Rekonfigurierbare mikrofluidischen Kanal mit Pin-diskretisierten Seitenwangen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein rekonfigurierbares mikrofluidisches Gerät herzustellen, dessen Seitenwände aus einer Anordnung von Stiften bestehen. Der Hauptvorteil dieses mikrofluidischen Geräts ist seine Fähigkeit, mit schwer zu fließenden Objekten und Situationen umzugehen, die in der Phase des Kanalentwurfs unbekannt sein können. Im Allgemeinen haben Einzelpersonen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, winzige Stifte in Hundeknochenformen zu ätzen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Zusammenbau vieler mikrofluidischer Teile und deren Montage auf der Basis allein aus dem schriftlichen Protokoll schwer zu erlernen ist. Dieses Foto zeigt das fertige mikrofluidische Gerät mit einem rekonfigurierbaren Kanal. Hier befindet sich der rekonfigurierbare Teil am oberen Rand des Bildes.

Ein Explosionszeichnungsschema zeigt einige seiner Hauptkomponenten. Beachten Sie insbesondere den Mikrokanal und die Pins, die für die Neukonfiguration verwendet werden. Ätzen Sie in einem ersten Schritt die Stifte.

Beginnen Sie mit entfetteten, 0,3 Millimeter dicken, L-förmigen Edelstahlstiften unterschiedlicher Länge. Halten Sie vier Milliliter 10%ige Salpetersäure bereit und tauchen Sie die Stecknadeln hinein. Stellen Sie den Behälter dann für 30 Minuten in einen 65 Grad Celsius heißen Ofen.

Nachdem Sie die Stecknadeln entnommen haben, geben Sie sie nacheinander mit einer Pinzette in einen Behälter mit entionisiertem Wasser. Als nächstes beschallen Sie sie fünf Minuten lang im Wasser. Wenn Sie fertig sind, trocknen Sie sie mit einem Papiertuch ab.

Halten Sie 0,5 Milliliter Trennmittel bereit und tauchen Sie die Stifte darin. Legen Sie die Stifte nach zwei Stunden in entionisiertes Wasser und beschallen Sie sie fünf Minuten lang. Zum Weitermachen ist eine Ätzschale erforderlich.

Die Ätzschale besteht aus Glas- und Silikonkleber. Beginnen Sie den Ätzvorgang, indem Sie Silikonkleber für die Stiftenden auf die Schale auftragen. Platzieren Sie die Stecknadeln so, dass die Spitzen an ihren geraden Enden in den Kleber eingetaucht sind.

Dies ist die Schale, nachdem alle Stifte an Ort und Stelle sind und bereit für den nächsten Schritt. Bringen Sie die Ätzschale in einen befeuchteten, auf 38 Grad Celsius erhitzten Fermenter und warten Sie über Nacht, bis der Klebstoff ausgehärtet ist. Wenn sie fertig ist, stellen Sie die Ätzschale mit Stecknadeln auf eine 65 Grad Celsius heiße Platte.

Gießen Sie 0,8 Milliliter Ätzsäure über den unbedeckten Bereich der Stifte. Nach 10 Minuten die Säure mit einer Mikropipette in ein Becherglas umfüllen. Geben Sie dann mehr Ätzsäure in die Schüssel, um den Ätzschritt zu wiederholen.

Überprüfen Sie nach dem Ätzen, ob die Breite des geätzten Bereichs etwa 0,2 Millimeter beträgt. Wenn ja, mikropipettieren Sie fünf Milliliter Natriumbicarbonatlösung auf die Ätzschale, um die restliche Säure zu neutralisieren. Verwenden Sie als Nächstes eine Pinzette, um die Stifte zu entfernen, indem Sie sie in Längsrichtung ziehen.

Beginnen Sie mit einer vorgefertigten Form. Wie in diesem Schema ist die Form für ein Gerät mit einer festen Seitenwand und Platz für Stifte. Erstellen Sie die Form auf einem Objektträger mit Hilfe der Lithografie.

Legen Sie den vorbereiteten Objektträger auf den Boden einer Plastikschüssel. Gießen Sie nun das Prepolymer aus PDMS bis zu einer Dicke von drei Millimetern auf die Form. Stellen Sie die Schale für 10 Minuten in einen Vakuumexsikkator.

Stellen Sie es danach für eine Stunde bei 65 Grad Celsius in einen Ofen. Das Ergebnis ist eine teilweise ausgehärtete Platte. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Platte für die nächsten Schritte zu entformen.

Legen Sie die Platte für eine Stunde bei 120 Grad Celsius in einen Ofen, um sie vollständig auszuhärten. Arbeiten Sie nun mit der vollständig ausgehärteten Platte. Es hat unregelmäßige Kanten entlang des Hilfslinienmusters.

Schneide die unregelmäßigen Ränder mit einem Skalpell präzise und sauber ab. Achten Sie besonders auf die Oberfläche für die Pin-Einsteckschlitze, um das beste Gerät zu erstellen. Perforieren Sie Löcher für den Einlass/Auslass der Hauptkammer und an anderen Stellen mit Biopsiestempeln.

Stellen Sie nun eine Mikrokanal-Baugruppe her. Erhitzen Sie eine Reinigungslösung auf 60 Grad Celsius und erhalten Sie ein Deckglas mit der Nummer vier. Das Deckglas misst 10 Millimeter mal 20 Millimeter

Tauchen Sie das Deckglas 10 Minuten lang in die Lösung. Legen Sie das gespülte und getrocknete Deckglas und die PDMS-Platte auf die untere Elektrode eines Sputter-Coaters. Erzeugen Sie 30 Sekunden lang Luftvakuumplasma.

