Anpassung der Mikroelektrode-Array-Technologie für das Studium der Anästhesie-induzierte Neurotoxizität im Gehirn intakt Ferkel

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, eine neuartige Anwendung der enzymbasierten Mikroelektrodenarray-Technologie zur Messung von Neurotransmittern in neonatalen Ferkeln zu nutzen. In diesem Beispiel wird die In-vivo-Glutamataktivität untersucht, um die anästhesieinduzierte Neurotoxizität zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Aktivität von Neurotransmittern in vivo mit außergewöhnlicher räumlicher und zeitlicher Auflösung in einem klinisch relevanten Tiermodell der anästhesieinduzierten Neurotoxizität messen kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Mechanismen der anästhesieinduzierten Neurotoxizität geben kann, kann sie auch auf andere pathologische Zustände wie pädiatrische Hirntraumata, Epilepsie und Schlaganfall angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Anwendung des Ferkelmodells Erfahrung und Übung in der Umsetzung erfordert. Darüber hinaus erfordert der Einsatz von Mikroelektrodenarrays spezielle Fähigkeiten.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die chirurgischen Schritte und die Platzierung der Mikroelektroden aufgrund ihrer heiklen Natur schwer zu erlernen sind. Verwenden Sie für dieses Experiment Ferkel während ihrer Spitzenwachstumszeit, wenn sie drei bis fünf Tage alt sind. Lassen Sie sie vor dem Experiment mindestens 24 Stunden lang akklimatisieren.

Geschultes Personal muss sich um die Ferkel kümmern. Sie sollten nach Belieben Zugang zu Nahrung, Decken und einigen Spielzeugen für Reize erhalten. Entfernen Sie mindestens drei Stunden vor der Anästhesie den Milchaustauscher aus dem Käfig, um sicherzustellen, dass der Magen des Ferkels leer ist.

Befolgen Sie die ARRIVE-Richtlinien, um potenzielle geschlechtsspezifische Störfaktoren zu eliminieren. Später wird das Ferkel an einem Anästhesiearbeitsplatz, der mit einem pädiatrischen Beatmungsgerät und entsprechenden Überwachungsgeräten ausgestattet ist, intubiert und mechanisch beatmet. Verabreichen Sie dann eine Sevofluran-Anästhesie bei 1 MAC für eine 3,5-stündige Anästhesie.

Verwenden Sie nun eine Zehenklemme, um eine ausreichende Anästhesietiefe zu bestätigen, und befestigen Sie das Ferkel dann an einem ferkelspezifischen stereotaktischen Rahmen, der über eine ausreichende Polsterung verfügt. Positionieren Sie die Zähne des Oberkiefers über dem Zahnsteg. Befestigen und ziehen Sie dann die beiden eindringenden Ohrstangen fest, wobei das Ferkel in der Mittellinie zentriert ist.

Setzen Sie die Ohrbügel fest genug ein, um das Knallen der Trommelfelle zu hören. Beginnen Sie mit einer Rocuronium-Aufsättigungsdosis und einer Infusion, um Bewegungen zu verhindern, während das Ferkel im Rahmen gesichert ist. Es ist wichtig, dass das Ferkel warm bleibt und dass seine Vitalfunktionen überwacht werden.

Verwenden Sie eine Wärmelampe und/oder eine Decke, um die normale Thermie aufrechtzuerhalten. Achten Sie darauf, dass die Wärmelampe nicht so nah ist, dass sie brennt. Wenn das Überleben der Ferkel erwünscht ist, treffen Sie zusätzliche Vorbereitungen, um das Operationsfeld steril zu halten.

Fahren Sie nun mit der Implantation des Mikroelektrodenarrays fort. Erstellen Sie zunächst einen vier bis sechs Zentimeter großen Schnitt in der Mittellinie entlang des Schädels und achten Sie darauf, dass der Schädel nicht mit dem Skalpell eingeritzt wird. Sobald der Schnitt gemacht ist, verwenden Sie eine sanfte Retraktion und eine stumpfe Dissektion, um die Kopfhaut vom Schädel abzuheben.

