Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

Das übergeordnete Ziel dieses Modells zur sensorischen Schädigung von Drosophila-Larven ist es, in vivo Live-Bildgebung, Zwei-Photonen-Laser-Axotomie/Dendriotomie und den leistungsstarken genetischen Werkzeugkasten der Fliege zu einer Plattform für das Screening potenzieller Promotoren und Inhibitoren der Neuroregeneration zu kombinieren. Diese Methode wird dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neurogeneration zu beantworten, z. B. durch die Identifizierung neuer intrinsischer und extrinsischer Regulatoren für die Neurogeneration, sowohl in einem peripheren als auch in einem zentralen Nervensystem. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass neuartige Kandidaten für die Neuroregeneration auf einfache, schnelle und kostengünstige Weise gescreent werden können.

Obwohl dieses System Einblicke in die Neuroregeneration geben kann, kann es auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. neurodegenerative Erkrankungen und Neuron-Glia-Interaktionen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da unterschiedliche Versuchsaufbauten, die unterschiedliche Arten von Neuronen verwenden, verwendet werden, um die Axon- und dendritische Regeneration zu modellieren. Bereiten Sie für die Larvensammlung die Kulturflaschen wie folgt vor.

Stanze mit einer Klinge ein 1,5 Zentimeter großes Loch in eine Wand einer Drosophila-Kulturflasche und fülle das Loch mit einem Wattebausch zur Belüftung. Geben Sie dann einen Klecks Hefepaste auf eine Traubensaft-Agar-Platte und verschließen Sie mit der Platte die Hauptöffnung der Flasche. In eine solche Flasche setzst du eine Kreuzung aus 10 jungfräulichen Weibchen und fünf Männchen auf und wechselst die Platte täglich, während du bei 25 Grad Celsius kultivierst.

Kultivieren Sie die gesammelten Platten mit einem feuchten, in milder Propionsäure getränkten Tuch, um eine Kontamination zu vermeiden. Von den kultivierten Platten werden die Larven im erforderlichen Stadium mit einer Pinzette geerntet. Setzen Sie die gepflückten Larven vorsichtig auf eine neue Traubensaft-Agarplatte ohne Hefepaste um.

Nachdem sie sich durch Herumkriechen gereinigt haben, können sie abgebildet werden. Um jede Bildgebungssitzung zu starten, schalten Sie die Bildgebungslaser und das Mikroskop ein. Verwenden Sie für die Verletzung ein Zwei-Photonen-Mikroskop.

Stellen Sie in der Bildgebungssoftware den Laser so ein, dass er GFP bei 930 Nanometern mit einer maximalen Leistung von 1950 Milliwatt betrachtet. Wählen Sie den Zeilenscan-Modus und öffnen Sie die Lochblende vollständig. Erhöhen Sie dann die Laserintensität auf etwa 20 % der vollen Leistung, um eine PNS-Verletzung zu verursachen, oder auf 50 % bis 100 % der vollen Leistung, um eine VNC-Verletzung zu verursachen.

Wählen Sie als Nächstes einen Rahmen mit 512 quadratischen Pixeln für den Scanvorgang aus und verwenden Sie die höchstmögliche Scangeschwindigkeit. Verwenden Sie eine durchschnittliche Anzahl von eins und eine Bittiefe von acht Bits. Stellen Sie dann die Verstärkung auf etwa 750 und den Offset auf Null ein.

Speichern Sie nun dieses voreingestellte Versuchsprotokoll als 2P GFP 930 Ablation, um eine einfache Wiederverwendung in weiteren Experimenten zu ermöglichen. Verwenden Sie für die Bildgebung nach Verletzungen ein konfokales Mikroskop. Zuerst wurde der Argonlaser auf 488 Nanometer aufgestellt.

Wählen Sie die Registerkarte Erfassung und dann Z-Stapel aus. Schalten Sie unter Laser den 488-Nanometer-Argonlaser ein. Gehen Sie als Nächstes zu Kanäle, wählen Sie den 488-Nanometer-Laser aus und erhöhen Sie die Laserleistung auf fünf bis 10 %. Verwenden Sie für die Lochblende die Option für ein bis zwei Flächeneinheiten.

Stellen Sie dann die Verstärkung auf 650 ein. Wählen Sie nun im Aufnahmemodus die 1024 quadratischen Pixel als Frame-Scan aus. Verwenden Sie die maximale Scangeschwindigkeit.

Verwenden Sie eine durchschnittliche Anzahl von zwei und eine Bittiefe von acht Bits. Speichern Sie dieses präexperimentelle Protokoll als GFP Imaging. Beginnen Sie mit der Betäubung der Larven.

Stellen Sie in einem Abzug eine 60-Millimeter-Glasschale in eine 15 Zentimeter große Petrischale aus Kunststoff. Falten Sie dann ein Stück Seidenpapier und legen Sie es in die Glasschale. Legen Sie die Trauben-Agar-Platte auf das Gewebe, nachdem der Diethylether hinzugefügt wurde.

