Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, auf einem Chip mehrschichtige mikrofluidische Kanäle mit kreisförmigem Querschnitt und endothelialen Lebendzellen zu entwickeln, die die 3D-Geometrie in vivo vorkommender Mikrogefäße nachahmen und unter kontrolliertem kontinuierlichem Perfusionsfluss betrieben werden. Dies wird erreicht, indem zunächst lithografisch mittels eines positiven, nachfließbaren Fotolacks eine Negativform (Master-Matrize) mit einem mikrofluidischen Netzwerk von halbkreisförmigem Querschnitt hergestellt wird. Im zweiten Schritt werden mit Hilfe dieser Negativform zwei Polydimethylsiloxan-Mikrokanäle repliziert, ausgerichtet und miteinander verbunden, um ein zylindrisches Mikrokanal-Netzwerk zu erzeugen.

Anschließend werden primäre humane Nabelvenenendothelzellen in das Mikrokanal-Netzwerk eingesetzt, bevor die Zellen unter kontrollierten Bedingungen mit kontinuierlicher Medium-Perfusion über einen Zeitraum von vier Tagen bis zwei Wochen kultiviert werden. Letztendlich bildet sich entlang der inneren Oberfläche des Mikrokanal-Netzwerks eine konfluente Zellmonoschicht, die unter dem Mikroskop durch Membran- und Kernfärbung nachgewiesen wird. Die Berechnung funktioneller Mikrogefäße könnte eine Plattform für die Untersuchung komplexer vaskulärer Phänomene bieten. Herkömmliche Einzel-Mikrogefäss-Assays wie Angiogenese-Zell-Migrations-Assays, Angiogenese-Bildungs-Assays und Retorten- und mikrotubuläre Ring-Assays sind jedoch begrenzt, was die Rekonstruktion einzelner Mikrogefäße hinsichtlich dreidimensionaler Geometrie und kontinuierlicher Durchflusskontrolle betrifft.

Der Hauptvorteil unserer Technik, unserer bestehenden Mikrofertigungsmethode, liegt darin, dass sie konventionell ein mehrschichtiges mikrofluidisches Kanalnetzwerk herstellen kann, das die komplexen 3D-Geometrien in-vivo-bestehender Mikrogefäße mit abgerundeten Querschnitten nachahmt. Außerdem ermöglicht sie die Konstruktion mikrovaskulärer biomagnetischer Systeme, die annähernd langsamer sind und den Fluidstrom auf einem erforderlichen Niveau halten, sodass der Gesamtwiderstand der Kanäle gering ist und die Strömung gleichmäßiger durch das gesamte Netzwerk verläuft. Den Ablauf demonstriert ein Doktorand aus meinem Labor. Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung einer Photolack-Negativform, die Mikrokanäle mit Durchmessern zwischen 30 µm und 60 µm aufweist, wie im Textprotokoll beschrieben. Kurz gesagt: Überführen Sie den Reflow-Photolack 24 Stunden vor der Verwendung aus dem Kühlschrank bei 4 °C in den Reinraum und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur erwärmen.

Beginnen Sie damit, die Schicht aus positivem Reflow-Photoresist gemäß dem Verfahren im Textprotokoll mittels Spin-Beschichtung auf ein vorher gereinigtes Silizium-Substrat aufzutragen. Danach wird der Photoresist durch eine strukturierte Maske hindurch UV-Licht ausgesetzt, bevor die strukturierten Mikrokanäle entwickelt werden. Schließlich wird nach dem Reflow eine mikrokanalnetzwerk mit halbrundem Querschnitt erzeugt.

Wenn die Urform fertig ist, bereiten Sie die Polymethylsiloxan- oder PDMS-Lösung im Gewichtsverhältnis von 10 zu 1 (Grundmasse zu Härter) vor und mischen Sie gründlich mit einem planetarischen Zentrifugalmischer. Gießen Sie die PDMS-Lösung auf die umgeschmolzene Fotolack-Urform. Stellen Sie das gegossene PDMS 15 Minuten lang zum Entgasen in einen Trockenschrank.