Schrubben Sie anschließend den Schädel vorsichtig mit einem Mullkissen, um jegliches Bindegewebe zu entfernen und die Nahtlinien freizulegen. Bestimmen Sie dann den vorgesehenen Ort für die Kraniotomie. Wenn der interessierende Bereich verdeckt bleibt, reflektieren Sie die Kopfhaut weiter.

Verwenden Sie nun einen chirurgischen Bohrer, um ein Kraniotomiefenster zu erstellen, das etwa 0,25 Quadratzentimeter über der interessierenden Struktur liegt. Achten Sie darauf, die Dura oder das darunter liegende Gehirn nicht zu verletzen. Verwenden Sie bei Bedarf feine chirurgische Instrumente, um die Dura über dem Hirngewebe zu entfernen.

Seien Sie äußerst vorsichtig, um das Gehirn nicht zu schädigen. In diesem Experiment wird ein zuvor beschriebenes enzymbasiertes Mikroelektrodenarray verwendet, das mit Glutamatoxidase vorbeschichtet und mit mPD galvanisiert ist. Die Mikroelektroden-Arrays haben einen 40 Millimeter dicken, starren Schaft, der speziell für den Einsatz bei Ferkeln entwickelt wurde.

Befestigen Sie den Metallarm am Mikromanipulator und positionieren Sie dann das Mikroelektrodenarray so vertikal wie möglich über dem Bregma. Senken Sie dann das Array vorsichtig so tief wie möglich ab, ohne die Oberfläche des Schädels zu berühren, und notieren Sie sich die Koordinaten des Bregmas. Verwenden Sie nun einen Ferkelhirnatlas, um die genauen stereotaktischen Koordinaten der interessierenden Struktur zu bestimmen, und positionieren Sie die Mikroelektrode entsprechend neu.

Platzieren Sie anschließend die Pseudo-Referenzelektrode unter der Kopfhaut und stellen Sie den Kontakt mit dem Tier sicher. Senken Sie nun das Mikroelektrodenarray langsam auf nahezu die entsprechende Tiefe in das Gehirn ab. Verwenden Sie für die letzten zwei Millimeter des Verfahrwegs einen hydraulischen Mikroantrieb, um das Array mit minimalem Gewebetrauma sanft in die gewünschte Struktur abzusenken.

Warten Sie nach dem Positionieren des Mikroelektrodenarrays 30 Minuten, damit die Elektroden den Ausgangswert erreichen können. Nehmen Sie dann etwa drei Stunden lang Messungen vor. Wenn das Ferkel den Versuch überleben soll, schließen Sie den Schnitt nach der Datenerfassung.

Wie beschrieben wurden in vivo Glutamat-Messungen in den Hippocampi von drei bis vier Tage alten Ferkeln unter Sevofluran-Anästhesie durchgeführt. Die Aufnahmesessions dauerten mehr als drei Stunden. Die Amperometrie-Messungen wurden bei 4 Hertz aufgezeichnet und mit Hilfe einer linearen Regression auf der Grundlage von Kalibrierungsparametern in die Konzentration umgerechnet.

Für jeden Zeitpunkt wurden die Signale von den beiden Glutamat-empfindlichen Stellen gemittelt, bevor das gemittelte Sentinel-Signal subtrahiert wurde, um ein korrigiertes Glutamatsignal zu erhalten. Die mittlere basale Glutamatkonzentration betrug etwa 4,6 Mikromol und blieb im Verlauf der Anästhesieexposition relativ stabil. Die transiente glutamaterge Aktivität wurde durch die Analyse von Peaks im Signal identifiziert, die nicht mit dem Sentinel-Signal korrelierten und ein Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als drei aufwiesen.

Insgesamt wurden 116 transiente Peaks über den Versuchszeitraum detektiert. Die Amplitude der resultierenden transienten Peaks wurde im Allgemeinen im Bereich von 1 Mikromol beobachtet. Um die Dauer jeder Transiente zu quantifizieren, wurde die Zeit ermittelt, die für jeden maximalen Spitzenwert benötigt wird, um 80 % abzuklingen, und es wurde festgestellt, dass sie etwa 4 bis 5,5 Sekunden beträgt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie methodisch und sorgfältig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, unbeabsichtigte Gewebeschäden, die die experimentellen Daten verwirren können, zu minimieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Messung anderer elektrochemischer Analyten, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.