Mikrofluidischen Mischern für ein Studium Proteinfaltung

In dieser Arbeit erklären wir die Herstellung und Verwendung eines mikrofluidischen Mixer zum Mischen zweier Lösungen in ~ 8 ms. Wir zeigen auch den Einsatz dieser Mischer mit spektroskopischen Nachweis mittels UV-Fluoreszenz-und Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET).

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zwei Lösungen schnell zu mischen, um eine biochemische Reaktion auf der Zeitskala von Mikrosekunden zu starten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein mikrofluidischer Mischer hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, einen Chip mit einem Deckglas zu verkleben, um die Kanäle abzudichten.

Als nächstes wird der Chip an einen Verteiler montiert, der die Lösungsbehälter enthält. Der letzte Schritt besteht darin, die gemischte Lösung mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Letztendlich wird die biochemische Reaktion auf der Zeitskala von Mikrosekunden erfasst, indem die Entfernung entlang des Austrittskanals in Zeit umgewandelt wird.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Stop-Flow-Mischen besteht darin, dass das Mischen nicht durch Turbulenzen begrenzt ist und in wenigen Mikrosekunden erfolgt. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Proteinfaltung zu beantworten, z. B. wann tritt ein hydrophober Kollaps auf? Das Verfahren wird von Ling Woo demonstriert, einem Postdoc für mein Labor, um mit der Herstellung von mikrofluidischen Mischchips zu beginnen.

Reinigen Sie zunächst vier Zoll FU-Silica-Wafer mit frischer Piranha-Lösung, wie im schriftlichen Protokoll zu diesem Video beschrieben. Als nächstes wird mit einem Niederdruckofen für chemische Gasphasenabscheidung eine Polysiliziumbeschichtung mit einer Dicke von etwa einem Mikrometer pro vorgesehener Tiefe von 10 Mikrometern der endgültigen mikrofluidischen Kanäle aufgetragen. Nach der weiteren Behandlung der Wafer, wie im Text beschrieben, schleudern Sie die Wafer mit einer 900 Nanometer dicken Schicht eines Z 52 14 Fotoresists und backen Sie dann bei 90 Grad Celsius direkt auf einer heißen Platte für eine Minute oder in einem Ofen bei 110 Grad Celsius für 30 Minuten weich

Stellen Sie nach dem Ausrichten einer Fotomaske einen harten und vakuumartigen Kontakt her, indem Sie den Fotolack zunächst einige Sekunden lang UV-Licht aussetzen. Entwickeln Sie dann das Muster im Fotolack, wie es im schriftlichen Protokoll aufgeführt ist. Untersuchen Sie die Merkmale auf dem Wafer mit einem Mikroskop und backen Sie ihn bei 115 Grad Celsius direkt auf einer heißen Platte für zwei Minuten hart.

Anschließend DCU die Wafer mit Asher oder Sauerstoffplasma für 2,5 Minuten bei 100 Watt HF-Leistung. Ätzen Sie mit einem tiefenreaktiven Ionenätzer die Poly-Kieselsäure-Schicht bis zum darunter liegenden Quarzglas. Entfernen Sie das restliche Foto, lackieren Sie und behandeln Sie den Wafer wie im Text angegeben.

Messen Sie die Ätztiefe, um sicherzustellen, dass sie vollständig durch die Polybeschichtung hindurch ist. Unter Verwendung eines oxidfähigen tiefenreaktiven Ionenätzers wird Quarzglas bis zu einer Tiefe von etwa 10 Mikrometern pro Mikrometer Dicke der Polybeschichtung geätzt. Reinigen Sie den Wafer vier Minuten lang mit dem Matrix-Asher mit einer HF-Leistung von 100 Watt und entfernen Sie das Polysilizium mit einem Xenon-Difluorid-Ätzer, bevor Sie Löcher in die Wafer-Spin-Beschichtung mit einer neuen Ein-Mikron-Schicht Fotolack bohren, um die Kanäle während der anschließenden Handhabung zu schützen.

Montieren Sie dann den Wafer mit der Seite nach unten auf eine Opferglasplatte mit Aqua Bond 55. Achten Sie darauf, dass der Bonder frei von Blasen bleibt, kühler computergesteuerter Diamantbohrer mit Micro 90 Reinigungslösung. Dadurch wird verhindert, dass kleine Glasstücke an den Kanälen haften bleiben, die den Chip dann während des Gebrauchs verstopfen.

Fahren Sie mit dem Bohren von Löchern fort, die in jeden Chip ein- und austreten. Spülen Sie den Wafer mit deionisiertem Wasser mit einer Spritze ab, um Wasser in jedes Loch zu injizieren. Dann nach dem Entfernen des Fotos eine Stunde lang in Seifenwasser einweichen.

