Quantitative autoradiografische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in Vivo

Die Proteinsynthese ist ein kritischer biologischer Prozess für Zellen. Im Gehirn ist es für adaptive Veränderungen erforderlich. Die Messung der Raten der Proteinsynthese im intakten Gehirn erfordert sorgfältige methodische Überlegungen. Hier stellen wir die l-[1-¹⁴C]-eucinquantitative autoradiographische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in vivo vor.

Die Messung der regionalen Raten der Proteinsynthese des Gehirns kann die Reaktion des Gehirns auf langfristige Veränderungen, wie sie während der Entwicklung und Neuroplastizität auftreten, zurückverfolgen. Unsere Methode hat die Vorteile, dass Messungen vollständig quantitativ sind, und sie werden in der Wache verhalten Tier gemacht. Die quantitative autoradiografische Technik ermöglicht Messungen in allen Hirnregionen gleichzeitig.

Demonstriert wird das Verfahren von Anita Torossian, einer Stipendiatin nach dem Abitur in meinem Labor, und Tianjian Huang, unserem Tierchirurgen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung auf die Operation, wie im Textprotokoll beschrieben. Einmal auf der Operationsstufe, verwenden Sie chirurgische Schere, um einen einen Zentimeter Schnitt aus dem oberen medialen Teil des linken Oberschenkels rostral in Richtung der Mittellinie zu machen, die die Oberschenkelarterie und Vene enthüllt.

Lösende Haut mit chirurgischen Hauthaken über und auf beiden Seiten des Schnittes zurücknehmen. Sichern Sie die Hauthaken, indem Sie sie auf die Operationsstufe kleben. Tragen Sie steriles 0,9%Natriumchlorid auf den exponierten Bereich auf, um ausreichend Feuchtigkeit zu erhalten.

Verwenden Sie Zangen, um sezieren, trennen Sie das Bindegewebe um einen kleinen Abschnitt der Oberschenkelarterie und Vene. Trennen Sie sorgfältig die Arterie und Vene. Verwenden Sie nun Zangen, um einen Strang der resorbierbaren Naht sowohl unter die Oberschenkelvene als auch unter die Arterie am seitlichsten Punkt des Einschnitts zu fädeln.

Ziehen Sie die Naht auf halbem Weg, so dass die Enden gleichmäßig sind. Verwenden Sie an einem proximalen Punkt der Leistengegend Zangen, um eine zweite Naht nur unter die Femoralvene zu fädeln. Binden Sie vorsichtig einen halben Knoten, der verwendet wird, um den Blutfluss zu begrenzen.

Verwenden Sie an einem Punkt zwischen Strang A und Strang B Zange, um eine dritte Naht nur unter die Femoralvene zu fädeln. Binden Sie vorsichtig einen vollen Knoten, der verwendet wird, um den Blutfluss zu begrenzen. Achten Sie darauf, die Vene nicht zu zerreißen.

Ziehen Sie vorsichtig an Strang B, um den Blutfluss zu begrenzen. Verwenden Sie ein Hämostat, um Strang B sanft zu zerren, um die Blutrestriktion aufrechtzuerhalten. Verbinden Sie nun das nicht geschnittene Ende des PE-Schlauchs mit einer 32-Spur-Nadel und einer ein Millimeter-Spritze, die mit heparinisierter Saline gefüllt ist.

Spülen Sie den Katheter, um Luftblasen zu entfernen. Schneiden Sie ein kleines Loch im eingeschränkten Bereich der Femoralvene mit einer Mikroschere, und legen Sie vorsichtig das abgewinkelte Ende des gespülten PE-Achtschlauchs in Richtung Strang B ein. Sobald Sie eingesetzt sind, lösen Sie die Spannung des Strangs B aus und führen Sie den Katheter weiter nach oben. Ziehen Sie Strang B um die Vene, die den Katheter enthält, an.

Mit Strang C, binden Sie einen zusätzlichen Knoten um den Katheter. Stellen Sie sicher, dass dieser Knoten die Femoralarterie nicht erfasst. Ziehen Sie den Spritzenlauf vorsichtig zurück, um den Schlauch teilweise mit Blut zu füllen, um sicherzustellen, dass der Katheter ordnungsgemäß implantiert wurde, bevor Sie einen PE 10-Katheter mit dem gleichen Verfahren in die linke Oberschenkelarterie einsetzen.

