Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen halbautomatischen, dreidimensionalen In-vitro-Mikroplatten-Assay der Tumorzellinvasion bereitzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Tumorsteroide reproduzierbarer Größe in Suspension in ultraniedriger Bindung um den Boden 96 herum erzeugt werden, Well-Platten auf einmal Steroide in jeder Vertiefung. Der zweite Schritt besteht darin, Teile des Mediums zu entfernen und Basalmembranen wie Matrix oder BMM direkt zu jeder Vertiefung hinzuzufügen, um eine halbfeste Matrix zu erhalten, in die Tumorzellen aus dem Steroidkörper eindringen.

Als nächstes wird die Tumorsteroidinvasion in Intervallen über einen Zeitraum von 72 bis 96 Stunden überwacht, wobei die Bildaufnahme entweder automatisch auf einem Zytometer oder manuell auf einem Mikroskop durchgeführt wird. Der letzte Schritt besteht darin, die Invasion von Tumorzellen entweder mit einem automatisierten Zytometer oder einer Bildgebungssoftware zu analysieren. Letztendlich wird der 3D-Tumorsteroid-Invasionsassay verwendet, um die Krebsinvasion in vitro in einem Format zu modellieren, das physiologisch relevanter und für gezielte Validierungs- und Wirkstoffscreening-Studien geeignet ist.

Wir glauben, dass diese Technik eine Ergänzung zu den einfachen zweidimensionalen Zellproliferationsassays darstellt, die normalerweise für die Zielvalidierung und das Wirkstoffscreening in der Krebsforschung verwendet werden, da sie es uns auch ermöglicht, die Invasion, die ein Schlüsselaspekt der Krebsprogression ist, in einem physiologisch relevanten dreidimensionalen Format zu untersuchen. Die Idee zu dieser Methode hatte ich erst, als ich die 3D-Tumorphe, das Wachstum auf Mikroplatten, optimiert habe. Ich dachte, es wäre gut, den gleichen Aufbau und den gleichen Blick auch auf die Invasion zu verwenden, und das Ergebnis war einfach, einfach einen Teil des Mediums aus jeder Vertiefung zu entfernen und es durch die Basalmembran-ähnliche Matrix zu ersetzen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist unerlässlich, da es am Anfang schwierig sein kann, die Steroide nach der Tradition des BMM in einer zentralen Position jedes Brunnens zu halten. Dies kann zu einer suboptimalen Bildanalyse führen, da sich die Steroide in unterschiedlichen Fokusebenen befinden. Mit Erfahrung.

Dies kommt selten vor, aber bei Bedarf kann der Prozess durch schonende Zentrifugation der Platte erleichtert werden. Um mit der gesamten BMM auf ICE über Nacht zu beginnen, bewahren Sie einen Satz steriler Filterspitzen für P 10, E 200 und P 1000 Pipetten auf, und sterile Röhrchen sind minus 20 Grad Celsius. Legen Sie auch die 96-Well-Platten mit extrem niedrigem Aufsatz mit vier Tage alten Steroiden auf Eis.

Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig 100 Mikroliter Wachstumsmedium pro Vertiefung von den Spatzenplatten. Winkeln Sie für diesen Schritt die Spitze zur Innenwand des U-Bodens ab. Vermeiden Sie den Kontakt mit dem Boden der Vertiefung und der Position der Tüte.

Um die Störung der Steroide durch eiskalte Spitzen zu minimieren, übertragen Sie das BMM auf eiskalte Röhrchen. Bei Zytokin-induzierter Invasion oder für Studien zur Arzneimittelbewertung fügen Sie dem BMM Reagenzien mit eiskalten Spitzen hinzu. Verwenden Sie beispielsweise den epidermalen Wachstumsfaktor oder EGF, um die Invasion von Cal S- und cal r Plattenepithelkarzinomzellen zu stimulieren.

Geben Sie dann vorsichtig 100 Mikroliter des BMM in den ubo ab. Richten Sie die Spitze auf die Innenwand der Vertiefung. Dieser Schritt ist der kritischste.