Falls erforderlich, verbleibende Blasen mit Stickstoffgas entfernen. Das PDMS im Ofen drei Stunden lang bei einer Temperatur von 60 Grad Celsius aushärten lassen. Anschließend die ausgehärtete PDMS-Schicht von der Negativform ablösen.

Verwenden Sie einen geschärften Locher, um Einlass- und Auslassöffnungen zu erzeugen, indem Sie Löcher in das Kanalnetz stanzen. Reinigen Sie die Oberfläche des PDMS mit Stickstoffgas. Behandeln Sie zwei PDMS-Schichten innerhalb eines Plasma-Reinigers 30 Sekunden lang mit Sauerstoff-Plasma bei einem Betriebsdruck von 45 milat und einer Sauerstoffströmungsrate von 3,5 Kubikfuß pro Minute.

Danach die Oberflächen des PDMS manuell unter einem optischen Mikroskop ausrichten. Bei Bedarf einen Wassertropfen verwenden, um die Ausrichtung besser zu kontrollieren. Abschließend das Gerät 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius im Ofen aushärten, um eine dauerhafte Verbindung zu erzielen.

Primäre humane Nabelvenen-Endothelzellen oder VE in Kulturmedium mit L-Glutamin, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum. Behandeln Sie das Gerät fünf Minuten lang mit Sauerstoff-Plasma bei einem Betriebsdruck von 45 Millitorr und einer Sauerstoffströmungsrate von 3,5 Kubikfuß pro Minute. Anschließend beladen Sie das Gerät mit entionisiertem Wasser und behandeln es zur Sterilisation acht Stunden lang mit UV-Licht in einer laminaren Sicherheitswerkbank.

Ein Tag bevor die Zellen bereit sind, das Gerät mit einer x Phosphat gepufferter Salzlösung oder PBS waschen und anschließend mit Fibronectin beschichten. Über Nacht im Kühlschrank bei vier Grad Celsius inkubieren. Sobald die Zellen konfluent sind, werden sie gewonnen, indem man sie zunächst mit Hanks gepufferter Salzlösung spült und anschließend mit Trypsin-EDTA nach Zugabe von Trypsin behandelt.

Die Zellen zwei bis sechs Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach Abschluss der Trypsinierung wird das Trypsin-EDTA mit einer Trypsin-Neutralisierungslösung neutralisiert. Anschließend die Zellen zählen und vor der Resuspension zentrifugieren.

In Kulturmedium mit 8 % Dextrin suspendieren, da Dextrin verwendet wird, um die Viskosität des Mediums zu erhöhen und so ein besseres Ansetzen und Anhaften der Zellen nach der FI enc ENC-Beschichtung zu unterstützen. Das Gerät mit einem Mal XPBS waschen und anschließend mit Kulturmedium beladen, bevor es für 15 Minuten bei einer Temperatur von 37 °C inkubiert wird. Danach werden Zellen in Kulturmedium mit 8 % Dextrin in einer Konzentration von drei bis vier Millionen Zellen pro Milliliter in das Gerät gegeben.

Platzieren Sie einen 20 µL-Tropfen mit Zellen an einem Einlass des Geräts und kippen Sie es, um die Zellen in den mikrofluidischen Kanal einzubringen. Nach 15 bis 20 Minuten beginnen die Zellen, sich an den Seitenwänden der Kanäle anzulagern. Drehen Sie das Gerät alle 15 Minuten, um eine gleichmäßigere Verteilung der Zellen zu erzielen.

Falls erforderlich, kann eine zusätzliche Beladung durchgeführt werden. Nach fünf bis sechs Stunden statischer Kultur beginnen die angehefteten Zellen, sich vollständig auszubreiten. Richten Sie eine Langzeitperfusion mit einem ferngesteuerten Spritzenpumpensystem mit einer konstanten Flussrate von 10 Mikrolitern pro Stunde ein; die Perfusion kann auf eine höhere Flussrate eingestellt werden und kann zwischen vier Tagen und zwei Wochen andauern.