Sobald sowohl die Femoralvene als auch die Arterienkatheter gesichert sind, binden Sie Strang A in einen Knoten um beide Katheter. Nach dem Schneiden aller überschüssigen Nähte und entfernen Sie Hauthaken, spülen Sie den arteriellen Katheter mit heparinisierter Saline, um Gerinnung zu verhindern. Kauterisieren Sie die Enden beider Katheter, um eine Dichtung zu erzeugen.

Legen Sie die Maus in die anfällige Position und machen Sie einen kleinen Schnitt an der Basis des Halses, der Diestrandlinie auf den exponierten Bereich aufwendet. Legen Sie einen hohlen Metallstab subdermal vom Halsschnitt bis zum Oberschenkelschnitt ein. Schlangen Sie die Katheter durch die Hohlstange und aus dem Halsschnitt heraus.

Nach dem Entfernen der Hohlstange, schließen Sie den Oberschenkelschnitt mit Naht gefolgt von postchirurgischer Analgesie. Schlängeln Sie die Katheter durch ein 30 Zentimeter flexibles Hohlrohr, um die Feder tether zu machen, bevor Sie den Knopf des Federtethers unter der Haut, gefolgt von postchirurgischer Analgesie, nähen. Bewegen Sie die Maus in einen klaren zylindrischen Behälter mit einer Schwenkhalterung und Arm, um die Maus während der Erholungsphase zu beherbergen.

Legen Sie einen Handwärmer unter den Behälter, um die Maus warm zu halten. Stellen Sie sicher, dass sich die Maus zu Beginn des Experiments in einem normalen physiologischen Zustand befindet, indem Sie Proben nehmen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um den Tracer intravenös zu verabreichen, verwenden Sie einen Y-Stecker mit einer Spritze, die den mit einem Arm verbundenen C 14-Etikette leucin und eine Spritze mit 100 bis 200 Mikroliter steriler Saline enthält, um die venöse Linie, die mit dem anderen Arm verbunden ist, zu spülen.

Schließen Sie den Y-Anschluss an die Venenleitung an. Initiieren Sie die Studie, indem Sie gleichzeitig eine Stoppuhr starten, den Tracer injizieren und zeitgleiche arterielle Blutproben sammeln. Spülen Sie die venöse Linie mit Saline unmittelbar nach der Injektion.

Sammeln Sie Blutproben eins bis sieben kontinuierlich während der ersten zwei Minuten des Experiments in der gleichen Weise. Nach dem Sammeln der sieben Proben, sammeln Sie 30 Mikroliter Totraumblut vor jeder verbleibenden Probe. Die Proben acht bis 14 werden in drei, fünf, zehn, 15, 30, 45 und 60 Minuten gesammelt.

Zu einem bestimmten Zeitpunkt während des Experiments werden drei Röhren für interne Normen verarbeitet, die tritiiertes Leucin und Norucin enthalten, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Plasmaleucinkonzentrationen zu quantifizieren, verwenden Sie ein HPLC-System mit einer Natriumkationenaustauschsäule und einer Post-Säulen-Derivatisierung mit Orthophthalaldehyd und mehlometrischem Nachweis. Die Fläche unter der Leucin-Kurve ist proportional zur Konzentration von Leucin in der Probe.

Verwenden Sie den Vergleich mit Normen, um die Leucinkonzentrationen in den Proben zu quantifizieren. Verwenden Sie dann einen flüssigen Szintillationszähler, um Disintegrationen pro Minute Tritium und C 14 in den Plasmaproben zu quantifizieren. Verwenden Sie diese Konzentrationen, um die Clearance-Kurve von C 14 mit Leucin aus der Zirkulation und dem Zeitlichen Verlauf seiner spezifischen Aktivität im arteriellen Plasma zu konstruieren.

