Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen mehrtiefen, zirkulären Querschnitt mit Endothelleben auf einem Chip zu entwickeln, der die 3D-Geometrie von in vivo Mikrogefäßen nachahmt und unter kontrollierter kontinuierlicher Profusionsströmung läuft. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Urform mit einem halbkreisförmigen Querschnitts-Mikrokanalnetzwerk unter Verwendung von positiv reflowfähigem Fotolack fotolithographisch hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, mit der Master-Form zwei Polydimethylsoan-Mikrokanäle zu replizieren, auszurichten und zu einem zylindrischen Mikrokanalnetzwerk zu verbinden.

Als nächstes werden die primären Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene innerhalb des Mikrokanalnetzwerks platziert, bevor die Zellen unter kontrollierten Bedingungen mit kontinuierlicher mittlerer Perfusion für einen Zeitraum zwischen vier Tagen und zwei Wochen kultiviert werden. Letztendlich wird eine Konfluenzzell-Monoschicht entwickelt, die durch das Stehen der Membran und die unter dem Mikroskop stehenden Kerne angezeigt wird. Berechnung funktioneller Mikrogefäße, in denen eine Plattform für die Untersuchung komplexer vaskulärer Phänomene bereitgestellt werden könnte. Herkömmliche Assays für einzelne Mikrogefäße, wie z. B. Anso-Zellmigrationsassays und So-Two-Formation-Assays sowie die Assays für den rechten und den Mos tic-Ring, sind jedoch darauf beschränkt, einzelne Mikrogefäße in Bezug auf die dreidimensionale Geometrie und die kontinuierliche Flusskontrolle nachzubilden.

Der Hauptvorteil unserer Techniken, unserer bestehenden Mikrofabrikationsmethode, besteht darin, dass sie konventionell ein mikrofluidisches Kanalnetzwerk mit mehreren Tiefen herstellen kann, das die komplexen 3D-Geometrien von In-vivo-Mikrogefäßen mit abgerundeten Querschnitten nachahmt. Es ermöglicht auch die Entwicklung mikrovaskulärer biomagnetischer Systeme, die annähernd langsamer gehorchen und den Flüssigkeitsfluss auf einem erforderlichen Niveau halten, so dass der Gesamtkanalwiderstand gering ist und der Fluss, den wir verloren haben, im gesamten Netzwerk gleichmäßiger ist. Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung einer Fotolack-Urform, die aus Mikrokanälen mit Durchmessern zwischen 30 Mikrometern und 60 Mikrometern besteht, wie im Textprotokoll beschrieben, dem kurzzeitigen Überführen des Reflow-Fotolacks aus dem Kühlschrank bei vier Grad Celsius in den Reinraum 24 Stunden vor der Verwendung und dem Erwärmen auf Raumtemperatur.

Beginnen Sie mit der Spin-Beschichtung der Positiv-Reflow-Fotolackschicht auf einem vorgereinigten Silikonsubstrat, indem Sie dem Verfahren im Textprotokoll folgen. Setzen Sie dann den Fotolack durch eine gemusterte Maske UV-Licht aus, bevor Sie die gemusterten Mikrokanäle entwickeln. Erstellen Sie schließlich nach dem Reflow ein Mikrokanalnetzwerk mit halbkreisförmigem Querschnitt.

Sobald die Urform fertig ist, bereiten Sie Polymethylsoan oder PDMS-Lösung im Gewichtsverhältnis von 10 zu einer Base zum Härter vor und mischen Sie es gründlich mit einem Planetenzentrifugalmischer. Gießen Sie die PDMS-Lösung auf die Reflow-Fotolack-Urform. Legen Sie das gegossene PDMS für 15 Minuten in ein Trockenmittel, um es zu entgasen.

Verwenden Sie bei Bedarf Stickstoffgas, um verbleibende Blasen zu entfernen. Backen Sie das PDMS im Ofen bei einer Temperatur von 60 Grad Celsius drei Stunden lang, damit es aushärten kann. Entfernen Sie dann die ausgehärtete PDMS-Schicht aus der Urform.