Resistieren und kleben wie im Text beschrieben. Spülen Sie den Wafer mit entionisiertem Wasser und warmem Seifenwasser ab. Spülen Sie jedes Loch erneut mit einer Spritze und vermeiden Sie dabei die geätzten Merkmale, nachdem Stickstoff über den Wafer geflossen ist.

In einem auf 120 Grad Celsius eingestellten Vakuumschrank weiter trocknen. Überprüfen Sie die Löcher, um sicherzustellen, dass sie frei von Schmutz sind, und wiederholen Sie die Reinigungsschritte bei Bedarf. Die folgenden Schritte sollten im Reinraum durchgeführt werden.

Messen Sie die Tiefe der Kanäle entweder mit einem optischen oder mechanischen Oberflächenprofilmesser. Reinigen Sie den Wafer sowie ein Fuse Silica Deckglas wie im Text beschrieben in einem Reinraum. Trocknen Sie den Wafer mindestens fünf Minuten lang gründlich mit Stickstoffgas.

Legen Sie dann den Wafer mit der Seite nach oben auf einen Stapel von drei bis vier Reinraumtüchern, die auf eine harte, flache Oberfläche, wie z. B. eine kleine Glasscheibe, gelegt werden. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem Deckglas. Nehmen Sie das Deckglas an der Kante auf und drehen Sie es so um, dass die Polierseite mit der Vorderseite nach unten über den Wafer gehalten wird.

Richten Sie die flachen Kanten vorsichtig aus, lassen Sie das Deckglas auf den Wafer fallen und lassen Sie es sich nur horizontal setzen, um die Ausrichtung anzupassen. Drücken Sie mit einem Finger auf die Mitte des Wafers nach unten. Man sollte sehen, wie eine Bindungsfront beginnt, nach außen zu strahlen.

Üben Sie bei Bedarf zusätzlichen Druck auf andere Positionen um den Wafer aus, um die Bondfront vorzuschieben. Nachdem Sie die versiegelten Wafer in einen Hochtemperaturofen gelegt haben, der mit dem im Text aufgeführten Temperaturprofil programmiert ist, würfeln Sie den Wafer mit einer Wafer-Würfelsäge in einzelne Chips. Der Verteiler zur Aufnahme des Mischchips und der Lösungen kann aus Kunststoff wie Lexan oder Plexiglas oder Aluminium bestehen.

Zur Temperaturkontrolle wird der Chip durch kleine O-Ringe mit dem Verteiler verbunden und mit einem Sicherungsring festgehalten, der eine klare optische Sicht auf die Mitte des Chips ermöglicht. Die O-Ring-Nuten sollten flacher als der Standard sein, um eine gute Verbindung zu gewährleisten, ohne zu viel Druck auf den Chip auszuüben. Sobald der Chip montiert ist, fügen Sie Lösungen zu den mittleren und seitlichen Behältern hinzu und achten Sie darauf, dass alle Blasen, die am Boden der Vertiefungen eingeschlossen sind, freigesetzt werden.

Stellen Sie den Verteiler auf ein inverses Mikroskop und untersuchen Sie den Mischbereich mit dem Okular- oder Kameraausgang. Eine Glühlampenlampe, die oben auf dem Verteiler platziert ist, sorgt für genügend Licht. Verwenden Sie einen Farbstoff oder eine Brechungslösung mit hohem Brechungsindex im mittleren Kanal, um den Strahl zu betrachten.

Da die in diesem Mischer verwendeten Volumina so klein sind, kann der Durchfluss mit Luftdruck über den Lösungsvertiefungen gesteuert werden. Um den Strahl zu visualisieren, beginnen Sie mit dem Seitenkanaldruck bei null Pfund pro Quadratzoll und erhöhen Sie ihn langsam auf den gleichen Druck mit dem Mittelkanal. Wenn ein Seitenkanal verstopft ist, wird die Düse gegen eine der Wände des Austrittskanals gedrückt.

Wenn eine sichtbare Verstopfung auftritt, kann sie durch Ausüben von Druck oder Vakuum mit einer Spritze auf den Austrittskanal gelöst werden. Wenn Protein oder anderes organisches Material den Chip verstopft, kann er durch Einweichen und Piranha-Lösung über Nacht gereinigt werden. Bringen Sie einen beschichteten Laserstrahl mit einem dichroitischen Spiegel in ein Mikroskop für die Forschung, entweder innerhalb oder direkt außerhalb des Mikroskops.

Richten Sie den Laser so aus, dass der Fokus im Okular oder in der Kamera etwas in der Nähe des Mischbereichs zu sehen ist. Die Fluoreszenz des Proteins im Mischer wird vom Objektiv gesammelt und durch den dichroitischen Spiegel geschickt, der durch eine Linse auf eine Lochblende fokussiert und auf einem Photonenzähler abgebildet wird. Scannen Sie den Chip mit einem elektrischen Pizo-Scanner in x und y, um den Mischbereich abzubilden.