Was die optische Bildanalyse betrifft, so müssen Steroide in der Mitte des Brunnens bleiben. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle erforderlichen Wells, und lassen Sie fünf bis sechs Replikationen pro Bedingung zu. Wechseln Sie bei Bedarf mit einer sterilen Nadel zu einer frisch gekühlten Spitze.

Entfernen Sie Blasen, falls vorhanden. Verwenden Sie ein Mikroskop, um visuell zu überprüfen, ob sich die Steroide in einer zentralen Position befinden, wenn sie nicht zentrifugieren die Platte bei 300 mal G für drei Minuten von vier Grad Celsius. Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Steroide zentral in jeder Vertiefung befinden.

Als nächstes stellen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator und lassen das BMM eine Stunde später erstarren. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um vorsichtig 100 Mikroliter pro Vertiefung für vollständiges Wachstum hinzuzufügen. Studien zur Medium- oder Zytokin-induzierten Invasion oder zur Arzneimittelbewertung.

Fügen Sie Zytokine oder Inhibitoren in das Medium für die automatisierte Bildaufnahme ein. Scannen Sie die Platten in Abständen auf dem Zytometer. Wählen Sie ausgehend von Zeitpunkt Null die Confluence-Anwendung aus.

Überprüfen Sie dann, ob das Steroid scharf ist. Stellen Sie bei Bedarf den Fokus manuell ein und korrigieren Sie den Fokusversatz. Unter Sampling-Einstellungen.

Der Selektor scannt ein zentrales Sichtfeld. Nach der BMM-Zugabe sollten die Tumorsteroide in einer zentralen Position geblieben sein. Somit ist es nicht notwendig, die gesamte Vertiefung in der Software zu scannen.

Definieren Sie die zu scannenden Vertiefungen, indem Sie sie auf der Plattenkarte markieren. Klicken Sie dann auf Scan starten. Für die automatisierte Bildanalyse wählen Sie Confluence-Anwendung.

Passen Sie auf der Registerkarte "Analyse" die Anwendungseinstellungen an, um eine präzise Segmentierung um das Steroid herum zu erstellen, einschließlich Zellprozessen und Eindringlingen, die sich in das BMM erstrecken. Passen Sie die Einstellungen für jede Tumorzelllinie und/oder zu verschiedenen Zeitpunkten an. Überprüfen Sie, ob die Analyseeinstellungen für andere Steroide in der Platte geeignet sind, indem Sie auf einige verschiedene Vertiefungen klicken.

Wenn die Segmentierung ein Steroid nicht genau umreißt, passen Sie die Anwendungseinstellungen weiter an. Klicken Sie auf der Registerkarte Ergebnisse auf Analyse starten. Überprüfen Sie mehrere Wells, um die Analysequalität zu überprüfen, bevor Sie die Well-Level-Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm exportieren.

Wiederholen Sie die Analyse für alle Zeitpunkte, und berechnen Sie dann den mittleren prozentualen Zusammenfluss für replizierte Bohrlöcher und plus Invasion über Zeit in einem Balkendiagramm. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, das mit dem 10-fach-Objektiv ausgestattet ist, um mit wissenschaftlichen Grafiken und statistischer Software der Wahl für die manuelle Bildaufnahme in Intervallen ein Bild für jedes Tumorsteroid aufzunehmen. Beginnend mit T ist gleich Null, nachdem T zwischen 72 und 96 Stunden liegt.

Abhängig von der Geschwindigkeit der Invasion der betreffenden Zellschleimhaut verwenden Sie ein Forex-Ziel, wenn ein eingedrungener Bereich zu groß ist, um vollständig innerhalb des 10-fachen Sichtfeldes erfasst zu werden. Speichern Sie jedes einzelne aufgenommene Bild für die manuelle Bildanalyse. Öffnen Sie die Bühnendiagramme in der Bildanalyse.