Verwenden Sie einen geschärften Locher, um Ein- und Auslasslöcher zu erzeugen, indem Sie Löcher in das Kanalnetz stanzen. Reinigen Sie die Oberfläche des PDMS mit Stickstoffgas. Behandeln Sie zwei PDMS-Schichten 30 Sekunden lang mit Sauerstoffplasma in einem Plasmareiniger bei einem Betriebsdruck von 45 milato und einer Sauerstoffdurchflussrate von 3,5 Kubikfuß pro Minute.

Richten Sie dann die Oberflächen des PDMS manuell unter einem optischen Mikroskop aus. Verwenden Sie bei Bedarf einen Tropfen Wasser, um die Ausrichtung besser zu kontrollieren. Zum Schluss backen Sie das Gerät in einem Ofen bei 60 Grad Celsius für 30 Minuten, um eine dauerhafte Bindungskultur zu erreichen.

Primäre Endothelzellen oder VE der menschlichen Nabelschnurvene in Kulturmedium mit L-Glutamin, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum. Behandeln Sie das Gerät fünf Minuten lang mit Sauerstoffplasma bei einem Betriebsdruck von 45 milit und einem Sauerstofffluss von 3,5 Kubikfuß pro Minute. Beladen Sie dann das Gerät mit deionisiertem Wasser und behandeln Sie es acht Stunden lang mit UV-Licht in einer laminaren Biosicherheitshaube zur Sterilisation.

Einen Tag bevor die Zellen fertig sind, waschen Sie das Gerät mit einer x phosphatgepufferten Kochsalzlösung oder PBS und beschichten Sie es dann mit Fibronektin. Im Kühlschrank bei vier Grad Celsius über Nacht inkubieren. Sobald die Zellen zusammenfließen, ernten Sie sie, indem Sie die Zellen zuerst mit gepufferter Kochsalzlösung spülen und dann die Zellen nach Zugabe von Trypsin mit Trypsin-EDTA behandeln.

Inkubieren Sie die Zellen für zwei bis sechs Minuten bei 37 Grad Celsius. Nachdem die Trypsinisierung abgeschlossen ist, neutralisieren Sie die Tripsin EDTA mit Tripsin Neutralisationslösung. Zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie dann, bevor Sie sie wiederbeleben.

Aufhängung in Kulturmedium mit 8 % Dextrin Dextrin wird verwendet, um die Viskosität des Mediums zu erhöhen, um eine bessere Zellsitzung und -bindung nach der FI enc ENC-Beschichtung zu unterstützen. Waschen Sie das Gerät mit einem XPBS, beladen Sie es dann mit Nährmedium, bevor Sie es 15 Minuten lang bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius inkubieren. Als nächstes werden Zellen in 8%igem Dextrin-Kulturmedium mit einer Konzentration von drei bis 4 Millionen Zellen pro Milliliter in das Gerät geladen.

Platzieren Sie ein 20-Mikroliter-Tröpfchen Zellen an einem Einlass des Geräts und kippen Sie es, um die Zellen in den mikrofluidischen Kanal einzuführen. Nach 15 bis 20 Minuten beginnen die Zellen, sich an den Seitenwänden der Kanäle zu befestigen. Drehen Sie das Gerät alle 15 Minuten, um eine gleichmäßigere Verteilung der Zellen zu erzielen.

Bei Bedarf kann eine zusätzliche Beladung durchgeführt werden. Nach fünf bis sechs Stunden statischer Kultur beginnen sich die anhaftenden Zellen vollständig auszubreiten. Bei der Einrichtung einer Langzeitperfusion mit einem ferngesteuerten Spritzenpumpensystem mit einem stetigen Fluss von 10 Mikrolitern pro Stunde kann die Perfusion für eine höhere Flussrate angepasst werden und kann über einen Zeitraum zwischen vier Tagen und zwei Wochen andauern.

