Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung
16. Februar 2018
Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine hochreine Population von Mikroglia aus Nagetieren zu isolieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neuroinformation zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung der immunmodulatorischen Eigenschaften von Stammzellen auf Mikroglia oder die Durchführung von Wirkstoff-Screening-Assays. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Isolierung einer hochreinen Population von Mikroglia, ohne dass eine längere Zeit in Kultur erforderlich ist.
Um diesen Vorgang zu beginnen, führen Sie die Spitzen der Schere durch die Öffnung im Wirbelkanal und machen Sie seitliche Schnitte in den Gehörgang. Schieben Sie dann das Gewebe vorsichtig in Richtung Rostrum, um den Schädel freizulegen. Machen Sie als nächstes einen Schnitt entlang der sagittalen Naht in Richtung des Bregmas.
Führen Sie dann die Spitze der Schere in das Bregma ein und machen Sie seitliche Schnitte. Schälen Sie anschließend vorsichtig den Schädel ab, um das Gehirn freizulegen. Entfernen Sie es mit einer gebogenen Pinzette und geben Sie es in einen sterilen Fünf-Milliliter-Behälter.
Waschen Sie es zwei- bis dreimal mit fünf Millilitern eiskaltem Waschmittel pro Waschgang, um das Blut zu entfernen. Legen Sie den Inhalt des Fünf-Milliliter-Behälters in eine kleine Petrischale, die auf Eis ruht. Entfernen Sie mit einer sterilen Skalpellklinge oder einer sterilen Schere das Kleinhirn und den Riechkolben.
Machen Sie dann einen Mittellinienschnitt, um die beiden Hemisphären zu trennen. Identifizieren Sie anschließend die Hirnhautschicht als eine sehr dünne Zellschicht mit einem roten Schimmer auf der Oberfläche des Gehirns mit sichtbaren Blutgefäßen. Ziehen Sie die Hirnhautschicht vorsichtig mit einer feinen Pinzette ab und achten Sie darauf, die Kortikalen nicht zu beschädigen.
Wenn die Hirnhautschicht aufbricht, schälen Sie die abgerissenen Fragmente weiter ab, bis sie vollständig entfernt ist. Übertragen Sie dann die Halbkugeln in eine neue kleine Petrischale auf Eis und füllen Sie sie mit Waschmedien. Schneiden Sie das Gehirn mit einer sterilen Skalpellklinge in kleine Stücke.
Anschließend werden 100 Mikroliter Papain und 150 Mikroliter DNase1 in das Medium gegeben und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach der Verdauung zerreiben Sie das Gewebe mit einer P1000-Pipette. Wenn die Gewebestücke zu groß sind, um in die Pipette eingeführt zu werden, sollten Sie eine sterile Schere verwenden, um die Pipettenspitze zu erweitern.
Achten Sie während dieses Prozesses darauf, keine Blasen in das Medium einzuführen, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen kann. Bereiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube ein konisches 50-Milliliter-Rohr mit einem 100-Mikrometer-Zellensieb vor. Gießen Sie das Verdauungsmedium und die Gehirnteile auf das Sieb.
Schieben Sie die Gehirnstücke mit dem Kolben einer sterilen Drei-Milliliter-Spritze in einer mahlenden Bewegung durch, bis kein Gewebe mehr sichtbar ist. Waschen Sie den Filter während des gesamten Vorgangs kontinuierlich mit dem Waschmedium. Dadurch werden alle im Sieb eingeschlossenen Zellen durchspült.
Danach zentrifugieren Sie die einzellige Suspension bei 500 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie dann das isotonische Percoll vor, indem Sie das Verhältnis von neun zu eins aus dem Dichtegradientenmedium zu 10x sterilem HBSS hinzufügen. Bereiten Sie Gradienten als 30 % SIP in DMEM und 70 % SIP in one-X HBSS vor.
Um beispielsweise 10 Milliliter 30%SIP zuzubereiten, fügen Sie drei Milliliter SIP zu sieben Millilitern DMEM hinzu. Als nächstes aspirieren Sie den Überstand aus dem konischen Rohr und suspendieren das Zellpellet mit acht Millilitern 30 % SIP in DMEM erneut. Übertragen Sie das volle Volumen in ein frisches konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Unterlegen Sie anschließend die 70%ige SIP-Lösung, indem Sie eine Transferpipette mit 70%SIP füllen und schieben Sie die Transferpipette vorsichtig durch den Boden des konischen Röhrchens. Sobald sich die Spitze nahe am Boden befindet, schieben Sie den Inhalt vorsichtig durch die Transferpipette. Anschließend zentrifugieren Sie die SIP-Schichten einschließlich der Zellen bei 650 G mit Bremsnull und Beschleunigung vier für 25 Minuten bei Raumtemperatur.