Die Software der Wahl für die Kalibrierung sind Bilder eines Bühnendiagramms, das aufgenommen wird. Verwendung von 10 x und vier x Objektiven. Geben Sie die grafischen Messwerte, die Einheiten und die verwendeten Objektive ein und führen Sie die Kalibrierung durch.

Dieser Schritt ist nur einmal für die nachfolgende Bildanalyse erforderlich. Laden Sie einfach die erforderlichen Kalibrierungseinstellungen neu. Öffnen Sie als Nächstes die Invasions-Assay-Bilder und wählen Sie die Kalibrierungseinstellungen in Abhängigkeit vom Mikroskopobjektiv aus, das zur Aufnahme der Bilder verwendet wurde.

Messen Sie die Fläche, die von den Steroiden in der hier verwendeten Software abgedeckt wird. Gehen Sie zu Messen und wählen Sie die Zählgröße aus. Wählen Sie while, dann load-Einstellungen und wählen Sie vorgegebene Assay-Einstellungen.

Wählen Sie dann count (Anzahl) aus. Das Steroid sollte dann genau segmentiert werden. Beim Exportieren von Messungen handelt es sich um verschiedene Parameter für eine Tabellenkalkulation und die Aufzeichnung der relevanten Bildinformationen in der Tabelle.

Zeichnen Sie schließlich die mittlere Fläche der Replikation von Steroiden oder der Invasion über die Zeit mit wissenschaftlichen Grafiken und statistischer Software. Hier als Beispiel für eine Krebszellinvasion, die in der Glioblastom-Zelllinie U 87 MG beobachtet wurde, die als Beispiel für die Invasion von Hirntumoren verwendet werden kann. Einmal eingebettet in BMM-Zellen, die sich mit einem typischen Starburst-Invasionsmuster ausbreiten, wird der Prozess über einen Zeitraum von 72 Stunden verfolgt.

Vollautomatische Bildanalyse. Die Verwendung eines bildgebenden Zytometers erzeugt eine Segmentierung um die Zellvorsprünge und ermöglicht eine genaue Quantifizierung der Tumorzellinvasion. Beachten Sie, dass bei dieser Zelllinie der Steroidkörper von der Messung des eingedrungenen Bereichs ausgeschlossen ist.

Die vollautomatische Bildanalyse ist einfach durchzuführen und ermöglicht die Quantifizierung der Tumorzellinvasion im Laufe der Zeit. Ein anderes Muster der Zellinvasion zeigt sich bei humanen Plattenepithel-, Kopf-Hals-Isogenen. Krebszelllinien, auf die Cal S empfindlich reagiert, und CAL R ist resistent gegen EG FFR-Tyrosinkinase-Inhibitoren.

In Abwesenheit von EGF drang keine der beiden Zelllinien in das BMM ein, wenn EGF-fingerartige Ausstülpungen vorhanden waren, die aus dem Hauptkörper der Cal ars-Steroide extrudiert wurden. Während die Zellen von Cal nach 72 Stunden weniger invasiv waren, wurden die Bilder in diesem Fall schnell mit einem Bildzytometer aufgenommen, und um eine alternative Methode zu veranschaulichen, wurde der Grad der Invasion manuell mit einer eigenständigen Bildanalysesoftware quantifiziert. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass jede Zelllinie für ihre Fähigkeit, Steroide zu bilden, optimiert werden muss. die Zell-Seeding-Dichte, die Matrixzusammensetzung sowie die Bild- und Analyseeinstellungen Befolgen Sie dieses Verfahren. Die gleiche Methode, die auch angepasst werden könnte, um eine 3D-Gewebeinvasion zu beurteilen, indem beispielsweise Tumore in Co-Kultur mit Embryokörpern verwendet werden, um einem komplexen Gewebe oder anderen Organoiden wie Astrozyten für Gliome oder Kryptenkulturen für Magen-Darm-Krebs oder Leber für hepatozelluläre Karzinome und Darmkrebsmetastasen zu ähneln.