Wählen Sie eine Position auf dem Düsenstrahl und scannen Sie in X und Y, um den Fokus vertikal in der Mitte des Kanals zu finden. Die Schärfentiefe des Mikroskops ist viel geringer als die Kanaltiefe, und die Flussrate ist im Kanal gleichmäßig, außer innerhalb eines Mikrometers von den Wänden. Daher wird die zeitliche Auflösung der beobachteten Fluoreszenz in erster Linie durch die Größe des konfokalen Flecks bestimmt.

Scannen Sie horizontal innerhalb des Austrittskanals in 100-Mikrometer-Schritten entlang des Jets und beobachten Sie dabei etwa eine Millisekunde pro Position. Bewegen Sie den Mikroskoptisch um 80 bis 90 Mikrometer entlang des Strahls, um spätere Zeiten zu erfassen. Alternativ kann Licht durch einen Spektrographen und CCD nach dem dichroitischen Spiegel detektiert werden, wobei eine Linse verwendet wird, um das Licht auf den Eintrittsspalt zu fokussieren.

Da die Datenerfassung langsamer ist als beim Photonenzähler, wird in der Regel zuerst der Jet mit dem Photonenzähler abgebildet und dann werden Punkte entlang des Jets mit dem Spektrografen gemessen. Die Daten des Photonenzählers werden analysiert, indem drei bis fünf Pixel um den Jet an jeder Position addiert werden, um ein Diagramm der Intensität über die Entfernung zu erstellen. Die Zeit wird aus der Entfernung berechnet, wobei eine berechnete Geschwindigkeit verwendet wird, die auf den ausgeübten Drücken basiert.

Analysieren Sie im letzten Schritt die Daten aus dem Spektrografen mit einer der im Text beschriebenen Methoden. Hier ist ein Konturdiagramm der Intensität im Mischbereich dargestellt, die mit dem Photonenzähler gemessen wird. Der Hintergrund im Austrittskanal außerhalb des Strahls sollte nahe am Grundrauschen des Detektors liegen und wird in der Regel nicht subtrahiert.

Ein höherer Hintergrund kann auf eine schlechte Ausrichtung hinweisen oder darauf, dass das Protein an den Wänden des Kanals haftet. Umgekehrt deutet ein Strahl, der vor allem in der Nähe des Mischbereichs knickt oder krumm aussieht, auf eine schlechte Ätzung der Düsen hin. Es wird ein zeitaufgelöstes Spektren des Proteins ACell, Coenzym, eines Bindungsproteins oder A CBP gezeigt, das mit Alexa 4, 88 und Alexa 6, 47 markiert ist.

Die grünen und roten Rechtecke zeigen die Wellenlängen, die als Donor- bzw. akzeptierte Kanäle bezeichnet werden. Diese Daten wurden im Hintergrund subtrahiert, um die dunkle Ladung und das Lasersignal zu entfernen. Das Hintergrundsignal wurde mit dem Druck des Mittelkanals aufgenommen, z. B. null Pfund pro Quadratzoll.

Die Mischzeit kann gemessen werden, indem eine schnelle Reaktion gemessen wird, die viel schneller ist als das Mischen, wie z. B. die Tryptophan-Fluoreszenzlöschung durch Kaliumiodid. Da der Strahl kleiner ist als die optische Auflösung des Mikroskops, kommt es zu einem großen Intensitätsabfall im Mischbereich. Wenn sich der Strahl bildet, kann diese Reaktion des Instruments durch eine Kontrollmessung entfernt werden, bei der sich die Lösungsbedingungen nicht ändern.

In dieser Abbildung ist das Verhältnis von Misch- und Nicht-Mischexperimenten der N-Acetyl-Tryptophan-Amid-Fluoreszenz dargestellt. Die Linie zeigt die vorhergesagte Konzentration von Kaliumiodid aus multiphysikalischen Konsolenmodellierungen und Simulationen. Die Mischzeit, gemessen in der Zeit, in der die Konzentration um 80 % abnimmt, beträgt acht Mikrosekunden.

Dieses Diagramm zeigt die Bundänderungen im Protein A CBP nach Verdünnung der Denaturierung von sechs molaren auf 0,06 molaren. Für diese Daten ist kein Kontrollexperiment erforderlich. Da der Bund bereits ein Verhältnis ist und die Ansprache des Instruments bereits entfernt ist, stellt der schnelle Sprung nahe T gleich Null eine schnelle Änderung des Bundsignals innerhalb der Mischzeit dar.

Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Proteinfaltung, um die frühesten Schritte bei der Bildung der Proteinstruktur zu erforschen.