Geben Sie dann einen Tropfen Halocarbon 27-Öl in die Mitte und geben Sie einen Fleck Vakuumfett auf jede der vier Ecken. Übertragen Sie dann mit einer Pinzette eine Larve auf die Agarplatte und decken Sie die Glasschale ab, um die Larve zu betäuben. Sobald sich die Larve nicht mehr bewegt, übertragen Sie sie vorsichtig mit aufrechtem Kopf in das Halogenkohlenwasserstofföl.

Legen Sie dann einen Deckzettel über den Objektträger und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, bis er die Larve berührt. Schieben Sie dann mit sanfter Kraft den Deckglas, um die abzutragenden Zellen an die Stelle zu rollen, an der der Zwei-Photonen-Laser sie am leichtesten trifft. Die Position variiert je nachdem, welche Neuronen angegriffen werden.

Befestigen Sie nun die Baugruppe auf dem Zwei-Photonen-Mikroskoptisch und fokussieren Sie sich mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv auf die gewünschten Zellen. Wechseln Sie in der Software in den Scan-Modus und laden Sie das gespeicherte Protokoll. Achte darauf, dass die Lochblende ganz geöffnet ist.

Im Live-Modus erhalten Sie dann ein gutes Bild des interessierenden Bereichs. Stoppen Sie als Nächstes den Live-Scan, sodass die Schaltfläche Zuschneiden verfügbar wird. Passen Sie mit der Funktion "Zuschneiden" das Scanfenster so an, dass der Zielbereich nur auf die potenzielle Verletzungsstelle fokussiert wird.

Öffnen Sie dann ein neues Imaging-Fenster. Reduzieren Sie nun die Scangeschwindigkeit und erhöhen Sie die Laserintensität. Schalten Sie dann die Schaltfläche Kontinuierlich um, um den Scan zu starten und zu stoppen.

Beobachten Sie genau. Sobald es zu einer drastischen Zunahme der Blütendichte kommt, beenden Sie den Scan. Wechseln Sie dann zurück zum ursprünglichen Bildfenster, wählen Sie den Live-Modus aus und suchen Sie den Bereich, der gerade durch Anpassen des Fokus anvisiert wurde.

Ein guter Hinweis auf eine erfolgreiche Verletzung ist das Auftreten eines kleinen Kraters, einer ringförmigen Struktur oder lokalisierter Trümmer direkt an der Verletzungsstelle. Wenn die Laserleistung zu hoch war, wird eine große beschädigte Stelle sichtbar, die tödlich sein kann. Entfernen Sie nun vorsichtig das Deckglas und setzen Sie die verletzte Larve auf einen neuen Teller mit Hefepaste um.

Lege den Teller zusammen mit einem mit Propionsäure getränkten Taschentuch in eine 60-Millimeter-Schale. Stellen Sie dann die Platte wieder auf Kulturtemperatur ein. Verwenden Sie für die anschließende Bildgebung der Larve das gespeicherte konfokale Setup und sammeln Sie Z-Stapelbilder mit einem 25-fachen Objektiv.

Achten Sie darauf, den Normalisierungspunkt anzugeben, damit die Regeneration quantifiziert werden kann. Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls wurde die Regeneration von DA-Neuronen der Klassen drei und vier untersucht. Typischerweise waren drei oder vier Neuronen auf der rechten Seite der abdominalen Segmente A7 bis A2 verletzt.

Konkret wurden DDAF-Neuronen der Klasse drei und V Prime ADA der Klasse vier ins Visier genommen. Die Larven wurden 24, 48 und 72 Stunden nach der Verletzung abgebildet. Nach 24 Stunden schlossen die distalen Axone in der Regel die Degeneration ab, und der Axonstamm war gut sichtbar.

Nach 48 Stunden war es möglich, die Regeneration in den DA-Neuronen der Klasse vier zu beurteilen. Etwa 70% dieser Neuronen regenerierten sich außerhalb der Verletzungsstelle. Selbst nach 72 Stunden war klar, dass die DA-Neuronen der dritten Klasse jedoch nicht nachwuchsen.

Dies wurde auf der Grundlage wiederholter Beobachtungen von blockierten Wachstumskegeln bewertet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Experiment einrichten, eine Zwei-Photonen-Verletzung durchführen und die Ergebnisse bewerten. Einmal gemeistert, dauert diese Technik 15 Minuten pro Larve, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das experimentelle Wachstum mit den entsprechenden Kontrollen nebeneinander zu vergleichen. Nach diesem Verfahren kann eine Methode wie die Immunfärbung durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, z. B. ob eine Axonverletzung eine Proteintranslokation verursachen kann, die zu einer Veränderung des Signalwegs führt. Seit ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die Neuroregeneration in sensorischen Neuronen von Drosophila-Larven zu erforschen.

Vergessen Sie schließlich nicht, dass die Arbeit mit Diethylether äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Durchführung einer Larvenanästhesie in einem Abzug.