Die Schicht aus 70% Percoll muss mit großer Sorgfalt unterlegt werden. Eine Störung dieser Grenzfläche kann das Einfangen der Mikroglia in der Zellschicht stark beeinträchtigen und die Erträge stark reduzieren. Aspirieren Sie dann vier Milliliter des Mediums mit Zelltrümmern von der Oberseite des Röhrchens, um die Entnahme mononukleärer Zellen im folgenden Schritt zu erleichtern.
Senken Sie anschließend die Pipettenspitze vorsichtig in Richtung Grenzfläche ab und isolieren Sie die mononukleären Zellen von der 30/70-Dichtegradienten-Mediumgrenzfläche. Sammeln Sie etwa drei Milliliter von der trüben Grenzfläche und geben Sie sie in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Verdünnen Sie anschließend die Mischung mit neun Millilitern HBSS, um die Entfernung des Dichtegradientenmediums zu erleichtern.
Die Grenzfläche mit verdünntem Dichtegradientenmedium, die die mononukleären Zellen enthält, wird fünf Minuten lang bei 500 G zentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn mit einem Milliliter Wachstumsmedium. Anschließend färben Sie die resuspendierten Zellen mit Trypanblau und führen eine Zellzählung mit einem Hämozytometer durch.
In diesem Schritt zentrifugieren Sie die gesammelten mononukleären Zellen bei 300 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um das Wachstumsmedium zu entfernen, da dies die magnetische Isolierung beeinträchtigt. Unter Verwendung der gleichen Zellzahl, die zuvor erhalten wurde, resuspendieren Sie einmal 10 bis acht kernhaltige Zellen pro Milliliter in PBS, die 2 % FBS und ein millimolares EDTA enthalten, innerhalb eines Volumenbereichs von 0,1 bis 2,5 Millilitern. Geben Sie als Nächstes das gesamte Volumen der kernhaltigen Zellen in PBS in ein frisches Fünf-Milliliter-Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden.
Fügen Sie dann 50 Mikroliter CD11b PE-Markierungsreagenz pro Milliliter Probe hinzu. Inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt. Fügen Sie danach 70 Mikroliter Selection Cocktail pro Milliliter Probe hinzu.
Inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt. Mischen Sie anschließend die magnetischen Partikel, indem Sie mehr als fünfmal auf und ab pipettieren. Geben Sie 50 Mikroliter pro Milliliter in die Probe und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt.
Wenn das Gesamtvolumen der Zellmischung weniger als 2,5 Milliliter beträgt, füllen Sie auf dieses Volumen mit PBS auf, das 2 % FBS und ein millimolares EDTA enthält, und mischen Sie durch vorsichtiges zwei- bis dreimaliges Pipettieren. Setzen Sie dann das Röhrchen in den Magneten ein und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Drehen Sie den Magneten, der das Rohr enthält, in einer kontinuierlichen Bewegung für zwei bis drei Sekunden vollständig um, um den Überstand abzugießen.
Bringen Sie den Magneten wieder in eine aufrechte Position und entfernen Sie das Rohr vom Magneten. Waschen Sie anschließend die restlichen Zellen aus der Säule, indem Sie die Vorgänge wiederholen. Suspendieren Sie die Zellen in einem gewünschten Wachstumsmedium.
Spülen Sie die Seite des Auffanggefäßes, um Zellen von den Seiten des Röhrchens zu sammeln und die Ausbeute zu maximieren. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, behalten die isolierten primären Mikroglia ihren kugelförmigen Zellkörper und ihre ausgeprägte verzweigte Struktur bei. Hier sind die repräsentativen Faktendiagramme der isolierten Mikroglia.
Die kombinierte Färbung von Annexin V und Propidiumiodid ermöglicht die Kategorisierung von apoptotischen, nekrotischen oder lebenden Zellen nach Stimulation mit LPS. hAEC-konditioniertes Medium reduzierte die Apoptose der Mikroglia signifikant im Vergleich zu Kontrollen, was auf eine Form des Schutzes für diesen Zelltyp hindeutet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs bis acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Bei dieser Methode ist es wichtig, beim Schichten des Percolls große Sorgfalt walten zu lassen, da dieser Schritt den größten Einfluss auf die Erträge hat. Nach dieser Technik können andere Verfahren wie der phagozytäre Funktionstest oder die Co-Kultur mit Neuronen verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu den immunmodulatorischen Eigenschaften des von Ihnen gewählten Zelltyps an primären Mikroglia zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf diesem Gebiet, um herauszufinden, wie primäre Mikroglia bei perinatalen Hirnverletzungen moduliert werden können.
Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie und Diagnose perinataler Hirnverletzungen, da sie die Charakterisierung eines primären Immunzelltyps ermöglicht, von dem bekannt ist, dass er an Neuroinformation beteiligt ist, die zu motorischer und kognitiver Dysfunktion führt. Obwohl diese Methode Einblicke in motorische Störungen wie Zerebralparese geben kann, kann sie auch bei anderen Erkrankungen angewendet werden, bei denen Mikroglia eine Rolle bei der Pathogenese spielen, wie z. B. bei der Alzheimer-Krankheit. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir eine Technik zur schnellen Charakterisierung von Mikroglia suchten, die mögliche epigenetische Veränderungen nach längerer Zeit in Kultur umgeht.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochreine Populationen von Mikroglia für die nachgelagerte Charakterisierung isoliert
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Übersicht
Dieser Artikel präsentiert ein detailliertes Protokoll zur Isolierung primärer Mikroglia aus murinen Gehirnen, welches unser Verständnis neurologischer Erkrankungen verbessert. Die Methode integriert Dichtegradientenzentrifugation und magnetische Trennung, um effizient hochreine Mikroglia-Proben zu erzielen. Wichtige Schritte zur Zellcharakterisierung werden ebenfalls beschrieben.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Immunologie
Hintergrund
- Mikroglia spielen kritische Rollen im Nervensystem und ihre Isolierung ist wesentlich für die Untersuchung ihrer Funktionen.
- Dieses Protokoll hilft, wichtige Fragen bezüglich mikroglialen Verhaltens und ihrer Interaktionen mit anderen Zelltypen zu beantworten.
- Hochreine Mikroglia sind entscheidend für genaue experimentelle Ergebnisse in der neurologischen Forschung.
- Das Protokoll minimiert die Notwendigkeit für lange Kulturzeiten und erleichtert die sofortige Verwendung frisch isolierter Zellen.
Zweck der Studie
- Ein robustes Protokoll für die Isolierung reiner mikroglialer Zellen aus Nagetiergehirnen zu entwickeln.
- Das Verständnis der Rolle von Mikroglia bei Neuroinflammation und anderen neurologischen Störungen zu verbessern.
- Downstream-Anwendungen wie Medikamentenscreening und Immunmodulationsstudien zu ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Ex-vivo-Isolierung von Gehirngewebe gefolgt von mechanischer und enzymatischer Verdauung.
- Das biologische Modell besteht aus murinen Gehirnen für die mikrogliale Isolierung.
- Die Methoden umfassen Dichtegradientenzentrifugation und magnetische Trennung.
- Wichtige Schritte beinhalten sorgfältige Gewebehandhabung und spezifische Inkubationsbedingungen, um eine hohe Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten.
- Hochpräzise Techniken zur Isolierung und Charakterisierung von Zellen wurden im gesamten Protokoll betont.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll liefert erfolgreich eine hochreine Population von Mikroglia, die für die Analyse bereit ist.
- Isolierte Mikroglia können für verschiedene Assays verwendet werden und liefern Einblicke in ihre funktionellen Eigenschaften und Reaktionen.
- Die Methode ermöglicht schnellen Zugang zu frisch isolierten Zellen, was für unmittelbare experimentelle Bedürfnisse entscheidend ist.
- Die Robustheit des Protokolls wurde hervorgehoben und gewährleistet reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse über verschiedene Experimente hinweg.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie ermöglicht es Forschern, mikrogliale Zellen leicht zu isolieren und so ein tieferes Verständnis ihrer Rolle bei Gesundheit und Krankheit zu erleichtern.
- Die beschriebenen Techniken legen eine Grundlage für weitere Untersuchungen von neuroinflammatorischen Prozessen und assoziierten Therapien.
- Die durch diese Methode gewonnenen Erkenntnisse können das Wissen über mikrogliale Funktionen und deren Implikationen in der neurologischen Forschung voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Rapid isolation and characterization of primary mouse microglia enables high-fidelity modeling of neuroinflammatory mechanisms in early discovery and preclinical research. This protocol delivers high-purity microglial populations without extended culture, supporting robust target validation and functional screening in CNS drug discovery. The approach enhances predictive confidence for neuroimmune modulation strategies and accelerates translational insights into neurodegenerative and neurodevelopmental disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial activation states and polarization in disease-relevant contexts.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary cells for functional assays and pathway analysis.
- Facilitates rapid hypothesis testing on microglial responses to candidate therapeutics or environmental stimuli.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for quantitative in vitro assays, including drug screening and immunomodulation studies.
- Reduces variability and artifacts associated with prolonged culture, improving assay reproducibility and standardization.
- Enables scalable preparation of microglial samples for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neuroinflammation, perinatal brain injury, and neurodegeneration.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional and phenotypic characterization of microglia.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers and therapeutic modulation of microglial activity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-purity microglia for target validation, mechanistic studies, and functional screening.
- Discovery Biology: Delivers primary microglia for hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways and cell-type specific responses.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and immunomodulatory profiling.
- Analytics: Enables robust measurement of cell viability, apoptosis, and functional phenotypes post-stimulation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models for neuroinflammatory and neurodegenerative conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for microglial isolation applicable across CNS research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and functional de-risking.
- Operational Value: Streamlines microglial preparation, reducing time and resource requirements for assay development.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reproducible functional data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS programs targeting microglial modulation.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in tissue dissection, density gradient centrifugation, and magnetic cell separation.
- Demands access to specialized instrumentation for gradient preparation and cell sorting.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for different species or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to procedural precision, particularly during gradient layering and cell collection.
