Name: Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-21T19:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung endothelialisierter Mikrokanäle-on-a-Chip mit rundem Querschnitt für mikrovaskuläre Forschung. Diese Methode ermöglicht kontinuierliche Perfusion und Echtzeitbildgebung.

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Diese Forschung wurde teilweise durch National Science Foundation (NSF 1227359), WVU EPSCoR Programm von der National Science Foundation (EPS-1003907), WVU ADVANCE Büro von der National Science Foundation (1007978) gefördert und WVU PSCoR finanziert bzw. unterstützt. Die Arbeit wurde in microfabrication WVU Forschungseinrichtungen gemeinsam nutzen (Reinraum-Einrichtungen) und Mikrofluidik Integrative Zellforschung on Chip Laboratory (Mikrochip Lab) an der West Virginia University getan. Die konfokale Bildgebung wurde bei WVU Microscope Imaging Facility getan.

1. Photolithographie Herstellung von Fotolack Meister Mold Das folgende Protokoll zeigt den Prozess, um die Mikrokanäle mit Durchmessern zwischen 30-60 um herzustellen. Um einen Mikrokanal mit einem kleineren Durchmesser (weniger als 30 Mikrometer), einem Dreh-Beschichtung aus Photoresist zu erhalten benötigt. <ol><li> Übertragen Sie die Reflow Fotolack aus dem Kühlschrank bei 4 ° C bis zur Reinraum 24 Stunden vor dem Gebrauch und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur erwärmen. </li><li> Reinigen eines Silizium-Wafers und backen es für eine Stunde bei 150 ° C, damit sie austrocknen. Die Dehydratisierung wird das Photoresist Haftung auf dem Silizium-Substrat zu unterstützen. </li><li> Spin-Beschichtung der ersten Schicht aus Photoresist mit folgender Rezeptur: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Schritt </td><td> Zeit (Sekunden) </td><td> Geschwindigkeit (rpm) </td><td> Beschleunigung </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 &lt;/ Td&gt; <td> 300 </td><td> höchste </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 300 </td><td> höchste </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 60 </td><td> 600 </td><td> höchste </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td><td> 500 </td><td> höchste </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 600 </td><td> höchste </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Dann backen die Wafer auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 110 ° C für 90 sek. Nach dem Weichbacken die Dicke der Fotolack wird 20-30 um betragen. </li><li> Schleuderbeschichten einer zweiten Schicht aus Photoresist nach der gleichen Rezeptur für die erste Schicht verwendet wird. </li><li> Weichbacken der Wafer erneut, indem Sie es auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 110 ° C für 90 sec. Nach dieser Weichbacken die Dicke der Fotolack wird 40-60 um betragen. </li><li> Generieren positive Urmodelle indem die PHOTOResist mit UV-Licht mit einer Belichtungsdosis von 14.500 mJ / cm 2 durch eine Filmmaske. </li><li> Verdünnen Sie die Entwickler mit deionisiertem (DI) Wasser (1:2 (v / v)). Spülen Sie den Wafer wiederholt in der Lösung, bis das Muster voll entwickelt ist. Dann waschen Sie den Wafer mit DI-Wasser und trocknen Sie sie mit Hilfe von Stickstoff. </li><li> Reflow: Platz der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Temperatur von 120 ° C für 4 min und Deckel mit einem Glas Petrischale zur Verdampfung des Lösungsmittels zu verhindern. Entfernen Sie die Wafer von der Kochstelle und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen. Die Photoresistdicke nach dem Reflow werden 50-60 um betragen. </li></ol> 2. Softlithographie Herstellung von PDMS Microchannel Netzwerk <ol><li> Bereiten Polydimethylsiloxan (PDMS)-Lösung in einem Gewichtsverhältnis von 10:1 (Basis: Härter) und mischen Sie es gründlich mit einem planetarischen Zentrifugalmischers. </li><li> Wandelt den PDMS-Lösung auf dem Reflow Fotolack Urform. Legen Sie die gegossene PDMS in einem Exsikkator für 15 min zur Entgasung. Verwenden Stickstoffgas, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen, wenn nötig. </li><li> Backen des PDMS in einem Ofen bei einer Temperatur von 60 ° C für 3 Stunden, um es zu härten. Entfernen Sie dann die gehärteten PDMS Schicht von der Urform. </li><li> Verwenden Sie eine geschärfte Puncher zu Einlass / Auslass Löcher durch Stanzen von Löchern in der Channel-Netzwerk