge unserer bisherigen Forschung Primärkulturen von HB sind nicht stabil, und Zell-Linien könnte nicht etablierten3. Darüber hinaus könnte Primärkulturen in der 3D-Umgebung die zytologische Herkunft der HB-Neovaskularisation nicht erkennen, weil sie Vorfahren der HB-Kreislauf Zutaten10,11enthalten. Daher, als primitiv und klassische Modell von Endothelzellen, konnte menschliche vaskuläre endotheliale Zellen (HUVECS) als ein alternatives zellulären Modell für HBs dienen.
Der Sphäroid Sprießende Assay ist ein neues Modell im Tissue engineering12,13. In diesem Papier war ein 3D Kollagen-basierten Coculture System in Vitro mit den Sphäroid sprießen Assay entwickelt mit ein Gesamtziel zu beurteilen, ob klassische Tumor-Angiogenese in HBs, sowie ihre Rolle bei der HBs vorhanden ist.

<table><tbody><tr><td>Endothelzelle der menschlichen Nabelvene</td><td>Fudan IBS Cell Center</td><td>FDCC-HXN180</td><td></td></tr><tr><td>dulbecco' s modifizierter Adler" s Medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>26400044</tr><tr><td>PLKO.1-puro-Vektor</td><td>Addgen</td><td>#8453</td><td></td></tr><tr><td>Packung Plasmid psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>Hüllplasmid pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>3D-96-Well-Platten mit rundem Boden</td><td>S-Bio</td><td>MS-9096M</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>reduziertes Serummedium</td></tr><tr><td>15-Well-Platte</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td>Luftblasen im Gel können durch Ausgleich der &mu; &ndash; Schieben Sie die Angiogenese vor der Verwendung im Inkubator über Nacht</td></tr><tr><td>Endothelzellwachstumsergänzungen</td><td>Sciencell</td><td>#1052</td><td></td></tr><tr><td>10-cm-Kulturschale</td><td>Corning</td><td>Scipu000813</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Typsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Automated Cell Counter System &nbsp;</td><td>BioTech-Bildanalyse-Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Winmasis</td><td></td><td>http://mywim.wimasis.com&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ein umfassendes verfahren zur bewertung der in-vitro- leistung von der vermeintlichen hämangioblastom neovaskularisation mit den sphäroid sprießen assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Die Inaktivierung von der von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsuppressor Gen spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Hämangioblastome (HBs) innerhalb der menschlichen Zentralnervensystem (ZNS). Jedoch die zytologische Herkunft und den evolutionären Prozess der HBs (einschließlich Neovaskularisation) bleiben umstritten und Anti-Angiogenese für VHL-HBs, basierend auf klassischen HB Angiogenese habe produziert enttäuschende Ergebnisse in klinischen Studien. Ein Haupthindernis für die erfolgreiche klinische Übersetzung des Anti-vaskuläre Behandlung ist der Mangel an ein gründliches Verständnis der Neovaskularisation in dieser vaskulären Tumor. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen ein umfassendes Verfahren zur in-Vitro zu bewerten, ob klassische Tumor-Angiogenese in HBs, sowie ihre Rolle bei der HBs vorhanden ist. Mit diesem Verfahren können Forscher genau verstehen die Komplexität der HB Neovaskularisation und die Funktion von dieser Form der Angiogenese in HBs erkennen. Diese Protokolle können verwendet werden, die vielversprechendste Anti-vaskuläre Therapie bei Tumoren, bewerten die translationale Potenzial für die Behandlung von Tumoren oder für die Unterstützung bei der Optimierung der Anti-angiogenen Behandlung für HBs in Zukunft Übersetzungen hat. Die Ergebnisse unterstreichen die Komplexität der HB Neovaskularisation und legen nahe, dass dieses gemeinsame Form Angiogenese nur eine ergänzende Mechanismus in HB Neovaskularisation ist.