Wenn die Zellen im Gerät Konfluenz erreicht haben, spülen Sie das Gerät zunächst mit einem XPBS, um das Medium gründlich zu entfernen. Danach füllen Sie das Gerät mit verdünnter roter Färbung und inkubieren es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Spülen Sie es anschließend mit Kulturmedium, um die Färbung zu beenden.

Lange Inkubation des Farbstoffs kann zelluläre Toxizität und Ablösung der Zellen verursachen. Danach das Gerät mit blauem Farbstoff beladen, der mit 1× PBS verdünnt wurde, und fünf Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, bevor das Gerät gründlich mit 1× PBS gewaschen wird. Die Zellfärbung unter einem invertierten optischen Mikroskop untersuchen.

Wenn die Färbung gut ist, füllen Sie die Mikrokanäle mit Fixiermedium, tauchen Sie das Gerät in Fixiermedium ein und bedecken Sie es vollständig mit Aluminiumfolie. Bewahren Sie das Gerät im Kühlschrank bei einer Temperatur von vier Grad Celsius auf, um Austrocknung zu verhindern. Das fixierte Gerät ist nun bereit für die konfokale Bildgebung, die mittels eines Laser-Scanning-Konfokalmikroskops, der Rasterelektronenmikroskopie und der optischen Mikroskopie durchgeführt werden kann. Wurden zur Charakterisierung des Reflow-Photoresists und des replizierten PDMS-Kanals vor und nach dem Reflow-Prozess verwendet.

Die geometrischen Merkmale des PDMS-Mikrokanalnetzwerks wurden charakterisiert und hier dargestellt. Kreisförmige Querschnitte der PDMS-Formen zeigen die Kanalabmessungen auf jeder Verzweigungsstufe. Die Ergebnisse zeigen, dass die Photoresist-Umfließtechnik eine bequemere Herstellung von mehrstufigen, verzweigten Kanalnetzwerken ermöglicht und die Konzeption biomimetischer Mikrogefäße erlaubt, die annähernd dem hier gezeigten Murray’schen Gesetz folgen. Abgebildet sind Mikroskopieaufnahmen mit fluoreszierendem Zellmembranfarbstoff in Rot und Zellkernfarbstoff in Blau.

Die kreisförmigen Querschnittsansichten zeigten, dass das VE die innere Oberfläche eines zylindrischen Mikrokanalnetzwerks in verschiedenen Verzweigungsregionen auskleidete. Aufgrund der komplexen Geometrien der in-vivo-Mikrogefäße ist eine Echtzeitüberwachung dieser kleinen Gefäße schwierig. Der entwickelte auf PDMS basierende Chip bietet gute optische Eigenschaften und ermöglicht eine hochwertige Echtzeit-Aufnahme der endothelialen Mikrokanäle, wie in diesem konfokalen Film der Zellauskleidung entlang des kreisförmigen Kanalnetzwerks gezeigt.

Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Herstellung der Reflow-Methode für diesen Massenmodus durchführt. Erstellen Sie ein mikrofluidisches Netzwerk aus PDMS mit kreisförmigem Querschnitt, laden Sie Endozellen in die Geräte ein und richten Sie eine langfristige Mediumszufuhr ein. Zusammenfassend bietet das entwickelte serielle endo-mikrofluidische Netzwerk auf einem Chip eine schnelle und reproduzierbare Methode zur Erzeugung von mikrofluidischen Kanälen mit kreisförmigem Querschnitt und mehreren Tiefen, das die Geometrie von in-vivo-Mikrogefäßen nachahmt.

Dieses Verfahren veranschaulicht die Nutzung einzigartiger Fähigkeiten fortschrittlicher Mikrofertigungs- und mikrofluidischer Technologien, um ein mikrovaskuläres Modell mit langfristiger kontinuierlicher Perfusionsteuerung sowie hochwertiger Echtzeit-Bildgebung zu erstellen, wobei die Anwendungsmöglichkeiten mikrofluidischer Kanäle in der Zellbiologie, Gewebeengineering und bioingenieurwissenschaftlichen Forschung stetig zunehmen. Die auf einem Chip angeordneten endoserialisierten mikrofluidischen Kanäle stellen einen aussagekräftigen Ansatz für die mikrovaskuläre Forschung dar.