zu erstellen. Reinigen Sie die Oberfläche des PDMS mit Hilfe von Stickstoff. </li><li> Behandle zwei PDMS-Schichten mit Sauerstoff-Plasma für 30 sec in einem Plasma-Reiniger bei einem Betriebsdruck von 4,5 x 10 -2 Torr und einem Sauerstoff-Fluss von 3,5 m 3 / min. Dann Ausrichtung der Oberflächen der PDMS manuell unter einem optischen Mikroskop. Verwenden Sie einen Tropfen Wasser, wenn nötig für eine bessere Kontrolle der Ausrichtung. </li><li> Backen Sie das Gerät in einem Ofen bei 60 ° C für 30 min, um eine dauerhafte Verklebung zu erreichen. </li></ol> 3. HUVEC Kultur und Seeding in den Chip <ol><li> Kultur die HUVECs mit Kulturmedium mit L-Glutamin mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt. Für the Experiment Durchgänge zwischen 2 und 5 verwendet wurden. </li><li> Sobald die HUVECs konfluent sind, zählen die Zellen und ernten sie nach ersten Spülen der Zellen mit HEPES gepufferte Salzlösung (HEPES-BSS), und dann behandeln die Zellen mit Trypsin / EDTA und Inkubation für 2-6 min bei 37 ° C Nachdem die Trypsinierung abgeschlossen ist, neutralisieren die Trypsin / EDTA mit Trypsin Neutralisationslösung. Zentrifuge und die Zellen in Kulturmedium mit 8% Dextran, sie zu sammeln. Dextran wurde verwendet, um die mittlere Viskosität zu erhöhen, um in besser Zellaussaat und Anhänglichkeit zu unterstützen. </li><li> Behandeln Sie das Gerät mit Sauerstoff-Plasma für 5 min mit einem Betriebsdruck von 4,5 x 10 -2 Torr und einem Sauerstoff-Fluss von 3,5 m 3 / min. Dann laden Sie das Gerät mit DI-Wasser und Behandlung mit UV-Licht für 8 h in einer laminaren Biosicherheit Haube für die Sterilisation. </li><li> Eines Tages, bevor die Zellen fertig sind, waschen Sie das Gerät mit 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) anschließend mit Fibronektin (100 ug / ml, dilausgeschüttet mit 1x PBS) und Inkubation im Kühlschrank bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Nach dem Fibronectinbeschichtung, waschen Sie das Gerät mit 1x PBS dann mit Kulturmedium zu laden. Inkubieren der Vorrichtung bei einer Temperatur von 37 ° C für 15 min. </li><li> Legen Sie die HUVEC-Zellen in 8% Dextran Kulturmedium mit einer Zellkonzentration von 3-4 x 10 6 Zellen / ml. Legen Sie eine 20 ul Tröpfchen von Zellen an einem Einlass des Geräts und kippen, um die Zellen in den mikrofluidischen Kanal einzuführen. Nach 15-20 min werden die Zellen beginnen zu den Seitenwänden der Kanäle zu befestigen. Drehen Sie das Gerät alle 15 Minuten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu schaffen. Falls erforderlich, kann eine zusätzliche Belastung durchgeführt werden. </li></ol> 4. Langfristige Perfusion-Setup Nach 5-6 h statischer Kultur, werden die angeschlossenen HUVECs beginnen, voll ausbreiten. Richten Sie Perfusion mit einem ferngesteuerten Spritzenpumpensystem mit einem stetigen Strom von 10 ul / hr. Perfusion kann f eingestellt werdenoder eine höhere Strömungsgeschwindigkeit und kann für einen Zeitraum von 4 Tagen auf 2 Wochen. 5. Zellfärbung und Mikroskop Charakterisierung <ol><li> Wenn die Zellen Konfluenz erreichen im Inneren des Gerätes, erstens, waschen Sie das Gerät mit 1x PBS gründlich zu entfernen das Medium. Dann laden Sie das Gerät mit roter Farbstoff mit Verdünnungsmittel (4 ul-1 ml) verdünnt. Legen Sie den Farbstoff ähnlich der Zelle Ladevorgang. Inkubieren der Vorrichtung in der Dunkelheit für 5 min bei Raumtemperatur und anschließend Waschen der Vorrichtung mit Kulturmedium, um die Färbung zu beenden. Lange Inkubationszeit des Farbstoffes kann zelluläre Toxizität und disadhesion. </li><li> Legen Sie das Gerät mit blauer Farbstoff mit 1x PBS (2 Tropfen pro ml) verdünnt. Im Dunkeln für 5 min bei Raumtemperatur und anschließend gründlich mit 1x PBS Gerät. </li><li> Untersuchen Sie die Zellfärbung unter einem inversen Lichtmikroskop. Wenn die Färbung war gut, laden die Mikrokanäle mit Befestigung Medium (3,5% Paraformaldehyd mit 1x PBS verdünnt), dann tauchendas Gerät bei der Festsetzung der mittleren und vollständig bedecken Sie es mit Alufolie. Lagern Sie das Gerät im Kühlschrank bei einer Temperatur von 4 ° C, um das Gerät vor dem Austrocknen und Ausbleichen zu verhindern. Die feste Vorrichtung ist nun bereit für die konfokale Abbildung, die von einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt werden kann. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