Wenn die Zellen den Konfluenz im Inneren des Geräts erreichen, waschen Sie das Gerät zuerst mit einem XPBS, um das Medium gründlich zu entfernen. Beladen Sie dann das Gerät mit verdünntem rotem Farbstoff, nachdem das Gerät fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert wurde. Waschen Sie es mit Nährboden, um die Fleckenbildung zu stoppen.

Eine lange Inkubation des Farbstoffs kann zu zellulärer Toxizität und Deadhäsion führen. Beladen Sie dann das Gerät mit blauem Farbstoff, verdünnt mit einem XPBS, inkubieren Sie es fünf Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, bevor Sie das Gerät gründlich mit einem XPBS waschen. Untersuchen Sie die Zellfärbung unter einem inversen optischen Mikroskop.

Wenn die Fleckenbildung gut ist, beladen Sie die Mikrokanäle mit Fixiermittel, tauchen Sie das Gerät in Fixiermedium und decken Sie es vollständig mit Aluminiumfolie ab. Lagern Sie das Gerät bei einer Temperatur von vier Grad Celsius im Kühlschrank, um ein Austrocknen und Ausbleichen des festsitzenden Geräts zu verhindern. Das festsitzende Gerät ist nun bereit für die konfokale Bildgebung, die mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, einer Rasterelektronenmikroskopie und einer optischen Mikroskopie durchgeführt werden kann. Wurden verwendet, um den Reflow-Fotolack und den replizierten PDMS-Kanal vor und nach dem Reflow-Fortschritt zu charakterisieren.

Die geometrischen Merkmale des PDMS Microchannel-Netzwerks wurden hier charakterisiert und dargestellt. Kreisförmige Querschnitte von PDMS-Formen zeigen die Kanalabmessungen auf jeder Verzweigungsebene. Die Ergebnisse zeigen, dass die Photoresist-Reflow-Technik in einem durch Photoresist-Reflow-Techniken bequemeren Ansatz verzweigte Kanalnetzwerke erzeugen kann und das Design der mikrovaskulären biomimetischen Systeme ermöglicht, die in etwa dem Murrayschen Gesetz gehorchen. Hier sind Mikroskopiebilder mit fluoreszierendem Zellmembranfarbstoff in Rot und Zellkernfarbstoff in Blau gezeigt.

Die kreisförmigen Querschnittsansichten zeigten, dass der VE die Innenfläche eines zylindrischen Mikrokanalnetzwerks an verschiedenen Verzweigungsbereichen auskleidete. Aufgrund der komplexen Geometrien von in vivo Mikrogefäßen ist die Echtzeitüberwachung dieser kleinen Gefäße schwierig. Der entwickelte P DM S-basierte Chip bietet gute optische Eigenschaften und ermöglicht eine qualitativ hochwertige und Echtzeit-Abbildung der endothelialen Mikrokanäle, wie in diesem konfokalen Film der Zellauskleidung entlang des zirkulären Kanalnetzwerks gezeigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Reflow für diesen Massenmodus herstellen. Erstellen Sie ein PDMS-Mikrokanalnetzwerk mit kreisförmigem Querschnitt, laden Sie die Endozellenzellen in die Geräte und richten Sie eine langfristige Medienfülle ein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die entwickelten endoserialisierten Mikrokanäle auf einem Chip einen schnellen und reproduzierbaren Ansatz zur Erstellung von Mikrokanalnetzwerken mit zirkulärem Querschnitt und mehreren Tiefen bieten, der die Geometrie von InVivo-Mikrogefäßen nachahmt.

Dieses Verfahren veranschaulicht die Nutzung einzigartiger Fähigkeiten in der fortschrittlichen Mikrofertigung und Mikrolebensmitteltechnologien, um ein mikrovaskuläres Modell mit einer langfristigen kontinuierlichen Perfusionskontrolle sowie hoher Qualität und Echtzeit-Bildgebungsfähigkeit mit dem zunehmenden Nutzen von Mikronahrungskanälen für Zellbiologie-, Tissue-Engineering- und Bioengineering-Anwendungen zu schaffen. Die endoserialisierten Mikrokanäle auf einem Chip sind ein potenzieller Aufsatz für die mikrovaskuläre Forschung.