Originalbilder werden durch umgekehrte Lichtmikroskop getroffen. Die typische Bilder von der Kontrollgruppe und der VHL-Gruppe sind in Abbildung 2dargestellten-A1 und Abbildung 2-A2. Die Sprießende Länge der Kontrollgruppe ist kürzer als die der VHL-Gruppe.
Nach dem Hochladen der Bilder, bietet die Online-Plattform direkt Analyseergebni...

Dieser Beitrag stellt ein umfassendes Verfahren zur in Vitro zu bewerten, ob klassische Tumor-Angiogenese im Hämangioblastome (HBs) und ihre Rolle bei der HBs vorhanden ist. Die Ergebnisse unterstreichen die Komplexität der HB-Neovaskularisation und deuten darauf hin, dass diese Form der Angiogenese nur einen ergänzenden Mechanismus in der HB-Neovaskularisation ist.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In-vitro- Leistung von der vermeintlichen Hämangioblastom Neovaskularisation mit den Sphäroid sprießen Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Leistungsfähigkeit der mutmaßlichen Hämangioblastom-Neovaskularisation mit Hilfe des Sphäroid-Spkeim-Assays in vitro zu bewerten. Die Methode kann helfen, die wichtigsten Fragen im angiogenen Bereich zu beantworten, wie z.B. die Tumorangiogenese. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Produkt eines umfassenden Verfahrens zur In-vitro-Bewertung ist, wo die klassische Tumorangiogenese beim Hämangioblastom existiert und beim Hämangioblastom wächst.Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Therapie von Hämangioblastumoren und Gefäßen, da das Ergebnis die Komplexität der Neovaskularisation von Hämangioblastumoren hervorhebt, und dies deutet darauf hin, dass diese häufige Form der Angiogenese nur ein komplementärer Mechanismus ist. Diese Methode kann also einen Einblick in die Untersuchung der Neovaskularisation von Hämangioblastumoren geben. Es kann auch auf Tumoren, Angiogenese und Vaskulogenese im Zusammenhang mit Anwendungen bei einigen soliden Tumoren angewendet werden, wie z. B. bei der vaskulogenen Mimikry von Tumoren in Glastumoren.Eine reale Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Erzeugung dieser manipulierten Endothelzell-Sphäroidschritte schwer zu erlernen ist. Denn die passende Kondition ist wichtig. Zuerst werden die HUVEC-Endothelzellen in DMEM-Kulturmedium kultiviert, das mit zehn Prozent fötalem Rinderserum, Penicillin und Streptomycin ergänzt wird.Halten Sie dann die Kultur im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid. Um das shRNA-Fragment zu synthetisieren, verdauen Sie das Plasmid mit ApaI- und EcoRI-Restriktionsenzymen. Fügen Sie dann dem verdauten Plasmid sowohl das Forward- als auch das Reverse-Oligo, 10x NEB-Puffer und doppelt destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 50 Mikrolitern hinzu.Nachdem Sie alle Reagenzien hinzugefügt haben, erhitzen Sie die Mischung vier Minuten lang bei 98 Grad Celsius. Kühlen Sie dann innerhalb weniger Stunden allmählich auf Raumtemperatur ab. Verwenden Sie T4-Ligase, um die geannealten Oligos und das Plasmid zu ligieren.Inkubieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius für eine Nacht. Am nächsten Tag fügen Sie fünf Mikroliter Ligaturmischung zu 25 Mikrolitern DH5alpha-kompetenten Zellen hinzu. In 500 Mikroliter DMEM-Medium den lentiviralen Vektor oder den verschlüsselten Vektor zusammen mit anderen Verpackungsplasmiden hinzufügen.Inkubieren Sie dann die lentivirale Mischung für 25 Minuten bei 37 Grad Celsius. Geben Sie nach der Inkubation 7 Milliliter des DMEM-Mediums in die Rühr- oder lentivirale Mischlösung. Kultivieren Sie die 293FT-Zellen in DMEM-Medium ohne fötales Rinderserum in einer 10 Zentimeter großen Kulturschale.Geben Sie einen Milliliter der lentiviralen Lösung oder Rührlösung zu den 293FT-Zellen