<html> 1. Meister Formenbau Einer der Gestaltung und Leitprinzipien für vaskuläre Morphometrie als Murray Gesetz 16, was bedeutet, dass die Verteilung der Gefäßdurchmesser im gesamten Netzwerk von Mindestanforderungen an die Gesamtenergieeffizienz Gegenleistung regierten Staaten bekannt. Weiter heißt es, dass der Würfel der Durchmesser eines Elternteils Gefäß an einer Verzweigung der Summe der Potenzen der Durchmesser der Tochter Schiffe gleich ( <img alt="Gleichung 1" fo:content-widt...

Mikrogefäßen als Teil des Kreislaufsystems, vermitteln die Wechselwirkungen zwischen Blut und Gewebe, unterstützt Stoffwechselaktivitäten, definieren Gewebe Mikroumgebung und spielen eine entscheidende Rolle in vielen Gesundheits-und pathologischen Bedingungen. Zusammenfassung der funktionellen microvessels in vitro konnte eine Plattform für die Untersuchung von komplexen vaskulären Erscheinungen bereitzustellen. Jedoch sind herkömmliche in vitro Assays microvessel wie Endothelzellmigration Assays Bildung endothelialer Gefäße Assays und Ratte und Maus Aortenring Assays nicht die in vivo microvessels neu in Bezug auf dreidimensionale (3D)-Geometrie und kontinuierlichen Steuerung 1-8. Studium der Mikrogefäßen anhand von Tiermodellen und in-vivo-Untersuchungen, wie Hornhaut-Angiogenese-Assay, chick Chorioallantoismembran Angiogenese Assay und Matrigel-Plug-Assay sind zeitaufwendiger, hohe Kosten, herausfordernde bezüglich Beobachtung und Quantifizierung undethische Fragen aufwerfen, 1, 9-13. Advances in Mikrotechnik und Mikrofluidik-Chip-Technologien haben eine Vielzahl von Einblicken in biomedizinischen Wissenschaften aktiviert, während beschneidet die hohen experimentellen Kosten und Komplexitäten mit Tieren und in vivo-Studien 14, wie einfach und streng kontrolliert biologischen Bedingungen und dynamischen Umgebungen Fluidik, die nicht hätten zugeordnet war mit herkömmlichen makroskopischen Techniken möglich. Hier präsentieren wir einen Ansatz für eine endothelialisierten konstruieren Mikrokanäle-on-a-Chip, der die 3D-Geometrie in vivo Mikrogefäßen imitiert und läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss durch die einzigartige Kombination von Photolithographie reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie, und Mikrofluidik.

<table><tbody><tr><td>Reagenz/Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reflow Photoresist</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZP4620</td><td></td></tr> Entwickler <tr><td></td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ 400K</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Kulturmedium</td><td>Invitrogen</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>NacBlue Nuclei Färbung</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>PKH Roter Farbstoff</td><td>Sigma</td><td>MINI26 und PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>HEPES gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Neutralisationslösung</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>PDMS-Härtungsmittel</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Primäre Endothelzellen der menschlichen Nabelvene</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>Verdünnungsmittel C</td><td>Sigma</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Invitrogen, Molekulare Sonden</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td></td><td>Sigma 95771</td><td></td></tr><tr><td>3,5 % Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td>WS-400BZ-6NPP/ LITE</td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td>BelArt Produkte</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Inversmikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpensystem</td><td>Harvard Apparatur</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Biosicherheitshaube</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Serie A2</td><td></td></tr><tr><td>Planeten-Zentrifugalmischer</td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-246-516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Invertoskop 40C</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Barnstead/Thermolyne Cimarec</td><td>SP131635</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laserscanning-Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr></tbody></table>

verfahren für die entwicklung von multi-tiefe rundem querschnitt endothelialisierten mikrokanäle-on-a-chip