Berechnen Sie aus der Grafik die integrierte C 14-markierte Leucin-spezifische Aktivität im arteriellen Plasma. Um quantitative Autoradiographie durchzuführen, bereiten Sie Gehirnabschnitte 20 Mikrometer dicke. Schnitt Gehirn mittels eines Kryostats bei minus 20 Grad Celsius.

Tauen Montieren Abschnitte auf Gelatine beschichteten Rutschen. Nach der Fixierung von Dias, arrangieren Dias in einer Röntgenfilmkassette zusammen mit einem Satz von zuvor kalibrierten C 14 markierten Methylmethacrylat-Standards. In einem dunklen Raum und unter sicherem Licht, legen Sie ein Stück Röntgenfilm, Emulsion-Seite nach unten über die Seiten und Standards.

Verschließen Sie die Kassette und legen Sie sie in eine schwarze Wechseltasche. Entwickeln Sie die Folien gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die automatisierte Filmentwicklung wird nicht empfohlen, da der Hintergrund ungleichmäßig sein kann und die Quantifizierung beeinflussen kann.

Konstruieren Sie eine Kalibrierkurve der optischen Dichte im Vergleich zur Konzentration von Gewebe C 14 auf der Grundlage der optischen Dichtewerte des Satzes kalibrierter Standards auf dem Film. Passen Sie diese Daten an eine Polynomgleichung an. Entweder eine Polynomgleichung zweiten oder dritten Grades passt sehr gut.

Um bestimmte Hirnregionen zu analysieren, lokalisieren Sie die Region von Interesse oder ROI in sechs bis acht Abschnitten im Vergleich zu einem Hirnatlas. Zeichnen Sie die optische Dichte der Pixel innerhalb eines ROI in allen Abschnitten auf. Berechnen Sie auf der Grundlage der Kalibrierkurve die Gewebe-C 14-Konzentration in jedem Pixel.

Schließlich berechnen Sie die regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese aus der durchschnittlichen Gewebe-C14-Konzentration im ROI im Integral der Verhältnisse der arteriellen Plasmakonzentrationen von unbeschrifteten und markierten Leucin enden manchmal t und Lamba. Der Anteil von Leucin im Gewebevorläuferpool, der aus dem Plasma stammt. Hier sind repräsentative Bilder von einem mit Fahrzeugen behandelten Tier im Vergleich zu einem Tier, das mit Anisomycin, einem Inhibitor der Proteinsynthese, behandelt wird.

Die Raten der Proteinsynthese sind proportional zum Dunkelgrad im Bild. Anisomycin reduziert drastisch die gemessenen Raten der Proteinsynthese des Gehirns, was auf die Spezifität dieser Methode hinweist. Hier werden digitalisierte Autoradiogramme von einer wachen Benehmensmaus auf der Ebene des Hippocampus und des Hypothalamus gezeigt.

Die dunkleren Regionen weisen höhere regionale Raten der zerebralen Proteinsynthese auf. Hier ist ein digitalisiertes Autoradiogramm von einer wacheverhaltenden Kontrollmaus auf Höhe des dorsalen Hippocampus zu sehen. Die Raten der zerebralen Proteinsynthese sind in den Bildern entsprechend dem Farbbalken farblich beschichtet.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sicherzustellen, dass sich die Tiere während der Messungen in einem normalen physiologischen Zustand befinden. Unsere Methodik hat bereits eine Desregulation der Proteinsynthese bei neuroentwicklungsbedingten Störungen wie dem Fragile X-Syndrom gezeigt. Es kann auch ein nützlicher Marker für degenerative Veränderungen und Bedingungen wie Alzheimer-Krankheit sein.

Die Proteinsynthesemethode kann in Verbindung mit der Immunhistochemie in wechselnden Abschnitten verwendet werden, um Veränderungen in der Proteinsynthese mit regionalen Veränderungen in bestimmten Proteinen zu korrelieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die quantitative autoradiografische L-1 C 14 Leucin-Methode ideal für die genaue Bestimmung der regionalen Raten der Proteinsynthese in vivo ist. Es bietet erhebliche Vorteile in Bezug auf Genauigkeit und seine Anwendbarkeit auf in vivo Bedingungen.