in der Kulturschale. Nach sechs Stunden wird das alte Medium aus der Kulturschale abgesaugt. Ersetzen Sie dann das alte Medium durch frisches DMEM-Medium, das 10 Prozent fötales Rinderserum enthält.Nach 48 Stunden das Medium einsammeln. Übertragen Sie die HUVEC-Endothelzellen in das lentivirale Medium und halten Sie sie 72 Stunden lang. Geben Sie anschließend zwei Mikrogramm pro Milliliter Puromycin in das HUVEC-Zellkulturmedium.Zum Schluss inkubieren Sie die Kultur für weitere 24 Stunden. Fügen Sie am nächsten Tag einen Milliliter Trypsin-EDTA hinzu, um HUVEC-Zellen zu trypsinisieren. Dann resuspendieren Sie die trypsinisierte Zellsuspension in DMEM-Medium mit 10 Prozent fötalem Rinderserum.Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler. Nach der Zählung säen Sie die Zellen in einer 3D-96-Well-Platte mit rundem Boden aus. Nach der Aussaat inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid für 72 Stunden ununterbrochen.Ersetzen Sie nach 36 Stunden die Hälfte des Nährmediums durch frisches Medium. Tauen Sie die Gellösung zuerst bei vier Grad Celsius auf und verdünnen Sie sie dann im Verhältnis eins zu fünf mit dem reduzierten Serummedium. Saugen Sie die Sphäroide mit einer Mikropipette aus dem DMEM-Medium.Waschen Sie anschließend die Sphäroide mit fünf Millilitern reduziertem Serummedium. Übertragen Sie vorsichtig die suspendierten Sphäroide und das verdünnte Gel. In eine 15-Well-Platte werden 300 Mikrolitter der gemischten Flüssigkeit aus Sphäroiden und verdünntem Gel eingebettet.Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Geben Sie anschließend 400 Mikroliter reduziertes Serummedium in eine einzelne Vertiefung. Um eine Verdunstung zu verhindern, füllen Sie die Umgebung der Vertiefung mit sterilem Wasser.Kultivieren Sie die Zellen dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid und 100 Prozent Luftfeuchtigkeit. Nach der Inkubation aspirieren Sie das alte Medium und geben Sie 600 Mikroliter reduziertes Serummedium mit einem Prozent Endothelzellwachstumszusatz in die Vertiefung und inkubieren Sie einen Tag lang. Nehmen Sie Bilder mit einem inversen Lichtmikroskop auf.Hier wird die sphäroidische Keimung der Zellen mit einem inversen Lichtmikroskop erfasst, um den Effekt des VHL-Gen-Silencing auf das angiogene Potenzial der Endothelzellen zu untersuchen. Es wird beobachtet, dass ein Sphäroid 12 Stunden nach der lentiviralen Behandlung sowohl in den Kontroll- als auch in den VHL-stummgeschalteten Endothelzellen sprießt. Als nächstes wird eine statistische Analyse durchgeführt, um die Länge der Sprossen zu quantifizieren, die von den zum VHL-Gen stummgeschalteten Sphäroiden erzeugt werden.Die mittlere Sprossenlänge scheint in den VHL-schallgedämpften Gruppen etwa 125 Mikrometer zu betragen, während sie in der Kontrollgruppe nur etwa 65 Mikrometer beträgt. Die durchschnittliche kumulative Sprossenlänge der schallgedämpften VHL-Gruppe beträgt etwa 1250 Mikrometer, während die der Kontrollgruppe 680 Mikrometer beträgt. Diese Ergebnisse deuten auf eine zweifache Zunahme der Sprossenlänge in den schallgedämpften VHL-Gruppen hin.Einmal gemeistert, kann diese Technik in 48 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach diesem Verfahren und einer Methode wie dem Kapillarbildungsassay kann ein Assay durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel die Erforschung der angiogenen Fähigkeit von vaskulären Endothelzellen.Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Angiogenese, um die innere Vaskulorisation von Tumoren zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, welche Gene in manipulierten Endothelzellen, die für explodierende Assays verwendet werden, eine Funktion verlieren.