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Die Anstrengungen haben sich auf die Entwicklung in-vitro-Assays zur Untersuchung der Mikrogefäßen konzentriert, weil in vivo Tierstudien mehr zeitaufwendig, teuer und Beobachtung und Quantifizierung sind sehr anspruchsvoll. Jedoch haben herkömmliche in vitro Assays microvessel Einschränkungen bei der Darstellung in vivo microvessels bezüglich dreidimensionale (3D)-Geometrie und eine kontinuierliche Strömung. Mit einer Kombination von Photolithographie reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik, haben wir eine Multi-Tiefe kreisförmigen Querschnitt endothelialisierten entwickelt Mikrokanäle-on-a-Chip, der die 3D-Geometrie in vivo Mikrogefäßen imitiert und läuft unter kontrollierten kontinuierliche Perfusion fließen. Eine positive reflowable Photoresist wurde verwendet, um eine Master-Form mit einem halbkreisförmigen Querschnitt Mikrokanal Netzwerk herzustellen. Nach der Ausrichtung und Verbindung der beiden Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrokanäle ersicated von der Urform wurde ein zylindrischer Mikrokanal Netzwerk erstellt. Die Durchmesser der Mikrokanäle kann gut beherrscht. Darüber hinaus zeigte primäre humane Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) innerhalb des Chips ausgesät, dass die Zellen mit der Innenfläche der Mikrokanäle ausgekleidet unter kontrollierten Perfusion dauernd für einen Zeitraum von 4 Tagen bis 2 Wochen.

Unser Ansatz für die Multi-Tiefe Mikrokanalstruktur Netzwerk herzustellen ahmt die komplexen 3D-Geometrien in vivo Mikrogefäßen, in denen die Mikrokanäle haben abgerundete Querschnitte 15. Darüber hinaus sind die Durchmesser der übergeordneten Verzweigung Kanäle und die Kanäle Tochter etwa gehorchen Murray Gesetz zur Aufrechterhaltung der Fluidströmung an einen erforderlichen Pegel, so dass der gesamte Kanal ist niedrig und Strömungsgeschwindigkeiten gleichmäßiger im gesamten Netzwerk 16-18.</su...

A Mikrokanälen-on-a-Chip-Plattform wurde durch die Kombination von photolithographischen reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik entwickelt. Die endothelialisierten Mikrokanäle Plattform imitiert die dreidimensionale (3D) Geometrie in vivo Mikrogefäßen läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss, ermöglicht qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung und kann für mikrovaskuläre Forschung angewendet werden.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, auf einem Chip mehrschichtige mikrofluidische Kanäle mit kreisförmigem Querschnitt und endothelialen Lebendzellen zu entwickeln, die die 3D-Geometrie in vivo vorkommender Mikrogefäße nachahmen und unter kontrolliertem kontinuierlichem Perfusionsfluss betrieben werden. Dies wird erreicht, indem zunächst lithografisch mittels eines positiven, nachfließbaren Fotolacks eine Negativform (Master-Matrize) mit einem mikrofluidischen Netzwerk von halbkreisförmigem Querschnitt hergestellt wird. Im zweiten Schritt werden mit Hilfe dieser Negativform zwei Polydimethylsiloxan-Mikrokanäle repliziert, ausgerichtet und miteinander verbunden, um ein zylindrisches Mikrokanal-Netzwerk zu erzeugen.Anschließend werden primäre humane Nabelvenenendothelzellen in das Mikrokanal-Netzwerk eingesetzt, bevor die Zellen unter kontrollierten Bedingungen mit kontinuierlicher Medium-Perfusion über einen Zeitraum von vier Tagen bis zwei Wochen kultiviert werden. Letztendlich bildet sich entlang der inneren Oberfläche des Mikrokanal-Netzwerks eine konfluente Zellmonoschicht, die unter dem Mikroskop durch Membran- und Kernfärbung nachgewiesen wird. Die Berechnu

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben eine Chip-basierte Plattform für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen in Mikro-Bioreaktoren. Ein Chip kann bis zu 10 Mio. Zellen, die unter genau definierten Bedingungen im Hinblick auf die Strömung, Sauerstoffspannung etc. in einem sterilen, geschlossenen Kreislauf kultiviert werden können.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

Wir präsentieren zwei Prozesse für die Mikrofabrikation von porösen Polymer-Chips für dreidimensionale Zellkultivierung. Die erste ist Heißprägen mit einem Lösemitteldampf Schweißverfahren kombiniert. Die zweite nutzt ein neu entwickeltes microthermoforming Prozess mit Ionen-Track-Technologie führt zu einer wesentlichen Vereinfachung der Herstellung kombiniert.

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Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.

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Skalierbare Fertigung von dehnbar, Dual Channel, mikrofluidischen Orgel Chips

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Erfahren Sie die Herstellung endothelialisierter Mikrokanäle-on-a-Chip mit rundem Querschnitt für mikrovaskuläre Forschung. Diese Methode ermöglicht kontinuierliche Perfusion und Echtzeitbildgebung.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

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