Verkleben Sie das entnommene Element so, dass die Kanten ausgerichtet sind und die Kanalmerkmale durch das Deckglas sichtbar sind. Verwenden Sie einen sterilen Behälter, um die verklebten Schichten zu einer Laminarhaube zu bringen, um sie zu sterilisieren. Wenn Sie fertig sind, stecken Sie die Stifte in den Schlitz.

Benachbarte Stifte sollten unterschiedlich lang sein. Die Stifte bilden die andere Seitenwand der Mikrokammer. Arbeiten Sie weiter in der Laminarhaube.

Halten Sie für die nächsten Schritte eine Basis für das Gerät bereit. Bereiten Sie den Gap-Filler vor, indem Sie eine Mischung aus weißem Vaseline und Polytetrafluorethylenpulver homogenisieren. Gießen Sie die homogenisierte Mischung in eine Spenderspritze und setzen Sie einen Kolben ein.

Drücken Sie den Kolben, um die Spritzenspitze zu füllen. Befestigen Sie dann eine Nadel und drücken Sie den Kolben, bis die Nadel gefüllt ist. Bereiten Sie auf ähnliche Weise eine zweite Spritze mit Silikonkleber vor und schließen Sie jede Spritze an einen pneumatischen Spender an.

Tragen Sie nun Silikonkleber auf die Unterlage auf. Stecken Sie es in eine der Taschen. Setze dann ein Deckglas mit der Nummer vier auf die Tasche und drücke es fest, um es zu verbinden.

Tragen Sie anschließend Silikonkleber entlang der beiden äußeren Schlitze der Basis auf, indem Sie etwa einen Millimeter tiefe Segmente zeichnen. Entlang eines weiteren Schlitzes in der Mitte Lückenfüller in einem einen Millimeter tiefen Segment dosieren. Tragen Sie mehr Kleber auf den Rand der anderen Tasche auf.

Setzen Sie eine Mikrokanaleinheit auf die Tasche und drücken Sie sie fest. Geben Sie erneut Lückenfüller in den Schlitz in der Mitte des Bodens. Tragen Sie anschließend Klebstoff auf die angrenzenden Schlitze auf.

Lassen Sie das Gerät einen Tag in der sterilen Haube stehen. Bewegen Sie nach dem Aushärten in der laminaren Haube jeden Stift bis zu einem Millimeter entlang der angrenzenden Stifte, um sie von der Elastomerbarriere zu lösen. Richten Sie einen Fluoreszenztest auf Leckage ein, indem Sie grünen Fluoreszenzfarbstoff in ionisiertem Wasser verdünnen.

Öffnen Sie dann den Mikrokanal, um eine gleichmäßige Breite zu erhalten. Verwenden Sie eine Mikropipette, um den Farbstoff auf eine Endöffnung des Mikrokanals zu übertragen, und füllen Sie ihn mit der Lösung. Legen Sie in eine große Plastikschale zwei mit entionisiertem Wasser angefeuchtete Stücke saugfähiges Papier und das Gerät hinein.

Inkubieren Sie das Gericht mindestens 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5%iger Kohlensäure. Betrachten Sie das geborgene Gerät mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop und nehmen Sie Bilder auf. Verwenden Sie diese, um sicherzustellen, dass um die Stifte herum keine Leckagen vorhanden sind.

Diese Bilder zeigen eine undichte und eine nicht undichte Probe. Ein weiterer Test beinhaltet die Aussaat von Zellen. Öffnen Sie den Mikrokanal, um einen geraden Kanal mit einer Breite von 400 Mikrometern zu erstellen, bei dem die Seitenwand durchgehend so flach wie möglich ist.

Fügen Sie einem Endanschluss eine Zellsuspension hinzu, um den Kanal zu füllen. Suchen Sie die Stifte, die die Seitenwand des Bereichs definieren, um die Zellkultur zu starten, und schließen Sie sie, um die Zellen in dem Bereich einzuschließen. Beginnen Sie in der Nähe des Bereichs und schließen Sie alle Stifte, um die Zellen im Kanal auszustoßen.

Nach dem Ansaugen der Suspension aus den Endanschlüssen wird Medium hinzugefügt. Legen Sie das Gerät in einen Plastikbehälter mit nassem saugfähigem Papier. Inkubieren Sie es mindestens 24 Stunden lang.

Achten Sie darauf, dass die Zellen in dem umschlossenen Bereich etwa 10 Zellen pro Stück groß sind. Ziehen Sie dann langsam eine Stecknadel zurück, um den Kulturbereich zu erweitern. Diese Bilder zeigen COS-7-Zellen, die in einem rekonfigurierbaren Mikrokanal gezüchtet wurden.

Im Laufe von neun Tagen wurde der Bereich der Mikrokanalkultur erweitert. Die gesammelten Daten erlauben es, die Zellzahl und die Dichte als Funktionen der Zeit darzustellen. Die blauen Punkte und die Kurvenanpassung beziehen sich auf die Zellenanzahl.

Die roten Symbole und Passungen stehen für die Dichte. Für die Dichte zeigen die vertikalen Pfeile die Ausdehnung der Zellkulturfläche nach zwei, fünf und sechs Tagen an. Die Dichten werden für die gleichen Kulturflächen berechnet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie aus kleinen Stiften eine leckagefreie Seitenwand eines mikrofluidischen Kanals bauen können. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, jeden der Protokollschritte sorgfältig und gründlich durchzuführen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit starken Säuren äußerst gefährlich sein kann und immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Vorbereitung einer ausreichenden Menge an Neutralisationsmittel getroffen werden sollten. Nach diesen Verfahren können andere Zellen mit Flüssigkeit eingeführt werden, um komplexere Zellkulturen zu etablieren.