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Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Das Protokoll beschreibt, wie ein perfusable Kreislauf Netzwerk in ein Sphäroid zu konstruieren. Das Sphäroid umliegenden Mikroumgebung ist entworfen, um induzieren Angiogenese und der Sphäroid an die Mikrokanäle in einem mikrofluidischen Gerät anschließen. Die Methode erlaubt die Perfusion der Sphäroid, das eine lang ersehnte Technik in dreidimensionale Kulturen ist.

Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät

Dieses Protokoll stellt eine neuartige in-vitro- Perle assay, die mehr entsprechend modelliert den Prozess der in Vivo Angiogenese durch den Einbau von Perizyten sprießen. Diese Änderung ermöglicht die Wulst-Assay, treuer rekapitulieren die Zellkulturmodells zellulären Interaktionen zwischen Endothelzellen und Wandbild Zellen, die entscheidend für die Angiogenese.

Einbeziehung der Perizyten in einem Endothelzellen Korn sprießen Assay

Diese Methode beschreibt die Kultur von iPSC-abgeleiteten Endothelzellen als 40 durchfundierte 3D-Mikrogefäße in einer standardisierten mikrofluidischen Plattform. Diese Plattform ermöglicht die Untersuchung von gradientengetriebenen angiogenen Keimen in 3D, einschließlich Anastomose und Stabilisierung der angiogenen Sprossen in einer skalierbaren und hochdurchsatzigen Weise.

Standardisierter und skalierbarer Assay zur Untersuchung perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Das dreidimensionale Co-Kultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay-System wurde entwickelt, um die physiologische Angiogenese nachzuahmen. Co-Kultur-Sphäroide werden von zwei menschlichen Gefäßzellvorläufern, EFCCs und MSCs, gebildet und in Kollagengel eingebettet. Das neue System ist wirksam für die Bewertung angiogener Modulatoren und liefert relevantere Informationen für die in vivo-Studie.

Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden

Dieses Protokoll stellt einen Aderhautkeim-Assay dar, ein Ex-vivo-Modell der mikrovaskulären Proliferation. Dieser Test kann verwendet werden, um Wege zu bewerten, die an sich vermehrenden aderatorischen Mikrogefäßen beteiligt sind, und medikamentöse Behandlungen mit Wildtyp und genetisch verändertem Mausgewebe zu bewerten.

Ein Ex Vivo Choroid Sprouting Assay der ocular Microvascular Angiogenese

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In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

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Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine schnelle, robuste und kostengünstige Herstellung von Tumorsphäroiden mit anschließender Hydrogelverkapselung ermöglicht. Es ist weit verbreitet, da es keine spezielle Ausrüstung erfordert. Es wäre besonders nützlich für die Erforschung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen und die Erstellung von In-vitro-Gewebephysiologie - oder Pathologiemodellen.

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In dieser Arbeit werden der zweidimensionale (2D) Scratch Wound Migration Assay und der dreidimensionale (3D) Sphäroid-Sphäroide-Assay zusammen mit ihren jeweiligen nachgeschalteten Analysemethoden, einschließlich RNA-Extraktion und Immunzytochemie, als geeignete Assays zur Untersuchung der Angiogenese in vitro vorgestellt.

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Erfahren Sie die Bewertung der Neovaskularisation bei Hämangioblastomen mit dem Sphäroid-Sprossungs-Assay in vitro. Diese Methode liefert Einblicke in komplementäre Mechanismen der Tumorangiogenese.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In-vitro- Leistung von der vermeintlichen Hämangioblastom Neovaskularisation mit den Sphäroid sprießen Assay (Video) | JoVE Journal

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In-vitro- Leistung von der vermeintlichen Hämangioblastom Neovaskularisation mit den Sphäroid sprießen Assay

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